DE2950980C2 - Antibiotikum BN-183B und Arzneimittel, welche dieses enthalten - Google Patents

Antibiotikum BN-183B und Arzneimittel, welche dieses enthalten

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DE2950980C2 DE2950980A DE2950980A DE2950980C2 DE 2950980 C2 DE2950980 C2 DE 2950980C2 DE 2950980 A DE2950980 A DE 2950980A DE 2950980 A DE2950980 A DE 2950980A DE 2950980 C2 DE2950980 C2 DE 2950980C2
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Description

wobei die Fig. 1 und 2 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren, Krebs oder einem Virus befallenen Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil die Substanz BN-183B gemäß Anspruch 1 zusammen mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthält.
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Antibiotikum, das als Kultivierungsprodukt eines spezifischen Stammes vom Genus Pseudomonas existiert und das eine starke Wachstumsinhibierung gegenüber Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien aufweist und eine Antikrebs- und Antivirusaktivität hat.
Fig. 1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids des BN-183B-Antibiotikums, wobei die Messungen bei einer Konzentration von 10 mcg/ml in destilliertem Wasser (1), 0,1 n-Schwefelsäure (11) und 0,1η NaOH (III) vorgenommen wurden, und
Fig. 2 zeigt das lR-Absorplionsspektrum des Hydrochlorids des BN-183B-Antibiotikums, gemessen nach KBr-Tablettenmethode.
Ein Beispiel eines BN-183B-Substanz produzierenden Stammes ist Pseudomona sp. BN-183-Stamm, der aus der Erde inTokaimura, lbaragi Prefecture, Japan, isoliert wurde. Der BN-183-Stamm ist in The American Type Culture Collection (ATCC) unter ATCC Nr. 31 571 am 26. September 1979 deponiert worden.
Die bakteriologischen Eigenschaften des BN-183-Stammes werden in der japanischen Patentanmeldung 5n (OPI) Nr. 1 05 292/77 (veröffentlicht am 3. September 1977) beschrieben (der Ausdruck »OPI« bezieht sich auf eine »veröffentlichte, nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung«).
A) Morphologische Eigenschaften
Die auf einem Bouillon-Agar-Medium kultivierten Zellen sind stäbchenförmig, mit einer Größe von 0,5 bis 0,7 x 0,7 bis 2,0 pm und man kann eine Bewegung durch polare Geißeln beobachten. Es bilden sich keine Sporen, noch zeigt sich ein Polymorphismus. Gram-Färbung ist negativ.
B) Kultureigenschaften
1) Bouillon-Agar-Medium: Die schwachbraunen Zellen wuchern. Die Kolonien zeigen kein ausgeprägtes rundliches Wachstum, Dickflüssigkeit und Motalität. Keine Ausbildung von diffundierbaren Pig-
6n menten.
2) Bouillon-Medium: Das gesamte Medium ist trüb und es bildet sich eine dünne Haut auf der Flüssigkeitsoberfläche.
3) Bouillon-Gelatine-Stabkullurmedium: Verflüssigt.
4) Lackmusmilch-Kultur: Vollständige Verflüssigung bei zweiwöchiger Kultivierung bei 28°C, wobei ^ eine schwache Alkalinität auftritt.
C) Physiologische Eigenschaften:
1) Reduktion von Nitrat: Negativ
2) Denitrili/ierungsreaklion: Ncti;itiv
3) MR-Test: Positiv
4) VP-Test: Negativ
5) Bildung von indol: Negativ
6) Bildung von Schwefelwasserstoff: Negativ nach der Bleipapiermethode
7) Stärkehydrolyse: Positiv ί
8) Verwendung von Zitronensäure: Positiv nach der Simmons und Christensen-Methode
9) Verwendung von anorganischen StickstofTquellen: Als einzige N-Quelle kann ein Ammoniumsalz verwendet werden.
10) Bildung von Pigmenten: Es wird keine ausgeprägte Bildung von Pigmenten in King A- und B-Medien festgestellt ">
11) Oxidase: Positiv
12) Wächst nicht unterhalb 5°C und oberhalb 41°C.
13) Kein Bedarf an Vitaminen oder Aminosäuren.
