DE2841374C2 - Antibiotikum BN-200 und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Antibiotikum BN-200 und Verfahren zu dessen Herstellung

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Description

Form und Farbe: weißes Pulver,
Elememaranalyse: C 67,46«, H 7,24«, N 7,55«, O 17,75%
Molekulargewicht: 520; bestimmt durch die Titrationszahl,
Schmelzpunkt: wird bei 150° C braun und zersetzt sich bei 156° C,
Drehung: [a]g> = -70,7 (C = 1, Methanol),
Löslichkeit im Lösungsmittel: Löslich in Methanol, Äthanol, Pyrldln, Dimethylformamid, Aceton und Dimethylsulfoxid.
Unlöslich in Benzol, Äthylacetat, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Petroiather und Wasser,
Farbreaktion; jositiv mit Ferrichlorid, Kaliumpermanganat untf Jod, und negativ mit Ninhydrin. Sakaguchi, Biuret, Fehllng, Molisch und Anthron;
Rf-Werte bei Dünnschichtchromatografie über Kieselgel:
Chloroform-Methanol (9/1) 0,57
Benzol-Äthanol (9: I) 0,47
Benzol - Aceton (1 :1) 0,76.
Es wurde festgestellt, daß In dem Kultivierungsprodukt von Erwinia sp. ATCC 31420 eine Substanz mit einer großen Aktivität gegenüber Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien gewonnen werden kann, und daß man diese Substanz In reiner Form aus dem Kultivierungsprodukt isolieren kann. Die Untersuchung der Eigenschaften der Substanz hat gezeigt, daß es sich hler um ein neues Anltblotlkum handelt, das sich von bekannten Antibiotika unterscheidet. Diese Substanz wurde mit BN-200 bezeichnet.
20
25 Die Erfindung betrifft das Antibiotikum BN-200 mit den folgenden Eigenschaften;
Form und Farbe: weißes Pulver, Elementaranalyse: C 67,46%, H 7,24*. N 7,55«, O 17,75«
Molekulargewicht: 520; bestimmt durch die Titrationszahl,
Schmelzpunkt: wird bei 1500C braun und zersetzt sich bei 156° C,
Drehung: [0$ =-70,7 (C = 1, Methanol),
Ultraviolett-Absorptionsstekrum (In Methanol): wie InFIg. 1,
Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Tabletie): wie in Fig. 2,
Löslichkeit im Lösungsmittel: Löslich in Methanol, Äthanol, Pyrldin, Dimethylformamid, Aceton und Dimenthylsufoxld.
Unlöslich in Benzol, Äthylacetat, Chloroform. Tetrachlorkohlenstoff, Peiroläther und Wasser,
Farbreaktion: positiv mit Ferrichlorid, Kaliumpermanganat und Jod, und negativ mit Ninhydrin, Sakaguchi, Biuret, Fehling, Molisch und Anthron;
Rf-Werte bei Dünnschichtchromagographie über Kieselgel:
Chloroform-Methanol (9:1) 0,57
Benzol-Äthanol (9: I^ 0,47
Benzol-Aceton (1 : 1) 0,76
Fig. 1 ist das Uliraviolett-Absorpiionsstektrum der BN-200-Substanz, bestiramt in Methanol, und
Fig. 2 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum der BN-200-Substanz bei der Verwendung der KBr-Tabletten-Methode.
Erwinia sp. ATCC 31420 ist aus einer verfaulten Pflanze in Hyogo-Prefecture/Japan isoliert worden. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 31420 hinterlegt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften von Erwinia ATCC 314200 sind die folgenden:
(a) Morphologische Eigenschaften
Zellen, die in einem Bouillon-Agar-Medium kultiviert wurden, sind stäbchenförmlg mit einer Größe von 0,5 bis 0,7 χ 0,8 bis 0,5 pm mit perltrichaler Bewegung. Es werden keine Sporen oder Sporangiophoren gebildet, noch besteht Polymorphismus. Die Gram-Färbung und die Säurefestigkeit sind beide negativ.
(b) Kultureigenschaften
(1) Boulllon-Agar-Kultur: Die Bakterienzellen sind gelb-braun und werden zunehmend gelb mit Fortschreiten der Kultivierung. Die Kolonien zeigen ein deutliches schleimartiges Wachstum und scheinen nicht viskos oder beweglich zu sein. Es wird keine Bildung eines dlffundlerbaren Pigmentes bemerkt.
