KR830001305B1 - 신항생물질 bn-183b물질의 제조법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

신항생물질 BN-183B물질의 제조법
제 1 도는 BN-183B물질 염산염의 자외부흡수 곡선도.
제 2 도는 BN-183B물질 염산염의 적외부흡수 곡선도.
본 발명은 신항생물질 BN-183B 물질의 제조법에 관한 것이다.
본 발명자들은 슈우도모나스 속에 속하는 특정균주의 배양액중에 그램양성, 음성세균에 강력한 발육 저지작용을 나타내며, 항암활성, 항바이러스 활성을 나타내는 물질이 존재한다는 것을 발견하여 배양액 중에서 유효성분을 채취하고, 그 성상을 조사한 결과 기지물질과 다른 신항생물질임을 확인하고, 그 유효성분을 BN-183B 물질로 명명하여 본 물질을 완성하였다.
본 발명에서 사용되는 BN-183B물질생산균의 1예로는 본 발명자에 의해 토양에서 분리된 슈우도모나스 SP. BN-183주(균주 번호 BN-183주)가 있다. 이 BN-183주는 일본국 공업기술원 미생물공업기술 연구소에 보관 기탁번호 제3332호로 보관되어 있다. BN-183주의 균학적 성상은 다음에 표시된 바와같다.
(a) 형태적 성질
육줍한천에 배양한 세포는 05-0.7×2.0 미크론의 간균이며, 극모성의 편모로 운동한다. 포자를 만들지아니하며, 다형성도 나타내지 않는다. 그램 염색성은 음성이다.
(b) 배양성 성질
(1)육즙한 천 배양
균체는 담다갈색을 나타내며 증식한다. 집락(集落)은 현저한 주름모양으로 증식하며 점조성, 유주성(遊走性)을 나타내지 않고, 확산성 색소의 생성도 확인되지 않느다.
(2)육즙배양
배지 전체가 현탁액면에 엷은 균막을 형성한다.
(3)육즙젤라틴 천자배양(穿刺培養)
층상으로 액화도니다.
(4)리트머스 밀크 배양
28℃, 2주간에 완전하게 액화하여 약알칼리성을 나타낸다.
(c)생리적 성질
(1) 초산염의 환원 : 음성
(2) 탈질반응 : 음성
(3) MR테스트 : 양성
(4) VP테스트 : 음성
(5) 인돌의 생성 : 음성
(6) 유화수소의 생성 : 연당지법(鉛糖紙法)
(7) 전분의 가수분해 : 양성
(8) 구연산의 이용 : 시몬즈(Simmonds)및 크리스찬센(Christiansen) 법으로 양성.
(9) 무기질소원의 이용 : 암모늄염을 유일한 ⓝ원으로 이용할 수 있다.
(10) 색소의 생성 : 킹(kinh)A,B배지에서 현저한 색소생성은 확인되지 않는다.
(11) 옥시다제(Oxidase) : 양성
(12) 5℃이하, 41℃이상에서는 증식되지 않는다.
(13) 비타민이나 아미노산등의 요구성(要求性)이 없다.
(14) OF 테스트(휴, 레이후손법) : O형
(15) 혐기조건하의 증식은 확인되지 않았음.
(16) 탄소원의 이용성
다음의 탄소원을 유일한탄소원으로 하여 이용할 수 있다.
글루코오스, 말토오스, 키실로오스, 락토오스, D-아라비노오스, 셈로비오스, L-스레오닌, L-오르니틴(ornithin), 사카레이트.
이상의 균학적 성질을 가진 BN-183주를 Bergey's manual of Determinative Bacteriology 8th edition(1974)과 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 그램음성간균으로 포자를 만들지 않으며, 극모(極毛)에 의해 운동하는 형태적 성질을 가지며, 절대호기성이므로 이 균주는 슈우도모나스(pseudomonas)속에 소속되는 것으로 정할 수 있다.
