SE451330B - Farmaceutisk komposition innefattande en antibiotisk substans benemnd bn-183b vilken er framstelld genom odling av pseudomonas sp bn-183 (ferm-p 3332,atcc 31571) - Google Patents

Description

451 530 (3) molekylformel: Cl4H2oN206C12.HCl (4) smältpunkt: börjar bli brun vid l90OC och skummar och sönderdelar vid 21400. (5) ultraviolett absorptionsspektrum: visas i figur 1 (6) infrarött absorptionsspektrum: absorptionsband vid 3400, 3020, 1680, 1620, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 1270, 1240, 1180, 1160, 1130, 1090, 1080, 1020, 930, 880, 850, 830, 800, 740, 700 cm_l och absorptionsspektrum som visas i figur 2. 3 s (8) löslighet: mycket löslig i vatten, lätt löslig i (7) specifik vridning: [a] (c=1, vatten) metanol och knappast löslig i aceton, kloroform och etylacetat (9) färgreaktioner: positiv: järn(III)klorid, ninhydrin och Fehlings lösning negativ: Molish test och biuretreaktion '“ (10) distinktion genom neutralitet, aciditet och basicitet: beter sig som en basisk substans i filtrer- papperelektrofores. (ll) utseende: vitt eller lätt gulaktigt pulver (12) Rf-värden i tunnskiktskromatografi: butanol-ättiksyra-vatten (2:l:l) 0,66 etylacetat-ättiksyra-vatten (60:l7:17) 0,34 butanol-pyridin-ättiksyra-vatten (6:4:1:3) 0,65 BN-l83B-substansen framställes genom odling av BN-l83B- substans-alstrande stammar av släktet Pseudomonas och sepa- ration och återvinníng av BN-1833-substansen från odlings- vätskan.

Figur 1 visar det ultravioletta absorptionsspektrumet av hydrokloriden av BN-183B-substansen, varvid mätningarna .r 451 330 gjorts i en koncentration av 10 ng/ml i destillerat vatten (I), O,lN svavelsyra (II) och O,lN Na0H (III) och figur 2 är ett infrarött absorptionsspektrum av hydrokloriden av BN-l83B-substansen mätt enligt KBr-tablettmetoden.

Den BN-l83B-substansalstrande stammen, som användes för föreliggande uppfinning är Pseudomonas sp. BN-183-stammen (BN-183-stam) isolerad ur jorden i Tokaimura, Ibaragi Prefec- ture, Japan. BN-183-stammen är deponerad i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Techno- logy, Ministry of International Trade and Industri i Japan under tillgângsnummer FERM-P Nr 3332 och i American Type Culture Collection (ATCC) under ATCC Nr 31571 (deponerad den 26 september l979).

De bakteriologiska egenskaperna hos BN-l83B-stammen beskrives på följande sätt i den japanska patentansökan (OPI) nr 105292/77 (publiserad den 3 september 1977). (Uttrycket "OPI" avser i detta sammanhang "publiserad ogranskad japansk patentansökan").

(A) Morfologiska kännetecken Celler odlade på buljong-agar-medium är stavformade, har en storlek av 0,5 - 0,7 x 0,7 - 2,0 mikron och rörelse med polar flagella observeras. Ingen bildning av sporer eller uttryck av polymorfism. Gramfärgning är negativ.

(B) Odlingskännetecken (I) Buljong-agar-medium: ljust bruna celler alstras. Kolonierna markerar inte veckad tillväxt, viskositet och rörlighet.

Ingen bildning av diffusibla pigment. (2) Buljong-medium: hela mediumet är grumligt och ett tunnt skum bildas på vätskeytan. 451 330 Buljong-gelatin genomträngnings (stab) knlturmedium: vätskeform Lackmusmjölkkultur: fullständig vätskeform vid odling vid 28°C i 2 veckor för att visa svag alkalitet.