(2) Bouillon-Kultur: Das gesamte Kulturmedium wird trüb.
(3) Boülllön-Gelätine-StäbehenkuHui·· Verflüssigt.
(4) Lackmus-Mllch-Kultur: Peptonlslerung verläuft mit schwacher Alkalinltät.
(c) Physiologische Eigenschaften
(1) Reduktion von Nitrat: negativ
(2) Denltrlerungsreaktion: negativ
(3) MR-(Methylrot) Test: positiv
(4) VP-(Voges Proskauer) Test: negativ
55
, (5) Bildung von Indol: positiv
ft (6) Bildung von Schwefelwasserstoff; negativ
\ ' (7) Hydrolyse von Starke; positiv
(8) Verwertung von Zitronensäure: positiv
(9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: Ammoniumsalze sind die einzigen anorga-
^i nischen Stickstoffquellen, die verwendet wer-
•-i den.
>f (10) Bi'üung von Pigmenten: Die Zellen werden
gelb, aber es wird kein wasserlösliches Pigment
gebildet.
' (11) Urease: negativ
(12) Oxidase: negativ
(13) Wachstumstemperatur: 10 bis 35° C, aber kein Wachstum bei 42° C.
(14) Falkultativ anaerob
(15) OF-Test (Heuleifson-Methode): F-Typ, es wird kein Gas gebildet
(16) Ornithin-Decarboxylierungsreaktion: negativ
(17) Lysin-Decarboxyllerungsreaktion: negativ
(18) KCN-Besiändlgkeit: zeigt Beständigkeit
(19) Verwertung von Malonsäure: negativ
(20) Verwertung von Zucker: verwertet Glucose, Maltose, Xylose, Mannit, Lactose und Saccharose.
■ : Dieser Stamm mit den vorgenannten bakteriologischen
r Eigenschaften wurde verglichen mit Stämmen, die in
Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aus- :■■- gäbe, 1974 aufgeführt waren, und es wurden die folgen-
i; den Schlüsse gezogen:
: Er gehört zur Familie Enterobacteriaceae aufgrund der
Tatsache, daß er ein Gram-negatives stäbchenförmiges Bakterium mit Motilität ist, fakultativ anaerob und oxidase-negativ Ist und kein Gas entwickelt. Der Stamm wurde als zum Genus Erwinia gehörig Identifiziert Im Hinblick auf die Tatsache, daß Zucker verwendet wird, daß eine negative Nitratreduktion vorliegt, daß eine KNC-Beständigkeit vorliegt und daß negative Ornithin- und Lysiii-Decarboxylierungsreaktionen vorliegen.
Melinacidin (Journal of Bacteriology, Oktober 1968, Seiten 1285 bis 1290) unterscheidet sich in einer Reihe von Eigenschaften vom Antibiotikum-BN-200.
Zum Beispiel enthält es Schwefel (s. Seite 1285, linke Spalte), während BN-200 keinen Schwefel enthält.
Die Antimycin-Gruppe hat ein unterschiedliches Ullraviolett-Absorpiionsspektrum und ein unterschiedliches bakteriostatisches Spektrum.
Die Gruppe der A-30912-Antlbiotika (DE-OS 26 43 485) unterscheidet sich von BN-200 durch das Ultraviolett-Absorptionsspektrum. Weiterhin hat A-30912 ein Molekulargewicht von 11 000, während BN-200 ein Molekulargewicht von 520 hai. Außerdem sind das Antibiotikum A-30912-Gemlsch und die einzelnen Faktoren antlfungale Mittel (DE-OS 26 43 484, Seile 8). während BN-200 keine fungizide Wirkung hat.
Die SL-78I0-Gruppe unterscheidet sich von BN-200 durch das Molekulargewicht (SL-7810/F Mol-Gewicht 1190, SL-781O/F-II Mol-Gewicht 1018). Die Ultravioleti-Absorptlonsspekiren sind unterschieden, Außerdem lsi auch die SL-7810/F-Gruppe als Fungizid wirksam, Im Gegensatz zu EtN-200.
Die S-31794/F-GrU[UJe unterscheidet sich von der BN-200-Substanz (lurch Mas Ultravlolett-Absorptionsspektrum und auch durch Mie fungizide Wirkung.