2. 광범위한 탄소원의 이용능력이 있는 특징에 의해 이 균주는 슈우도모나스 속중에도 슈우도모나스 세파시아(psendomonas cepacia)종에 가까운 것으로 판정할 수 있다.
BN-183B 물질생산균을 배양하여 BN-183B 물질을 생산 축적시키는 데는 일반적인 미생물의 발효로 쓰여지는 각종의 배지가 사용된다.
즉, 탄소원으로는 글루코오스, 글리세린, 텍스트린, 물엿등이, 또 질소원으로는 펩톤, 육엑기스, 분말육줍(bouillom), 대두박, 콘스티프리카, 황산암모늄, 염화암모늄등이 사용된다.
또 식염이나탄산칼륨등 무기염을 병용하기도 하며, 필요에 따라 소포제를 첨가하기도 한다. 배양방법으로는 진탕배양법, 통기고반배양법등 액체배지를 사용하는 방법이 적당하다. 배양온도는 20℃-35℃범위로 선택되며 배양시간은 1-3일이 적당하다.
BN-183B 물질은 주로 배양액 내에 축적된다. BN-183B 물질의 검정을 하는데는 다음의 방법이 사용된다. 검정용 배양기로는 마이신 앗세이아가(일본국 共榮製藥製品)2%와 박트아가(디프코제) 0.5%를 혼합한것을 사용한다. 검정균으로는 바틸루스스, 부티리스 Atcc 6633주를 사용한다.
BN-183B 물질(순품)은 이것을 사용한 검정에 있어서 20-500mcg/ml에서 농도와 대수와 저지원직경의 관계가 직선관계를 나타내며, 각각 16-29mm의 저지원경을 가진다.
(페이퍼 디스크법)
BN-183B 물질은 후술하는 이화학 성상을 가지므로 그 성상에 따라 추출정제가 가능하며, 다음에 표시하는 방법이 효과적이다.
즉, 유효성분을 포함한 배양액에서 고형분을 여별한 후 여액에 활성탄 또는 다공성수지를 가하고 교반하여 유효성분을 담체에 흡착시켜 아세톤수 또는 메타놀수로 유효성분을 용출하고 농축건고하여 BN-183B 물질의 제제품을 얻었다.
또, 정제하는데는 이 온교환 세파덱스, 겔여과, 이온 고환수지등을 적당히 조합시켜 사용하여 BN-183B 물질의 무식 분말을 얻었다.
이와 같이 하여 얻어진 분말을 각종 용제계로 박층 크로마트그래피에 처리, 어느 계에서도 단일 스포트를 나타내며, 이 분말이 BN-183B 물질의 순품임을 나타낸다.
위의 방법에 의하여 얻어진 BN-183B 물질의 이화학 성상은 다음과 같으며 염산염으로 측정한 것이다.
(1) 원조분석처치 : D39.84%, H5.25%, N6.43%, Cl22.90%
(2) 분자량 : 383
(3) 분자식 : C14H20N2O6Cl2.HCl
(4) 융점 : 214℃에서 발포분해가 시작됨.
(5) 자외부흡수 스팩트럼 : 제 1 도와 같음.
(Ⅰ)은 증류수로, (Ⅱ)는 0.1N황산으로, (Ⅲ)은 0.1N가성소다로 어느것이나 10mcg/ml농도로 되도록 용해하여 측정한 것이다.
(6) 적외부흡수스펙트럼 : 제 2 도와 같으며, 취화칼슘정으로 측정한 것이다.
(7) 비선광도 : [α]D 23-9°(C=1,물)
(8) 용해성 : 물에 의해 용해, 메타놀에 약간 용해, 아세톤, 클로로포름, 초산에틸에 거의 불용
(9)정색반응 : 양성을 나타내는 것으로 염화 제 2 철, 닌히드린, 페링 음성을 나타내는 것으로는 모리슈 뷰레트(Biuret)
(10) 중성, 산성, 염기성의 구별 : 여지전기 영동으로 염기성 물질로서의 거동을 나타낸다.