(C) Fysiologiska karaktäristika (l) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (ll) (12) (13) (14) (15) (16) reduktion av nitrat: negativ denitreringsreaktion: negativ MR-tes t: VP-test: bildning positiv negativ av indol: negativ bildning av vätesulfid: negativ enligt blypapper- metoden hydrolys av stärkelse: positiv användning av citronsyra: positiv enligt Simmons och Christensen-metoden användning av oorganiska kvävekällor: ett ammoniumsalt kan användas som enda N-källa bildning av pigment: Ingen markerad bildning av pig- ment noteras i King A och B-media oxidas: positiv kan inte växa under SOC och över 4100 inge fordringar på vitaminer eller aminosyror OF-test (Heuleifson's metod): O-typ ingen tillväxt under anaeroba betingelser användning av kOlkäll0r glukos, maltos, xylos, laktos, D-arabinos, cellobios, L-treonin, L-ornitin och sackarat.

BN-l83B-stammen med de ovannämnda bakteriologiska egenska- perna jämfördes med stammar beskrivna i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8:e upplagan (1974) och följande slutsatser drogs. 1. Denna stam tillhör släktet Pseudomonas eftersom den är en gramnegativ stavformad bakterie, som inte bildar sporer, 451 330 rör sig med polar flagella och är absolut aerob. 2. På grund av dess kännetecknande förmåga att använda ett brett område kolkällor bedöms denna stam höra till Pseudomonas cepacia.

Olika odlingsmedium som användes i ordinära mikrobiologiska fermentationsförfaranden kan användas för att kultivera BN-l83B-substans-alstrande stammar och ge och ackumulera BN-l83B-substansen. Glukos, glycerol, dextrin och hirsgele kan exempelvis användas som kolkällor. Kvävekällor som kan användas innefattar exempelvis pepton, köttextrakt, buljong- pulver, majsstöpvätska, sojabönkaka, ammoniumsulfat och ammoniumklorid. Oorganiska salter såsom natriumklorid och kalciumkarbonat användes dessutom om så erfordras. Om så önskas kan ett anti-skummedel tillsättas.

Odlingen kan lämpligen genomföras med användning av ett vätskekulturmedium såsom en skakkulturmetod eller en luft- tillförsel-omrörings-odlingsmetod (aeration agitation cul- ture method). Odlingstemperaturen är optimal i storleksord- ningen ungefär 20 - 35°C och en lämplig odlingstid är l - 3 dagar.

BN-l83B-substansen ackumuleras huvudsakligen extracellulärt i odlingsvätskan.

Vid bedömning av BN-l83B-substansen användes dess anti- bakteriella aktivitet och Bacillus subtilis ATCC 6633 använ- des som bedömningsstam. En blandning av 2% mycin-bedömnings- agar (en produkt av Kyoei Seiyaku K.K.) och O,5% bakto-agar (en produkt från Difco) användes som bedömningskulturmedium.

När BN-l83B-substansen (ren produkt) bedöms under de ovan an- givna betingelserna är förhållandet mellan logaritmen för koncentrationen i storleksordningen 20 till 500 ng/ml och diametern av den inhiberande zonen är liniär och en inhibe- rande zon med en diameter av 16 till 29 mm ges motsvarande 451 330 det ovan angivna koncentrationsintervallet (papperskivemeto~ den).