Aufgrund der Verwertung von Kohlehydraten und der weiteren in der BescPeibung der Anmeldung enthalte-
nen Eigenschaften steht der ATCC-31420-Stamm Erwinia herblcola am nächsten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung der Antibiotikum-BN-200-Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß man
a) in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, Erwinia sp. ATCC 31420 bei 20 bis 35° C kultiviert un die gebildete Antibiotikum-BN-200-Substanz aus der Kultur-
brühe dadurch gewinnt, daß man
b) die Fermentationsbrühe zur Entfernung von Feststoffen filtriert, das Filtrat über Diaion HP-IO, Diaion HP-20, Diaion HP-30 oder Amberlite XAD-2 adsorbiert, die aktive Substanz mit alkalischer 70%iger wäßriger Methanol lösung (pH 8 bis 9) eluiert, das Methanol abdestilliert und den Rückstand mit Äthylacetat, Benzol, Chloroform, n-Bulanol oder mit Methylisobutylketon extrahiert, wobei man die rohe Antibiotikum-BN-200-Subsianz erhält, und das Rohprodukt dann dur^r; Dünnschichtehromalopraphieren über Kieselgel unh-r Verwendung von Chloroform-Methanol, Benzul-Äthanol oder Benzol-Aceton reinigt.
Zahlreiche Kulturmedien, wie sie bei üblichen mikrobiologischen Fermentationsverfahren eingesetzt werden, können zur Kultivierung von Erwinia sp. ATCC 31420 verwendet werden, und zur Bildung und zum Ansammeln der BN-200-Substanz. Glucoöe, GUcerin, Saccharose. Dextrin, Stärke und Hirsebrei können beispielsweise als Kohlenstoffquellen dienen. Stickstoffquellen, die man verwenden kann, schließen beispielsweise Peplon, Fleischextrakt, Bouillonpulver, Maisquellwasser, Sojabohnenkuchen, Fischmehl. Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid ein. Anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Calciumcarbonat können erforderlichenfalls zusätzlich verwendet werden. Gewünschtenfalls können Anlischaumtildne- zugegeben werden.
Die verwendeten Adsorbtionsmittel sind: Diaion HΡ-10, Diaion HP-20, Diaion HP-30 oder Amberlite XAD-2. Bei der Dünnschichtchroniatographie kann als Klieselgel Sephadex LH-20 verwendet werden.
Wird das erhaltene pulverige Produkt über Kieselgel
4S dünnschichtchromatographiert unier Verwendung von Chloroform-Methanol, Benzol-Äthanol oder Benzol-Acelon, so findet man bei allen verwendeten Systemen einen einzigen Spot. Dies zeigt, daß das erhaltene pulverige Produkt die BN-200-Substanz in reiner Form darstellt.
Die folgende Verfahrensweise wurde zur Bewertung der BN-200-Substanz angewendet: Eine Mischung aus 2h, Mycinagar und 0,5% Bactoagar wurde als Bewerlungsmed'jri verwendet. Bacillus subtllis ATCC 6633 wurde als zu prüfendes Bakterium verwendet.
Nach der er*'ahnten Bewertungsmetnrde wurde eine lineare Beziehung entwickelt zwischen dem Logarithmus der Konzentration der BN-200-Substanz (reines Produkt) und dem Durchmesser der Inhibierurigszone bei einer Konzentration der BN-200-Substanz im Bereich von 31 meg/ml bis lOOmcg/ml, wobei der Durchmesser der Inhlblerungszone im Bereich von 22.5 mm bis 30,3 mm (Papierscheibenmethode) lag.
Es wurde die Antimlkrobenwirkung der BN-200-Substan? gegen verschiedene Mikroorganismen gemessen,
6S und die minimale Wachstumslnhlblerungskonzentration (MIC) der BN-200-Substanz gegen verschiedene Mikroorganismin wird In Tabelle I gezeigt.