(11) 외관 : 백색내지 약간 황색의 분말
(12) 박층크로마토그래피토 Rf치
프타놀-초산-물(2:1:1)0.66
초산에틸-초산-물(60:17:17) 0.34
프타놀-피리딘-초산-물(6:4:1:3) 0.65
BN-183B 물질의 각종 미생물에 대한 최소의 발육 저지 농도는 제 1 표와 같으며, 그램양성, 음성세균에 강력한 저지 작용을 나타내며, 의약, 동물약 또는 살균소독제로서 쓰여진다.
[제 1 표]
Figure kpo00001
배지는 모두 뉴트리엔트아가(디프코제)를 사용하였다. 또 본물질을 마우스에 사용하여 측정한 LD50치는 제 2 표와 같다.
[제 2 표]
Figure kpo00002
또, BN-183B 물질은 항암작용을 나타내며, 본 물질을 함유한 조성물은 유효한 항암제로 된다. 즉, COF1, 마우스 또는 BOF1마우스(두 마우스 다같이 약 5주령, 체중 20±1g)를 각 1군 5마리로 하여 림파구성 백혈병(Lymphocytic Leukemia) P-388 또는 림파성 백혈병(Lymphoid Leukemia) L-1210세포를 마우스 1마리당 각 1×106개를 각각 복강내에 이식 하였다.
종양이식 24시간후 주사용 증류수에 용해한 BN-183B 물질을 마우스의 복강내에 1일 1회, 3일간 연속 투여하여 각 처리군의 평균 생존일수와 약제 무투여 군(대조)의 평균생존일수의 비교에서 연명율 (ILS Percent increase in life span)을 측정하였다. 그 결과는 제 3 표와 같다.
[제 3 표]
Figure kpo00003
또, BN-183B 물질은 항바이러스 활성을 갖고 있어 항바이러스제로서 사용된다. 조직배양시험에 의해 항바이러스 활성을 측정한 결과는 제 4 표와 같으며 DNA형, RNA형 바이러스에 극히 강력한 작용을 나타낸다.
또, 마우스를 사용한 동물시험에 의해 항헤르페스 바이러스 활성을 측정하여 50% 생존일수(ET50)을 제 5 표에 나타내었다.
시험방법은 ICR-SLC 계 마우스(♂,4주령, 체중 20±0.5g)을 1군 10마리로 하여 사용하고, 헤르펜스 심프렉스 형 Ⅱ 196주를 103pfu/마우스 복강내에 투여하여 24시간후 BN-183B 물질및 대조약제인 5옥소 2데옥시 우리딘(IUDR)을 복강내에 투여하고 2주간 관찰하였다.
제 5 표와 같이 1.25mg/kg 투여군에서 IUDR 100mg/kg투여군과 동일정도의 효과가 확인 되었다.
[제 4 표]
Figure kpo00004
[제 5 표]
Figure kpo00005
이상으로 이화학적, 생물학적 성상을 가진 BN-183B 물질의 신규성에 대하여 일본국 공개특허 공보 : 특허공고, 항생물질 상하 유보 Ⅰ,Ⅱ(住木諭介薯), 인덱스오비 안디바이오틱스 프롬 액티노미세티스(Index of Antibiotics from Actinomycetes)(梅澤濱夫薯)등을 참조하여 검토하였으나 BN-183B 물질에 해당되는 것을 발견하지 못하였다. 따라서, BN-183B 물질은 신규의 물질이다. 이하 본 발명의 실시예를 예시하나 본 발명에서는 예시되지 않은 각종의 변형 혹은 수단을 사용할 수 있다.
[실시예 1]
글리세린 1.5%, 텍스트린 1%, 탈지대두분 2%, 염화칼슘 0.5%, 탄산칼슘 0.2%, 소포용실리콘유 0.03%를 함유한 배양기 15
Figure kpo00006
를 30
Figure kpo00007
용 배양조에 넣고, 120℃에서 10분간 살균하여 냉각한 다음 미리 같은 배지에 2개의 플라스크에 2일전에 배양한 슈우도모나스 SP.BN-183주(FERM-P No. 3332)의 종을 무균으로 배양조에 식균하였다.