BN-l83B-substansen kan extraheras och renas enligt dess nedan beskrivna fysikaliska och kemiska egenskaper. Den nedan be- skrivna metoden är effektiv. D.v.s. fermentationsvätskan innehållande den aktiva bestàndsdelen filtreras för att av- lägsna fast material. Till filtratet sättes en adsorbent så- som aktiverat kol (exempelvis aktiverat kol för kromatografisk användning (en produkt från Wako Purechemical Industries Ltd.)) eller ett högporöst harts (exempelvis Diaion HP-20 (ett varunamn, en produkt av Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan)) följd av omrörning och den aktiva substansen adsorberas på adsorbenten. Därefter elueras den aktiva substansen med en vattenhaltig acetonlösning eller vatten- haltig metanol-lösning och lösningen koncentreras till torr- het och ger en oren BN-l83B-substans. Den orena produkten renas därefter genom en lämplig kombination av kolonnkro- matografi med användning av CM Sephadex C-25 (en produkt från Pharmacia Co., Sverige), gelfiltrering, kolonnkromatografi med användning av jonbytarharts såsom Amberlite lRC-50 och CG-SO (ett varunamn från Rohm & Haas Co., USA) och liknande för att erhålla ett vitt pulver av BN-l83B-substansen. Sepa- ration mellan BN-l83B-substansen enligt uppfinningen och BN-183-substansen enligt den japanska patentansökan (OPI) 105292/77 kan exempelvis genomföras med tunnskiktskromato- grafi med användning av silikagel och etylacetat-ättiksyra- vatten (60:l7:l7, beräknat på volymen) som framkallande lös- ningsmedel. BN-l83B-substansen enligt föreliggande upp- finning kan erhållas genom att man samlar fraktioner med ett Rf-värde av 0,34 vid ovan angiven tunnskiktskromatografi och BN-l83-substansen enligt den japanska patentansökan (OPI) 105292/77 kan erhållas genom att man samlar fraktioner med ett Rf-värde av 0,55 i ovan angivna tunnskiktskromatografi och således kan BN-l83B-substansen enligt uppfinningen av- skiljas från BN-l83B-substansen enligt den japanska patent- ansökan (OPI) lO5292/77. 451 330 När den erhållna pulverprodukten kromatograferas på ett tunt skikt silikagel med användning av olika lösningsmedelssystem, t.ex. butanol-ättiksyra-vatten, etylacetat-ättiksyra-vatten, butanol-pyridin-ättiksyra-vatten, etc. bildas en enkel fläck i alla använda system. Detta visar att den erhållna pulver- produkten är en BN-l83B-substans i ren form.

Fysiologiska kännetecken för BN-l83B~substansen, som hydro- klorid, är följande: (1) (2) (3) (4) (6) (7) (8) (9) elementaranalys: C 39,84%, H 5,25%, N 6,43%, Cl 22,90% molekylvikt: 383 molekylformel: Cl4H2oN206Cl2.HCl smältpunkt: den börjar bli brun vid 19000 och skummar och sönderdelar vid 2l4OC ultraviolett absorptionsspektrum: som visas i figur l infrarött absorptiopsspektrum: absorptionsband vid 3400, 3020, 1680, 1620, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 1270, 1240, ll80, ll60, 1130, 1090, 1080, 1020, 930, 880, 850, 830, 800, 740, 700 cm_l och absorptionsspektrum som visas i figur 2 O (c=l, vatten) specifik vridning: [a]š3 -) solubilitet: _ mycket löslig i vatten, lätt löslig i metanol och knappast löslig i aceton, kloroform och etylacetat färgreaktioner: positiv: järn(III)klorid, ninhydrin och Fehlings lösning negativ: Molisch test och biuretreaktion 451 330 (10) distinktion genom neutralitet, aciditet och basicitet: den visar ett uppträdande som basisk substans i filtrerpapperelektrofores (ll) utseende: vitt till lätt gult pulver (12) Rf-värden i tunnskiktskromatografi: butanol-ättiksyra-vatten (2:l:l) 0,66 etylacetat-ättiksyra-vatten (60:l7:l7) 0,34 butanol-pyridin-ättiksyra-vatten (6:4:l:3) 0,65 Tabell l nedan visar den lägsta tillväxtinhiberande kon- centrationen av BN-l83B-substansen på olika mikroorganismer.

Den visar en stark inhiberande effekt på grampositiva och gramnegativa bakterier och är användbar i läkemedel, veteri- närläkemedel och desinfektionsmedel.