14) OF-Test (Keuleifson's Methode): O-Type
15) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen
16) Verwendung von Kohlenstoflquellen: Glucose, Maltose, Xylose, Lactose, D-Arabinose. Cellubiose, L-Threonin, L-Ornithin und Saccharat.
Der BN-183-Stamm mit den obigen bakteriologischen Eigenschaften wurde mit Stämmen verglichen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974, beschrieben werden und es wurde dabei :o folgendes festgestellt:
1. Dieser Stamm gehört zum Genus Pseudomonas, weil er ein Gram-negatives, stäbchenförmiges Bakterium ist, das keine Sporen bildet, mit polaren Geiseln sich bewegt und vollkommen aerob ist.
2. Aus der charakteristischen Fähigkeit, eine große Anzahl von Kohlenstoffquellen zu verwenden, kann man schließen, daß dieser Stamm ein Verwandter von Pseudomonas cepacia ist. :>
Eine Reihe von Medien, wie sie in üblichen Mikrofermentationsverfahren angewendet werden, kann zum Kultivieren von BN-183B-Antibiotikum produzierenden Stämmen und zur Bildung und Ansammlung des BN-183B-Antibiotikums verwendet werden. Zum Beispiel kann man Glucose, Glyzerin, Dextrin und Hirse-Gelee als Kohlenstoffquelle verwenden. Verwendbare StickstofTquellen schließen z. B. Pepton, Fleischextrakt. Bouillonpulver, Mais-Maische, Sojabohnenkuchen, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid ein. Anor- \u ganische Salze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat werden zusätzlich verwendet, sofern sie benötigt werden. Gewünschtenfalls kann man ein Antischaummittel zugeben.
Die Kultivierung kann in einem flüssigen Kulturmedium, z. B. nach der Schüttelkulturmethode oder nach der Belüftungskulturmethode durchgeführt werden. Die Kultivierungstemperatur liegt optimal im Bereich von etwa 20 bis etwa 350C und geeignete Kultivierungszeiten liegen zwischen 1 und 3 Tagen.
Das BN-183B-Antibiotikum wird hauptsächlich extrazellular in'der Kultivierungsflüssigkeit angesammelt. Bei der Untersuchung des BN-183B-Antibiotikums wird dessen antibakterielle Aktivität genutzt, und als zu bekämpfender Stamm Bacillus subtilis ATCC 6633. Eine Mischung aus 2%Mycin-Assay-Agarund 0,5%Bacto-Agar wird als Untersuchungskulturmedium verwendet. Wird das BN-183B-Reinproc!ukt unter den obigen Bedingungen untersucht, so ist die Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration im Bereich von 20 41, bis 500 mcg/ml und dem Durchmesser der Inhibierungszone linear, wobei die Inhibierungszone einen Durchmesser von 16 bis 29 nm entsprechend dem obigen Konzentrationsbereich hat (Papierscheibenmethode).
Das BN-183B-Antibiotikum kann in der nachfolgenden Weise extrahiert und gereinigt werden. Die Fermentationsbrühe mit dem aktiven Bestandteil wird zur Abtrennung der Feststoffe filtriert. Zum Filtrat wird Aktivkohle oder ein sehr poröses Harz gegeben und anschließend wird gerührt, wobei die aktiv e Substanz auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert wird. Dann wird die aktive Substanz mit einer wäßrigen Aceionlösung oder wäßriger Methanollösung eluiert und die Lösung wird bis zur Trockne konzentriert, wobei man die rohe BN-183B-Substanz erhält. Das Rohprodukt wird dann durch eine geeignete Kombination von Säure-Chromatographie unter Verwendung von CM Sephadex C-25, einer Gelfiltration, einer Säulenchromatographie unter Verwendung vom Amberlite gereinigt, wobei man ein weißes Pulver erhält. S(1
Die Trennung zwischen dem erfindungsgemäßen BN-183B-Antibiotikums und der BN-183-Substanz gemäß der japanischen Patentanmeldung (OPl) Nr. I 05 292/77 kann z. B. durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Äthylacetat/Essigsäure/Wasser (10:17:17 v/v) als Entwicklungsmittel erfolgen. Das erfindungsgemäße BN-183B-Antibiot!Kum erhält man, indem man die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,34 sammelt. 5,
Beim Chromatographieren des erhaltenen Pulvers über einer dünnen Schicht von Kieselgel unter Verwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme, z. B. Butanol/Essigsäure/Wasser, Äthylacetat/Essigsäure/Wasser, Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser und dergleichen, bildet sich bei allen verwendeten Systemen ein einziger Spot. Dies bedeutet, daß das erhaltene Pulverprodukt von Antibiotikum BN-183B in reiner Form vorliegt.