Tabelle 1 Minimale Wachstumsinhibierungs-Konzentration
(Flüssigkeitsverteilungs-Methode)
Geprüfter Mikroorganismus
Minimale Wachs- Kulturlumsinhibierungs- medium Konzentration (mcg/ml)
Bacirlus subtilis 0.7 I
(ATCC 66331
Bacillus 0." I
*;earothermophilis
Bacillus subtilis (L-V-34) 3.2 I '*
Staphylococcus 1.5 1
aureiis 209 P
Staphyiococcus auretis i.5 i
52-34. Tetracyclin- und E r> trh'imyci η-beständig
Sarcma lutea > 100 1
Escherichia coli NIHJ 6.5 I
Escherichia coli K;;R 6.5 I
I'seudomonas aeruginosa 100 1
K1 ebs 1 e 11 a pneumoniae 100 1
Proteus vulgaris 0.3 1
Microbacterium > 100 2
^.legniatis.
Kanamycin-beständig
Microbacterium > 100 2
Sireptomycin-besiandig
Candida alhicans 100 3
Bemerkung· Kulturmedium
1 ist ein Bouillon-Medium
2 ist ein Glycerin-Bouillon-Medium
3 ist ein Glucose-Pepton-Medium
30
35
- den Ergebnissen der Tabelle I wird ersichtlich. J:e B\-2')fj-Substanz als Medikament für humanvste-inärmedizinische Zwecke verwendet werden
akute Toxizität der BN-200-Substanz wurde intrar.ea! bei Mäusen bestimmt, wobei die Mäuse eine e be- ächtet wurden. Alle Mäuse überlebten bei Dosis '.on 100 mg/gk
BN-20-O-S'jbstanz gemäß der Erfindung kann in ■?- Dosis ν - etwa 20 bis etwa 300 mg/kg Körperge- :.·-■ entweder intramuskulär, subkutan, intravenös oder "s.: verabre:.h: werden.
in !en Beispielen wird ein Verfahren zur Herstellung ;· BN-iOO-Sub'unz in ausführlicher Form gezeigt.
Beispie! 1 M
■'■ :v sines flüssigen Kulturmediums aus 2*. Glycen 1.5- Pepton. ' .0'*, Fleischextrakt. 0.3-, KCI und j- CjCOi wurden jeweils in 25 500-mi-Kolben gege- :-.-i -.'.:'. die Kolben wurden mit einem Baumwollpropfen jTie!;: ,sen. Jeder der Kolben und der Inhalt wurden j Mn. unter Druck bei 120" C sterilisier!. Jedes Kultur- -;■ ..πι wurde mit einer PUtinspitze einer Schrägkultur ·■- !-!rwir.in so ATCC 31 -i20 inokuliert und die Kulti- vierung wurde unter Schütteln bei 28' C wahrend 20 Ii durchgeführt. Man erhielt auf diese Weise 2.4 I einer Kulturbrühe mit einer Wirksamkeil von 20 meg/ml.
Die Bakterienzellen wurden mittels einer Zentrifuge mit einer Umdrehung von 10 000 pro Min entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine SiUiIc gegeben, die mit 200 ml Dlalon HP-20 gefüllt war. um den aktiven Bestandteil zu adsorbieren. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und weiterhin mit angesäuerter 50%iber wäßriger Meihanollösung (eingestellt auf einen pll von 2 mit fm UCI). und dann mit einer alkalischen 80,i....-n wäßrigen Meihanol-I umimu (eingestellt auf einen pH {> mil fin NoOIIi /um I mim'■ ■ iο re η des aktiven Bestandteils behandelt. I'■·.· I r.iMi. .;, mit einer anlimikrobiellcn \ktiviuit wurden gciamme1:. mit 6n Chlorwasserstolfsäure neutralisiert und unter \cimindertem Druck aiii 200 ml konzentriert Das Konzentrat wurde mit In ChlorwasserstolNäure aut pH 2.0 eingestellt und dann mit 200 ml Benzol extrahiert l)jr Extrakt wurde mit Wasser gew.imIicii. über wassertrei·.1·- Natriumsulfat getrocknet und konzentriert unter vermindertem Druck, wobei man ein siruposes Produkt erlnei' Das sirupöse Produkt wurde durch eine Säule (300 mm ■? χ 800 mm) Sephade\ 111-20 i5H()ml> eingestellt mit Methanol, gegeben und dann mit Metha-ioi (500 ml) en'.wickelt unter Ausbildung einer Gelli'traMmi. wobei man P bis 24 aktive Fraktinne-i (20 ml in i-de: Fraktion) erhielt.