28℃에서 통기고반배양(통기량 15
Figure kpo00008
/분, 고반수 200rpm)하여 배양 2일에 130mcg/ml의 배양액 13
Figure kpo00009
를 얻었다.
이 배양액에 크로매토용 활성탄소(和光純藥 제품)40g을 투입하여 고반후 활성탄소를 여벽하고 활성탄을 탑에 채워 50% 아세톤수 1
Figure kpo00010
로 세정한후 pH 2의 80% 아세톤수로 유효성분을 용출시켜 활성을 구분하는 아세톤을 감압하에서 제거하고, CM 세파딕스 C-25(팔마시아사 제품) 300ml의 탑에 넣어 유효 성분을 흡착시켰다.
이 세파딕스의 탑을 수세한후 0.1몰의 식염수로 유효성분을 용출시켜 활성 구분을 다이야 이온 HP-20(일본국 三菱化成)의 탑(150ml)에 넣어 유효성분을 흡착시켰다
이 탑을 수세하여 식염이 제거되므로 80% 메타놀수로 유효성분을 용출하여 활성구분을 감압하에서 농축 건고하여 순도 약 70%의 BN-183B 물질의 황색분말 230mg을 얻었다.
[실시예 2]
글리세린2%, 텍스트린 1%, 탈지대두분 3%, 염화칼슘 0.5%, 탄산칼슘 0.3%, 소포용 실리콘유 0.03%를 함유한 배양기 350
Figure kpo00011
를 570
Figure kpo00012
용 배양조에 넣고 120℃에서 20분간 살균하여 냉각한후 밀 실시예 1의 배양조에서 24시간전에 배양한 슈우도모나스 SP.BN-183주 FERM-PNa.3332 의 종 20
Figure kpo00013
를 무균으로 배양조에 식균하였다.
28℃에서 2일간 통기고반 배양하여 (통기량 200
Figure kpo00014
/분, 고반수 100rpm) 200mcg/ml의 배양액 320
Figure kpo00015
를 얻어 고형분을 여과에 의해 고형분을 제거하여 여액 300
Figure kpo00016
를 얻었다.
이 여액에 다이야 이온 HP-20을 30
Figure kpo00017
투입하여 고반하고 유효성분을 수지에 흡착시켜 수지를 50% 메타놀수 60
Figure kpo00018
로 세정한 다음 80%메타놀수로 60
Figure kpo00019
씩 3회에 걸쳐 유효성분을 용출시켜 감압하에서 메타놀을 제거하였다.
이 수용액을 물로 50
Figure kpo00020
희석하고, 미리 물로 팽윤시킨 CM세파딕스 C-259
Figure kpo00021
의 탑에 넣어 유효 성분을 흡착시켰다.
이 조를 12
Figure kpo00022
의 물로 세정한 다음 0.1몰의 식염수로 유효성분을 용출하여 활성구분(16
Figure kpo00023
)을 다이야이온 HP-20 10
Figure kpo00024
의 조에 넣고 유효성분을 흡착시켜 수지를 수세하고 식염을 제거하여 50% 메타놀수로 유효성분을 용출하였다.
활성구분을 감압하에서 농축하여 순도 약 90%의 BN-183B 물질의 황색분말 8.3g을 얻었다. 이 분말을 메타놀 300ml에 용해하여 불용물을 제거한후 미리 메타놀로 충전한 활성탄 200ml의 컬럼에 통과시켜 메타놀로 전개하고, 활성 구분을 감압하에서농축 건고하여 BN-183B 물질의 순품 6.7g을 얻었다.

Claims (1)

  1. 슈우도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 BN-183B 물질 생산균을 배양하여 BN-183B 물질을 축적시키고 이것을 채취함을 특징으로 하는 신항생물질 BN-183B 물질의 제조법.
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