KR870001373B1 - 항생물질 BMG 162-aF2의 제조방법 - Google Patents

항생물질 BMG 162-aF2의 제조방법 Download PDF

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히로노부 이이누마
세쓰고 구니모도
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자이단 호오진 비세이부쓰 가가꾸 겡뀨우가이
이찌가와 도꾸지
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Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 BMG 162-aF2의 제조방법
제1도는 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드의 (CD3)2SO 용액 중 테트라메틸실란을 내부 기준으로 해서 측정한1H-NMR 스펙트럼도(100MHz).
제2도는 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드의 D2O 용액중에서 테트라메틸실란을 외부기준으로 해서 측정한 13C-NMR 스펙트럼도(25Mhz).
제3도는 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드의 D2O 용액중에서 15NH4NO3를 외부기준으로 해서 측정한 15N-NMR 스펙트럼도(10MHz) : 또
제4도는 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드의 적외선 흡수 스펙트럼으로서 KBr 정(錠)으로 측정한 것이다.
본 발명은 항생물질 BMG 162-aF2의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 다음 일반식(Ⅰ)의 신규한 항생물질 BMG 162-aF2 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 그 제조방법 및 유효성분으로서 진술한 항생물질을 함유하는 항종양 조성물 그리고 약리적으로 유효한 량의 전술한 항생물질을 온혈동물에 투여해서 온혈동물의 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
BMG 162-aF2는 간균속(桿菌屬 : Bacillus)에 속하는 BMG 162-aF2 생산균주를 배지에서 배양하여 BMG 162-aF2를 생산 및 축적해서 수득된 배양액으로부터 BMG 162-aF2를 회수해서 얻을 수 있는 물질이다.
간균속에 속하는 BMG 162-aF2생산균주의 일예로서는 본 발명자들에 의해서 1978년 8월에 일본국 토치기(Tochigi)현의 타이헤이산(Mt. Taihei)에서 수집한 토양표본에서 단리해낸 간균 BMG 162-aF2의 균주가 있다.
BMG 162-aF2 균주의 배양 및 분류학적 특성을 다음에 설명한다.
1. 미시적 형태
BMG 162-aF2 균주는 일정치 않은 그램반응을 하고 또 통상크기가 0.6 내지 0.8×2 내지 3.5미크론으로 측정되는 포자와 간상체의 간균(桿菌)이다. 이는 또한 바깥쪽 편모를 갖고 있으며 또 능동적인 고유 운동성을 나타낸다.
이 포자는 그 우성위치가 중심부인 타원형이며, 또 크기가 0.5 내지 0.7×1.0내지 1.5 미크론이고, 그 간상체는 선명하게 팽윤된다. 포자는 그 측면부에 글러스탈 바이올렛으로서 카누우형상으로 잘 염색되는 부분(Parasporal body)을 갖고 있고, 또 내열특성이 있다. 포자는 항산성 염색으로 염색되지 않는다.
2. 각종 배지에서의 생육상태
영얄 젤라틴 천자(穿刺)배양을 제외한 모든 배양은 37℃에서 행하였다.
(1) 영향한천 평판(平板)배양 : 콜로니(colonies)등은 불투명하고, 둔하며 또 원형이었고, 또 이들 모서리는 불규칙적이며 또 갈색을 띤 백색이었다.
(2) 영양한천 사면(斜面)배양 : 사면에서 생장을 확산 증식하였고 또 그 표면은 불투명하고 건조된 것처럼 보였다. 생장체 색체는 갈색을 띤 백색이었다.
(3) 영양육즙배양 : 배지는 배양 1일째에 그 전체가 혼탁되었고, 또 제2일째에는 균막이 배지 표면에서 생장하기 시작하였다. 제3일째에는 균막이 배지표면을 덮었고 또 배지는 선명하게 되었으며 또 균체가 시험관 바닥에 침전하였다.
(4) 영양 젤라틴 천자(穿刺)배양 : 20℃에서 배양하는 경우, 배양 1일째 천자를 따라서 증식이 확인되었다. 배양 2일째에는 전술한 증식부가 함몰되기 시작하였다. 배지중의 젤라틴은 약 6일째부터 액화하기 시작하였다.
한편, 30℃에서 배양하는 경우, 균막은 제2일째부터 생장하기 시작하였고, 또 배지는 4일째부터 액화하기 시작하였다. 배지중의 젤라틴 액화는 제7일째에 완료되었다.
(5) BCP 밀크 배양 : 배양 5일째부터 브롬크레졸 피이플(BCP)이 청색으로 변색되었고 또 약 12일째부터는 펩톤화가 시작되었다.