Tabelle 1 zeigt die minimale Wachstumsinhibierungskonzentration des BN-I83B-Antibiotikums gegenüber (,(/ verschiedenen Mikroorganismen. Es wird die starke Inhibierungsaktivität gegenüber Gram-positive und Gramnegative Bakterien gezeigt und damit die Eignung für medizinische und veterinärmedizinische sowie für Desinfektionszwecke.
29 59 980
Tabelle
Mikroorganismen
Minimale Wachstumsinhibierungs- kon/entration (mcg/ml)
Staphylococcus aureus 209P JC-I 0,20
Staphylococcus aureus Smith S-424 0,20
Staphylococcus epidermidis ATCCl4990 0,20
Staphylococcus laecalis ATCC8043 0,39
Escherichia coli NIHJ JC-2 1,56
Escherichia coli K-12 IAM 1264 0,78
Proteus vulgaris OX19 6,25
Als Kulturmedium wurde ein Nähragar verwendet.
Die LDiu-Werte der erfindungsgemäßen Substanz bei Mäusen wird in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Verabreichungsweg
LDsii (mg/kg)
Oral
Intravenös Intramuskulär Intraperitoneal Subkutan
50
4,1 4,1 4,3 6,0
Die BN-183B-Substan/ weist auch Antikrebsaktivität auf, und eine diese Substanz enthaltende Zusammen- !»et/ung ist ein wirksames Antikrebsmittel. Lymphocytische Leukämie P-388 oder lymphoide Leukämie L-1210-Zellen wurden intraperitoneal in einer Menge von 1 x 10·'pro Maus auf CDFi Mäuse oder BDFt Mäuse (etwa 5 Wochen all, Körpergewicht 20 ± 1 g), transplantiert, wobei jeweils 5 Mäuse in einer Gruppe waren. 24 Stunden nach der Tumortransplantalion wurde eine Lösung aus BN-183B-Antibiotikum in destilliertem Wasser liir Injektionszwecke intraperitoneal den Mäusen einmal täglich während 3 aufeinanderfolgender Tage verabreicht. Der Prozentsatz der Erhöhung der Lebensdauer wurde gemessen, dann wurde die Durchschnittsanzahl der Überlebenslage bei jeder behandelten Gruppe mit der einer Kontrollgruppe, welcher kein BN-183B-Antibiotikum verabreicht worden war, verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Dosis pro Verab
reichung (mg/kg)		 Prozenterhöhung
(%)
P-388		 der Überlebenszeit
L-1210
4 66,0 59,5
2 79,2 45,9
1 54.7 32,4
0.5 41.5 35,1
0,25 32,1 10,8
In Kombination mit Doxorubicin liegt eine synergislische Wirkung bei der Bekämpfung von lymphocylischer Leukämie vor.
Die Antivirusaktivität wurde mittels eines Gewebekullurtests gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 4 gezeigt werden. Diese zeigen eine sehr starke Aktivität gegenüber DNA-Tp- und RNA-Typ-Viren an. Bei Tierversuchen unter Verwendung von Mäusen wurde die Anü-Herpes-Virusaklivilät gemessen, wobei die Anzahl der Tage festgestellt wurde, bei der 50% überlebten (ET50). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Testmethode wurde wie folgt durchgeführt: ICR-SIC-Mäuse (männlich. 4 Wochen alt, Körpergewicht 20 ±0,5 g) wurden in Gruppen von jeweils 10 Mäusen verwendet. Herpes simplex-Virustyp II 196 wurde den Mäusen in einer Menge von 10; pfu/Maus intraperitoneal verabreicht. 24 Stunden später wurde die BN-183B-Substanz oder 5-lodo-2'-deoxy-uridin (IUDR) als Kontrolle intraperiloneal den Mäusen verabreicht. Die Mäuse wurden 2 Wochen beobachtet. Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, daß die gleiche Wirkung wie bei der Gruppe, der 100 mg/kg IUDR verabreicht worden war, bei der Gruppe festgestellt wurde, welcher 1,25 mg/kg BN-183B-Antibiotikum verabreicht worden war.