TABELL l Lägsta tillväxt- inhiberande kon- Mikroorganismer centration H9/ml Staphylococcus aureus 209P JC-l 0,20 Staphylococcus aureaus Smith S-424 0,20 Staphylococcus epidermidis ATCCl4990 0,20 Staphylociccus faecalis ATCCBO43 0,39 Escherichia coli NIHJ JC-2 1,56 Escherichia coli K-12 IAM 1264 0,78 Proteus vulgaris 0Xl9 6,25 Det använda odlingsmediumet var ett näringsagar (en produkt från Difco).

LD50-värdena för föreliggande substans på mus visas i tabell 2. m 451 330 9 TABELL 2 Administrationssätt LDSO (mg/kg) oralt 50 intravenöst 4,1 intramuskulärt 4,1 intraperitonealt 4,3 subkutant 6,0 BN-l83B-substansen visar även anticancerös aktivitet och en kompisition innehållande denna substans är ett effektivt anticancermedel. Lymfocytisk leukemi P-388 eller lymfoid leukemi L-l2lO celler transplanterades intraperitonealt i en mängd av l x 106 per mus i CDFl-möss eller BDFI-möss (ungefär 5 veckor gamla, kroppsvikt 20 3 l g), fem i varje grupp. 24 timmar efter transplantationen av tumören administre- rades intraperitonealt till mössen en gång per dag under tre på varandra följande dagar en lösning av BN-lB3B-substansen i destillerat vatten för injektionsändamål. Procenten ökning i livslängd (d.v.s. ILS) mättas genom att man jämförde medel- talet överlevnadsdagar för varje behandlad grupp med en kontrollgrupp vilka inte erhållit BN-l83B-substansen. Resul- taten framgår av tabell 3.

TABELL 3 Administrationsdos Procent ökning i livslängd (mg/kg) % P-388 L-l2lO 4 66,0 59,5 2 79,2 45,9 l 54,7 32,4 0,5 41,5 35,1 0,25 32,1 lO,8 451 330 10 BN-l83B-substansen har ytterligare antiviral aktivitet och är användbar som antiviralt medel. Dess antivirala aktivitet mättes genom ett vävnadsodlingstest och resultaten visas i tabell 4. Den visar en mycket stark aktivitet mot virus av DNA-typ och RNA-typ. Genom djurförsök med användning av möss mättes dess anti-Herpes-virus-aktivitet och antalet dagar för 50% överlevnad (ET50) mättas. Resultaten framgår av tabell 5. Testmetoden var följande: ICR-SLC-möss (hankön, 4 veckor gamla, kroppsvikt 20 1 0,5 g) användes i grupper var och en bestående av tio möss. Herpes- simplex-virus typ II 196 administrerades intraperitonealt till mössen i en mängd av 103 pfu/mus. 24 timmar senare ad- ministrerades intraperitonealt till mössen BN-l83B-substansen eller 5-jod-2'-deoxiuridin (IUDR) som kontroll. Mössen obser- verades i 2 veckor. Det framgår av tabell 5 att samma effekt som för gruppen vilka erhållit 100 mg/kg IUDR noterades i gruppen som erhållit 1,25 mg/kg BN-l83B-substans.