Die Fraktionen mit einer aiitimikrohiellen \ktiMtiit wurden gesammelt, unter vermindertem Druck zui Trockne konzentriert, wobei man I^ me der BN-2(i(i-Suhstanz als weißes Pulver erhielt.
Beispiel 2
In einem 30-l-Fermentaiionstanu wurden 20 1 eines Kulturmediums aus 2 Ghcerin und 3 BouillonpuKer gegeben und das ganze wurde 15 Min. hei 120 C sterilisiert und dann gekühlt Das Kulturmedium :·ι Ferm:"itationstank wurde mit Erwinia sp ATCC 31 ^1" iniA > liert und 20 h in einem Kolben, welcher das s: .itive Kulturmedium wie vorher angegeben enthielt. w>rku!;iviert und die Kultivierung wurde dann unter Rühren ur-ci Belüftung bei 28r C mit einer Rührgeschwindigkeit v-.'n 200 L'pM während S h bei einer I.uftfließgeschwindigke · von 20 l/Min durchgeführt. Man erhielt <·.> 18 1 eine: Kulturbrühe mit einer Aktivität von 10 meg''ml.
Zu der Kulturbrühe wurden 1.5! Diaion HP-20 :■/-. Adsorptionsharz gegeben und der Ansatz wurde 15 Min. zum Absorbieren der aktiven Bestandteile gerührt. Nach der Absorption wurde das Diaiun HP-20 entfernt, d-■ Harz, welches den aktiven Bestandteil daran adsorbier; enthielt, wurde ausreichend mit Wasser gewaschen und dann mit einer 50c:*-igen wäßrigen Meihanollösung. die mit 6 η HCl auf pH 2 eingestell". v·. ^rde-i »?.·. :;nd d3nn mit einer 70 igen wäßrigen Met.".:nol!ösung. die mit 6n NaOH auf pH 9.0 eingeteilt -.vorder, war. eluier;
Fraktionen mit einer antimikrobieüen Altiv'tri- -'-urden gesammelt und mit 6n Chlorwasserstoffs.;.ire b:s zum pH
neutralisiert. Die neutralisierte Flüssigkeit wurde auf 1 I unter vermindertem Durck konzentriert, mit ;n Chlorwasserstoffsäure auf pH 2.0 eingestellt und mit ! i Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Athyiacetai w.jrde unter Gewinnung eines sirupösen Produktes abdestiliiert. Der Sirup wurde in Methanol ί 10 mi j geiüsl und die Lösung wurde durch eine Säule (30 mm Z χ 800 mm) Sephadsx LH-20 (500 ml). eingestellt mit Methanol, gegeben und mit Methanol (500 ml) entwickelt, wobei man 1" bis 24
.ikthf l'raktionnn (20 nil in jeder Fraktion) erhielt. Fraktionen mit einer antimlkroblellen Aktivität wurden gesammelt und konzentriert unter vermindertem Druck bis zur Trockne, wobei man 70 mg der BN-200-Substanz als wellies Pulver erhielt.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. 2. Verfahren zur Gewinnung der Antibiotium-BN-200-Substanz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) in einem Kulturmedium, daß a&jfmilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, Erwinia sp. ATCC31420 bei 20 bis 35° C kultiviert und die gebildete Antibiotikum-BN-200-Substanz aus der Kuiturbrühe dadurch gewinnt, daß man
    b) die Fermentationsbrühe zur Entfernung von Feststoffen filtriert, das Flltrat über Diaion HP-10, Diaion HP-20, Diaion HP-30 oder Amberlite XAD-2 adsorbiert, die aktive Substanz mit alkalischer 70%iger wäßriger Methanollösung (pH 8 bis 9) eluiert, das Methanol abdestilliert und den Rückstand mit Äthylacetat, Benzol, Chloroform, n-Butanol oder mit Methylisobutylketon extrahiert, wobei man die rohe Antibiotikum-BN-200-Substanz erhält, und das Rohprodukt dann durch Dünnschichichromatographleren über Kieselgel unter Verwendung von Chloroform-Methanol, Benzol-Äthanol oder Benzol-Aceton reinigt.
    10
    Patentansprüche:
    I. Antibiotikum BN-200 mit den folgenden Eigenschaften;
DE2841374A 1977-10-04 1978-09-22 Antibiotikum BN-200 und Verfahren zu dessen Herstellung Expired DE2841374C2 (de)

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