Tabelle 4
Verwendeter Virus
Dosis Differenz zwischen
(mcg/m) Log TCIDsn/ml
und der Kontrolle
Influenza Virus AO/l'R-8 3,9 2,50 12 13 14 ET50
Newcasllc-Krunkheit 3,9 6,00 (Tage)
Virus Miyadera 90 90 90
Vacciinia Virus Lister 3,9 3,00 70 70 70 7.65
Herpes Virus Typ Il 196 3,9 3,83 8,38
Infektiöser pankrcatischer 0,5 6,801 8.50
Necrosis (IPN) Virus der 7,61
Regenbogenforelle
Infektiöser hämatopischer 0,5 3,000
Necrosis (IHN) Virus der
Regenbogenforelle
Tabelle 5
Arzneimittel Dosis Kumulative Mortalität (%) nach
mg/kg ab Inokulierung des Virus
5 6 7 8 9
BN-183B 2,5 0 10 20 70 80
BN-183B 1,25 0 20 20 60 70
IUDR 100 0 0 30 40 60
Kein Arznei 0 10 40 90 100
mittel wurde
verabreicht
Beispiel 1
der angegebenen Anzahl Tagen
10 11
100
70 80
70 70
15 1 eines Kulturmediums, enthaltend 1,5% Glyzerin, 1% Dextrin, 2% entfettetes Sojabohnenmehl. 0,5% Kaliumchlorid, 0,2% Calciumcarbonat und 0,03% eines Silikonöls als Antischaummittel wurden in einen 30 1 Fermentationstank vorgelegt, 10 Minuten bei 1200C sterilisiert und gekühlt. Pseudomonas sp. BN-183 ATCC 31571,2 Tage im gleichen Medium wie vorher erwähnt in zwei Sakaguchi-Kolben vorkultiviert, wurde aseptisch in den Fermentationstank inokuliert. Die Saatkultur wurde unter Rühren und Belüften bei 28°C (Fließgeschwindigkeit der Luft 15 l/Min.; Rührgeschwindigkeit 200 Umdrehungen) kultiviert. Nach zweitägiger Kultivierung erhielt man 13 I einer Kulturbrühe (130 mcg/ml). Zu der Kulturbrühe wurden 40 g Aktivkohle für chromatographische Zwecke gegeben und die Mischung wurde gerührt und die Aktivkohle durch Dekantieren abgetrennt. Die Aktivkohle wurde in eine Säule gepackt. Die Säule wurde mit einem Liter einer 50%igen wäßrigen Acetonlösung gewaschen und mit einer 80%igen wäßrigen Lösung von Aceton mit einem pH von 2 eluiert, wobei man die aktiven Fraktionen erhielt. Das Aceton in den aktiven Fraktionen wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand aufeine Säule aus 300 ml CM Sephadex C-25 gegeben, wobei die aktiven Bestandteile darauf adsorbiert wurden. Die Sephadex-Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 0.1 m einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert, wobei man aktive Fraktionen erhielt. Die aktiven Fraktionen wurden aufeine Säule (150 ml) von Diaion HP-20 gegeben, wobei der aktive Bestandteil adsorbiert wurde. Die Säule wurde zur Entfernung von Natriumsalz mit Wasser gewaschen und der aktive Bestandteil wurde mit 8O°/oiger wäßriger M ethanol lösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man 230 mg des BN-183B-Antibiotikums in Form eines gelben Pulvers mit einer Reinheit von etwa 70% erhielt
Beispiel 2
350 1 eines 2% Glyzerin, 1% Dextrin, 3% entfettetes Sojabohnenmehl, 0,5% Kaliumchlorid, 0,3P* Calciumcarbonat und 0,03% Silikonöl als Antischaummittel enthaltenden Kulturmediums wurden in einem 570 1 Fermentationstank vorgelegt und 20 Minuten bei 1200C sterilisiert und dann gekühlt. 201 von Pseudomonas sp. BN-183 ATCC 31571 vorkultiviert während 24 Stunden im gleichen Fermentationstank wie im Beispiel 1. wurden in den Fermentationstank aseptisch inokuliert. Die Saatkultur wurde unter Rühren und Belüften 2 Tage bei 280C (Luft-Fließgeschwindigkeit 200 l/Min.; Rührgeschwindigkeit 100 Umdrehungen pro Minute) kultiviert, wobei man 320 1 einer Kulturbrühe (200 mcg/ml) erhielt Die Feststoffe wurden abfiltricn. wobei man 300 1 Filtrat erhielt