TABELL 4 Skillnad från kontrollen av Använda virus Dos Log TCIDSO/ml (ng/ml) Izífluensavirus Ao/PR-s 3,9 2,50 Newcastle-sjukdomsvirus Miyadera 3,9 6,00 Vaccinvirus Lister 3,9 >3,00 Herpes-virus typ II 196 3,9 3,83 Infektiös pankreatisk nekros (IPN)-virus av regnbågsforell 0,5 6,801 Infektiös hematopoies nekros (IHN)-virus av regnsbâgsforell 0,5 3,000 451 330 ll TABELL 5 Kumultativ mortalitet (%) efter angivet antal dagar efter ympning av virus ïäkæffíl.n°s_iiz__ß_ 9 Angel ETSO (mg/kg) ldagflrl BN-1833 2.5 0 10 20 70 80 100 7.65 " 1.25 0 20 20 60 70 70 80 90 90 90 8.38 1002 100 0 0 30 40 so 70 70 70 70 70 8.50 Inget läkefledel o 10 40 90 100 7.61 ahfinistre- raks Beträffande det nya med föreliggande substans BN-l83B med ovannämnda fysiokemiska och bakteriologiska kännetecken granskades japanska patentansökningar (OPI), japanska patent, den japanska publikationen Antiobiotics, volym l och 2 och supplement I och II (skriven av Yusuke Sumiki), Index of Antibiotics from Actonimycetes (skriven av Hamao Umezawa) och Chemical Abstracts. Inga substanser motsvarande BN~l83B- substansen har återfunnits.

Uppfinningen àskàdliggöres närmare medelst följande exempel vari temperaturerna avser Celsius-grader.

Exempel l l5 liter odlingsmedium innehållande l,5% glycerol, l% dextrin, 2% avfettad sojabönmjöl, O,5% kaliumklorid, O,2% kalcium- karbonat och 0,03% silikonolja som antiskummedel satsades 451 330 l2 m i en 30 liters fermentationstank, steriliserades vid l20° i l0 minuter och kyldes. Ympmaterial av Pseudomonas sp BN-183 (FERM-P nr 3332),förkultiverade i 2 dagar i samma medium som (If) beskrivits ovan i tvâ Sakaguchi-kolvar,inokulerades asep- tiskt i fermentationstanken. Den ympade kulturen kultivera- des under omrörning och lufttillförsel vid 280 (luftflödes- hastigheten l5 liter/minut; omrörningshastighet 200 varv per minut). Efter 2 dagars odlung erhölls 13 liter kulturbuljong (130 ug/ml). Till kulturbuljongen sattes 40 g aktiverat kol för kromatografisk användning (en produkt från Wako Pure- chemical Industries, Ltd.) och blandningen omrördes varefter det aktiverade kolet avskildes genom dekantering. Det akti- verade kolet förpackades i en kolonn. Kolonnen tvättades med l liter 50%-ig vattenlösning av aceton och eluerades med en 80%-ig vattenlösning av aceton med pH 2 för att få aktiva fraktioner. Acetonet i de aktiva fraktionerna avdestillera- des under reducerat tryck och återstoden satsades till en kolonn med 300 ml CM Sephadex C-25 (en produkt från h Pharmacia Co., Sverige) som medförde att en aktiv bestånds- del adsorberades till denna. Sephadex-kolonnen tvättades med vatten och eluerades med 0,l M natriumkloridvattenlösning för att ge aktiva fraktioner. De aktiva fraktionerna satsades i en kolonn (150 ml) Diaion HP-20 (ett varunamn, en produkt från Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) som med- förde adsorption av en aktiv beståndsdel. Kolonnen tvättades med vatten för att avlägsna natriumsalt och därefter eluera- des en aktiv beståndsdel med 80%-ig vattenhaltig metanol- lösning. De aktiva fraktionerna koncentrerades till torrhet under reducerat tryck och gav 230 mg BN-l83B-substans som gult pulver med en renhet av ungefär 70%.

Exempel 2 350 liter odlingsmedium innehållande 2% glycerol, 1% dextrin, 3% avfettad sojabönmjöl, 0,5% kaliumklorid, 0,3% kalcium- karbonat och 0,03% silikonolja som antiskummedel satsades d) i en 570 liters fermentationstank, steriliserades vid l20Q i 451 330 13 20 minuter och kyldes. 20 liter ympmaterial av Pseudomonas sp BN-183 (FERM-P nr 3332),förkultiverad i 24 timmar i samma fermentationstank som i exempel l,inokulerades aseptiskt i fermentationstanken. Den ympade kulturen kultiverades un- der omrörning och lufttillförsel vid 280 i 2 dagar (luft- flödeshastighet 200 liter/minut; cmröringshastighet 100 varv per minut) och gav 320 liter kulturbuljong (200 ng/ml). De fasta substanserna avlägsnades genom filtrering och 300 liter av filtratet erhölls.