(6) 사브로오드 포도당 한천배양과 사브로오드 포도당 육즙배양 : 사브로오드 포도당 한천(10g의 펩톱, 40g의 포도당, 15g의 한천 및 10000ml의 탈이온수로 구성되고, 또 pH를 조절하지 않았음)의 사면과 사브로오드 포도당 육즙(한천을 제외시킨 이외에는 상기와 동일물질로 구성됨)을 각각 30℃ 및 37℃에서 배양할때, 액체배지에서는 생장을 볼 수 없었으나, 경사배지에서는 사면의 하위부에 미세한 생장을 볼 수 있었다.
3. 생리적 특성
이후 특별히 기재하지 않는, 한배양온도는 37℃이다.
(1) 질산염의 환원 : 질산염 육즙배지(10g의 고기즙, 10g의 펩톤, 5g의 NaCl, 1g의 KNO3및 1000g의 탈이온수로 구성되고, pH 7.2임)에서 배양하면, 배양 제1, 제3 및 제5일째의 모든 배양액에서 아질산염을 검출하였다. 특히 배양 제5일째에 주목할만한 반응이 관찰되었고 또 배양액에 시약을 첨가해서 적갈색침전물이 생성되었다.
(2) 탈질소반응 : 탈질소반응 시험을 고마가다 등의 방법(T. Hasegawa, 미생물의 분류와 확인, 제223면 1975년 일본 동경대학 출판회 발행)으로 행한 결과 음성이었다.
(3) MR 검정 : 5g의 글루코오스, 7g의 펩톤, 5g의 NaCl 및 1000ml 탈이온수로 구성되고 pH 7.5인 배지에서 30℃로 배양하고 제1, 제2 및 제5일째에 각각 메틸레드(MR) 검정을 하였는데, 모든 경우에 양성이 었다.
(4) VP 검정 : 5g의 글루코오스, 7g의 헵톱, 5g의 NaCl 및 1000ml 탈이온수로 구성되고 pH 7.5인 배지에서 30℃로 배양하고 제1, 제2 및 제5일째에 Voges-Proskauer(VP) 검정을 하였는데, 모든 경우에 음성이 었다.
(5) 인들의 생성 : 20g의 폴리펩톤, 5g의 NaCl 및 1000ml 탈이온수로 구성되고 pH 7.4인 배지에서 배양하면 제1 내지 제2일째에는 인들의 생성을 확인할 수 없었으나 제5일째에는 이를 확인할 수 있었다.
(6) 황화수소의 생성 : TSI 한천(Tripe sugar iron agar : 고기추출물 3g, 이스트 추출물 3g, 펩톤 15g, 프로테오즈 펩톤 5g, 락토오즈 10g, 사카로오즈 10g, 텍스트로오즈 1g, 황산제 일철 0.2g, 염화나트륨 5g, 티오황산나트륨 0.3g, 한천 12g, 페놀레드 0.024 및 증류수 1l : pH 7.2) 배지에서 7일 동안 배양하였으나 황화수소의 생성을 확인할 수 없었다.
(7) 전분의 가수분해 : 0.2% 가용성 전분을 함유한 영양한천 평판에서 획선(劃線) 배양하고, 요오드-요오드 칼륨 용액에 의한 검정을 제1, 제2, 제3, 제5, 제6, 제13 및 제15일째에 행하였으나, 녹말의 다분해를 그 어느 곳에서도 확인할 수 없었다.
(8) 시트르산의 이용 : 5일동안의 koser 배지 및 시트르산염 christensen 한천배지에서 배양하였으나, 양쪽 배지 모두 생장을 관찰할 수 없었다.
(9) 생장을 위한 무기질소원의 이용 : 기본 배지[10g의 글루코오수, 1g의 KH2PO4, 0.5g의 MgSO4, 7H2O, 0.2g의 KCl 및 1000ml의 탈이온수로 구성되고 또 ph 7.2임]에 질소원[1g의 NaNO3, 0.78g의 (NH4)SO4또는 1.7g의 글루타민산나트륨]을 첨가해서 시험을 행한 결과 시험한 모든 질소원에서 생장을 관찰할 수 없었다.
(10) 색소의 생성 : King's A 한천배지(펩톤 20g, 염화마그네슘 1.4g, 황산암모늄 10g, 한천 15g 및 증류수 1l ; pH 7.2)에서 1야간 배양한 후 이 배양액을 실온으로 6일간 방치하고, 또 King's B 한천배지(펩톤 20g, 이 염기성 인산칼륨 1.5g, 황산마그네슘 1.5g, 한천 15g 및 증류수 1l : pH 7.2)에서 6일간 배양하였으나 두 경우 모두 가응성 색소를 관찰할 수 없었다.