Zum Filtrat wurden 301 Diaion Hp-20 gegeben und die Mischung wurde gerührt, wobei der aktive Bestandteil auf dem Harz adsorbiert wurde. Das Harz wurde mit 601 einer 50%igen wäßrigen Methanollösung gewaschen und dreimal mit 601 einer 80%igen wäßrigen Methanollösung eluiert, wobei man den aktiven Bestandteil erhielt. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und die wäßrige Lösung wurde auf 501 mit Wasser verdünnt. Die verdünnte wäßrige Lösung wurde auf eine 91 Säule vom CM Sephadex C-25, das zuvor mil Wasser angequollen worden war, gegeben, wobei der aktive Bestandteil absorbiert wurde. Die Säule wurde mit 121 Wasser gewaschen und mit 0,1 m einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Fraktionen (161) wurden auf eine 101 Säule Diaion Hp-20 gegeben, wobei die aktiven Bestandteile adsorbiert wurden. Das Harz wurde mit Wasser zur Entfernung von Natriumchlorid gewaschen und dann mit einer 50%igen wäßrigen Methanollösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man 8,3 g des Bn-183 B-Antibiotikums als gelbes Pulver mit einer Reinheit von etwa 90% erhielt.
Das Pulver wurde in 300 ml Methanol gelöst. Die unlöslichen Bestandteile wurden entfernt und die Lösung wurde durch eine Säule aus 200 ml Aktivkohle, gefüllt mit Methanol geschickt und mit Methanol entwickelt. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man 6,7 g des BN-183 B-Antibiotikums als reines Produkt erhielt.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

Patentansprüche:
1. Antibiotikum BN-183B und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei das Hydrochlorid folgende charakteristische Daten hat:
s
1) Elementaranalyse:
C 39,84%, H 5,25%, N 6,43%, Cl 22,90%
2) Molekulargewicht: 383
3) Molekularformel: CuH20N2O6Cl2 · HCl
4) Schmelzpunkt: Wird bei 1900C braun und schäumt und zersetzt sich bei 214°C.
5) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Gemäß Fig. 1
6) Infrarotabsorptionsspektruni:
Absorptionsbanden bei 3400,3020,1680, 1620, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 1270,1240,1180,1160, 1130,1090,1080,1020,930,980,850,830,800,740,700 cm-· und Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2. 7) Spezifische Drehung: (a)c23 - 9° (c=l, Wasser)
8) Löslichkeit: Sehr löslich in Wasser, etwas löslich in Methanol, und kaum löslich in Azeton, Chloroform und Äthylacetat.
9) Farbreaktionen:
Positiv: Ferrichlorid, Ninhydrin und Fehling'sche Lösung
Negativ: Molisch und Biuret
10) Unterscheidung durch Neutralität, Acidität und Basizitäl: Verhält sich bei Filterpapier-Elektrophorese als basische Substanz
U) Aussehen: Weißes bis schwach-gelbliches Pulver
12) Rf-Werte bei Dünnschichtchromatographie:
Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1) 0,66
Äthylacetat/Essigsäure/Wasser (60:17:17) 0,34
Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1:3) 0,*65,
DE2950980A 1978-12-27 1979-12-18 Antibiotikum BN-183B und Arzneimittel, welche dieses enthalten Expired DE2950980C2 (de)

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