Till filtratet sattes 30 liter Diaion HP-20 och blandningen omrördes så att en aktiv beståndsdel adsorberades på hartset.

Hartset tvättades med 60 liter av en 50%-ig vattenlösning av metanol och eluerades tre gånger med 60 liter av en 80%-ig vattenlösning av metanol för att ge en aktiv beståndsdel.

Metanol avdestillerades under reducerat tryck och vattenlös- ningen späddes till 50 liter med vatten. Den utspädda vatten- lösningen satsades i en 9 liters kolonn med CM Sephadex C-25 som tidigare svällts med vatten för att därigenom åstadkomma adsorption av en aktiv beståndsdel. Kolonnen tvättades med 12 liter vatten och eluerades med en 0,lM vattenlösning av natriumklorid. De aktiva fraktionerna (16 liter) satsades i en 10 liters kolonn med Diaion HP-20 för att medföra adsorption av en aktiv beståndsdel. Hartset tvättades med vatten för att avlägsna natriumkloriden och eluerades där- efter med en 50%-ig vattenlösning av metanol. De aktiva frak- tionerna koncentrerades under reducerat tryck och gav 8,3 g BN-l83B-substans som gult pulver med en renhet av ungefär 90%.

Pulvret upplöstes i 300 ml metanol. Detolösliga materialet avlägsnades och lösningen passerades genom en kolonn av 200 ml aktiverat kol fylld med metanol och framkallad med meta- nol. De aktiva fraktionerna koncentrerades till torrhet un- der reducerat tryck och gav 6,7 g BN-l83B-substans som ren produkt.

Claims (1)

1. 451 330 PATENTKRAV il' Farmaceutisk komposition för behandling av djur och människor angripna av tumörer, cancer eller virus, innefattande en på känt sätt genom odling av Pseudomonas sp BN-183 (FERM-P nr. 97.) 3332, ATCC nr. 31571) framställd antibiotisk substans benämnd BN-183B, vars hydroklorid har följande karaktäristika, och ett farmaceutiskt acceptabelt salt därav: (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (ll) (12) tillsammans med farmaceutiskt acceptabla bärare eller elementaranalysvärden: C 39,84%, H 5,25%, N, 6,43%, Cl 22,90% molekylvikt: 383 Cl4H2oN2O6Cl2 .HCl O börjar bli brun vid 190 C och skummar och sönaeraeias vid 214°c ultraviolett absorptionsspektrum: molekylformelz smältpunkt: visas i figur 1 infrarött absorptionsspektrum: absorptionsband vid 3400, 3020, 1680, 1620, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 1270, 1240, 1180, 1160, 1130, 1090, 1080, 1020, 930, 880, 850, 830, 800, 740, 700 cm_l och absorptionsspektrum som visas i figur 2 [a]å3 -90 (c=1, vatten) mycket löslig i vatten, lätt löslig i specifik vridning: solubilitetz metanol och knappast löslig i aceton, kloroform och etylacetat färgreaktioner: positiv: järn(III)k1orid, ninhydrin och Fehlings lösning negativ: Molisch test och hiuretreaktion distinktion genom neutralititet, aciditet och basicitet: uppför sig som en basisk substans vid filtrer- papperelektrofores vitt till lätt gult pulver Rf-värden vid tunnskiktskromatografi: utseende: butanol-ättiksyra-vatten (2:1:1) 0,66 0,34 fr) etylacetat-ättiksyra-vatten (60:17:17) butano1-pyridin-ättiksyra~vatten (6:4:1:3) 0,65 utspäd- ningsmedel.