(11) 요소분해효소 : 효소분해효소 배지(펩톤 2g, 요소 30g, 염화나트륨 5g, 일염기성 인산칼륨 9g, 이염기성 인산나트륨 3g, 페놀레드 0.01g 및 증류수 1l ; pH 6.2)에서 24일간 배양한 바, 결과는 요소분해효소 음성이었다.
(12) 산화효소 : 영양한천의 사면배지에서, 1야 배양한 신선한 균을 시토크롬 산화효소지(Nissui 회사제조)로 시험한 결과 양성 산화효소반응을 나타내었다.
(13) 칼탈라이제 : 영양한천의 사면배지에서 1야 배양한 신선한 균에 대해서는 3% 수성 과산화수소를 사용한 카말라아제 시험에서 기포가 생성되었으며 또 양성을 나타내었다.
(14) 생장 조건 : 살균후 pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 6.8, 7.8, 8.2 및 8.8의 영약육즙에서 24시간 시험한바, 생장은 pH 5.0 및 pH 8.2에서 관찰되었다. 생장을 위한 최적 pH는 pH 6.0-7.8이었다. 9°, 15°, 20°, 24°, 27°, 30°, 37°, 40°, 45° 및 50℃에서 각각 24시간 배양시켜 시험한바, 생장은 15℃와 40℃ 사이에서 관찰되었다. 생장의 최적온도는 37℃전후의 온도이었다.
(15) 산소의 효과 : 균액을 1% 글루코오스를 함유한 영양한천에 현탁시킨후 심층 한천으로 경화되게 배양하는 경우 배지표면과 그 부근에서 양호한 생장이 관찰되었따.
혐기성 조건하의 TEP 한천(식물추출물 7g, 이스트 추출물 5g, 고기추출물 3g, 펩톤 10g, 트립톤 10g, 간장(Soy) 펩톤 3g, 포도당 3g, 인산칼륨, 일염기성 2.5g, 염화나트륨 2g, L-시스테인. HCl 0.3g, 티오글리콜산 나트륨 0.3g, 한천 14g 및 증류수 1l : pH 7.2)에서 배양함으로서 생장이 관찰되었다.
(16) O-F 시험(hugh-Leifson 시험) : 호기성조건 및 혐기성조건중 어느 경우에도, 글루코오스을 분해하고 산을 생성하였다.
(17) 탄소화합물의 이용 : 탄소화합물의 이용을 Iizuka와 Komagata 방법(T. Hasegawa 저술, "미생물의 분류와 확인" 제230면, 동경대학 프레스, 1975년 발행)을 사용해서 시험하는 경우, 글루코오스, 글리세린 및 숙신산나트륨은 생장에 이용되었으나, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 파라히드록시 벤조산나트륨은 이용되지 않았다.
(18) 당으로부터 산 및 가스의 생성 : BMG 162-aF2 균주를 기본 배지[1g의 (NH4)2HPO4, 0.2g의 NaCl, 0.2g의 MgSo47H2O, 0.2g의 이스트 추출물 15g의 한천, 4ml의 0.2% 브로모크레졸 피이플수용액 및 1000ml 탈이온수로 구성되고 또 pH 7.2임]에 각 당류의 최종농도가 1%가 되도록 별도로 살균시킨 각종 당류를 무균상태로 첨가하고 또 그 후에 응고시켜서 제조한 사면배지에 각각 획선배양(劃線培養)하였다. 산의 생성을 40일간 조사하였다. 산은 D-글루코오스, D-만노오수, D-프록토오스, D-만니트, 말토오스, 트레할로오스 및 글리세린으로부터 생성되었으나, D-크실토오스, L-아라비노오스, D-가락토오수, 람노오스, D-소르비트, 이노시트, 락토오스, 슈크로오스, 라피노오스 및 스타치로부터는 생성되지 않았다.
한편, 가스의 생성을 기본배지(10g의 펩톤, 5g의 NaCl, 0.008g의 브롬티몰블루우 및 1000ml의 탈이온수로 구성되며 또 pH 7.2임)에 전술한 동일방법으로 각종 당류를 첨가한 후에 2주가 Durham 튜브를 사용하여서 조사하였다. 시험한 모든 당류에서 가스가 생성되지 않았다.
(19) 글루콘산의 산화시험 : 클루콘산염 배지(인산칼륨, 일염기성 2g, 황산마그네슘 0.5g, 염화나트륨 5g, 황산암모늄 0.5g, 글루콘산칼륨 10g 및 증류수 1 : pH 6.3)를 사용 글루콘산의 산화시험을 행한 결과 음성이었다.
(20) 디히드록시아세톤의 생성 : 10g의 이이스트추출물, 20g의 클리세린, 15g의 한천 및 1000ml의 탈이온수로 구성되고, 또 pH 7.0인 배지에서 3일, 5일, 10일 및 24일간 배양한 후에, 시험한 모든 경우에서 Fehling 시약에 의한 디히드록시아세톤의 생성을 관찰할 수 없었다.
(21) 염화나트륨의 내성 : 10g의 트립티케이스(트립티케이스, BBL) 및 탈이온수 1000ml로 구성된 pH 7.0의 기본 배지에 염화나트륨을 각 배지 중의 염화나트륨 농도가 2, 5 및 7%가 되게 첨가해서 제조한 배지들에 균주를 집중한 후, 정치배양하고 표면 배지에서의 균주증식을 4일간 관찰하였다. 그 결과 2% 염화나트륨의 기본 배지에서는 균주의 증식의 관찰되었으나, 2% 이상의 염화나트륨 배지에서는 생장이 관찰되지 않았다.
(22) 히푸르산(Hippuric acid)의 분해시험 : 10g의 히푸르산나트륨을 100ml의 심장 침출육즙(Difco)에 첨가해서 제조한 배지(pH 7.4)에서 4일간 배양한 후에, 염화제이철 용액을 사용해서 히프르산의 분해를 관찰하였다.
(23) 페닐피루브산(PPA) 시험 : 3g의 이스트 추출물, 2g의 DL-페닐알라닌, 1g의 NaHPO4, 5g의 NaCl, 12g의 한천 및 1000ml 탈이온수로 구성되고 또 pH 7.3인 사면배지에 두텁게 집중하고 또, 24시간 배양한 후에 실시한 10% 염화제이철용액을 사용한 시험은 음성이었다.
(24) 티로신의 용해성 시험 : 티로신 한천 배지 (100ml의 영양한천 및 5g의 티로신으로 구성되고 또 pH 7.2임)에서 30℃와 37℃로 배양하는 경우, 2 내지 4일 배양후에 티로신의 용해가 관찰되었다.
전술한 특성들을 요약하면 다음과 같이 기술될 수 있다. BMG 162-aF2 균주는 조건혐기성이며 또 그램 염색부정(染色不定)을 보이고 또 포자아포를 갖고 있는 간균(桿菌)으로 주편모(周鞭毛)를 가지고 있으며 운동성을 나타낸다. 포자아포는 중심이 있는 타원형이고 또 그 측면부에 크리스탈 바이올렛으로 카누우형상으로 잘 염색되는 부분(Parasporal body)을 가지고 있으며, 또 내열특성을 가지고 있다. 균체는 선명하게 팽윤되며 또 비향산성이고 그 균주는 한천 배지에서 확산 증식되고 액체 배지에서 균막을 형성한다.
또 젤라틴을 액화하고 BCP 밀크를 청새으로 변화시킨 후 펩톤화시킨다. 사브로오드 덱스트로스육즙에서는 생장을 관찰할 수 없었으나 사브로오드 덱스트로 한천배지에서는 약간의 생장이 관찰되었다. 질산염을 환원시키고, 또 탈질소반응은 음성이며, 또 MR 시험은 양성이고 그리고 VP 검정은 음성이다.
인돌은 제5일째에 검출되고, 황화수소는 생성되지 않았다. 녹말을 분해하지 않고 또 시트르산을 이용하지 않았다. 요소분해효소, 산화효소 및 카탈라아제 시험결과는 각각 음성, 양성 및 음성이다.
생장은 dH 5.0와 pH 8.2사이 범위내에서 관찰되며, 또 생장의 최적 pH는 6.0-7.8이 되어야 한다. 생장은 또한 15℃와 40℃의 범위내에서 관찰되며 또 최적생장은 또는 약 37℃이다.
생장은 또한 호기성 조건하에서 관찰된다. 글루코오스를 산화성 및 발효성 조건하에서 분해시켜서 산을 생성한다. 또 D-글루코오수, D-만노오스, D-프록토오수, D-만니트, 말토오스, 트레할로오스 및 글리세린으로부터 각각 산을 생성하지만 가스는 생성하지 않는다. 글루콘산을 산화하지도 않고 또 디히드록시 아세톤을 생성하지 않는다. 히푸르산 및 페닐알라닌을 분해하지 않고 또 티로신을 용해한다. 5% 이상의 염화나트륨 함유 배지에서는 생장이 관찰되지 않는다.
균주 BMG 163-aF2의 전술한 바와 같은 특성을 기준으로 이 균주가 간균 속, 특히 공통특성을 갖는 종(種)의 군(群)인 피르무스(firmus) 간균, 라테로스포러스(laterosporus)간균, 브레비스(Brevis) 간균 또는 스피리커스(Sphaericus) 간균에 속한다는 것을 알게되었다.
Bergey,s Manual of Determinative Bacteriology, 8판 제542면(R.E. Buchanan 및 N.E. Gibbons, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, 1974)에 기술된 바와 같이 카탈라아제 양성 및 디히드록시 아세톤을 수득할 수 없었다.
전술한 4개정(種)과 대조한 균주 BMG 162-aF2의 특성을 제1표에 수록하였다.
제1표에 수록된 바와같이, 균주 BMG 162-aF2는 라테로스포러스 간균과 극히 유사하다. 균주 BMG 162-aF2와 라테로스포러스 간균 간의 차이는 사브로오드 글루로오스 한천배지에서의 생장의 외관묘사에 있어서 단지 한가지만이 서로 상이하다는 것 뿐이다.
[제1표]( BMG 162-aF2 균주와 그 관련 종(種)과의 대조)
Figure kpo00002
a : E는 타원 또는 원통형 ; S는 구면 또는 거의 구면 ; C는 중심 ; T는 말단 또는 준말단 ; CT는 말단에 대해서 중심 ; 균주범의 또는 균주간변동 ; +는 균주의 90-100%가 양성 ; -는 균주의 90-100%가 음성 ; d는 반응이 상이하고, 균주의 11-89%가 양성 ; V는 1개 균주에서 이변성인 특징.
b : 실험결과
일본 국립 가축진료소의 Ryozo Azuma 박사가 제공한 라테포스포러스 간균의 균주를 본 발명의 발명자들이 검사하고 또 이를 본 발명 균주와 대비하였다.
그 결과, 본 발명자들은 전술한 2개 균주가 모두, 이 간균종의 탁월한 특성이라 할 수 있는 카누우 형상부(카누우형상으로 염색된 부분 : 파라스포랄체)를 포자이포 측면부에 가지고 있다는 것을 명백히 확인할 수 있었다. 그리고, 전술한 2개 균주들의 사브로오드-포도당 한천 배지에서의 생장이 상호 일치하였다.
이같은 관점에서 볼 때, 본 발명 균주 BMG 162-aF2는 라테로스포러스 간균 BMG 163-aF2라고 명명하였다.
이밖에, 이 BMG 162-aF2는 1979년 10월 12일자로 일본국 치바시 이나게 소재의 공업기술원 공인 기탁소인 "Fermentation Research Institute"에 기탁번호 RERM-P5230으로 기탁하였으며, 또 미합중국, 메틸란드, 로크빌, 파이크로운 드라이브 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 ATCC 31932로 1981년 7월 31일에 기탁하였다.
본 발명에서 사용할 수 있는 균주로는 전술한 균주, 그 변이주를 필두로 간균속에 속하며, BMG 162-aF2를 생산하는 모든 균주를 들 수 있다.
본 발명의 목적은 새로운 항생물질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이와같은 새로운 항생물질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유효성분으로 전술한 새로운 항생물질을 함유하는 새로운 항종양제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 온혈동물의 종양을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적들과 장점들이 다음의 설명에 의해서 명백하게 될 것이다.
전술한 균주들을 사용해서 BMG 162-aF2를 제조하는 방법을 다음에 설명한다.
BMG 162-aF2는 영양물질을 함유하는 배지중에서 간균속에 속하는 BMG 162-aF2 생산균주 또는 그 돌연변이체의 포자이포 또는 균체를 호기적으로 배양에서 제조할 수 있다.
일반적으로, 세균 배양에 통상적으로 사용되는 배지의 영양원은 본 발명의 영양원으로 사용될 수 있다. 예컨데, 시판되는 펩톤, 육추출물, 옥수수 침지액, 면실분, 땅콩분, 대두분 이스트 추출물, N-Z 아민, 카세인 가수분해물, 질산나트륨, 질산암모늄, 황산암모늄 및 그 유사체가 질소원으로서 사용될 수 있다. 시판되는 글리세린, 설탕, 녹말, 글루코오스, 말토오스, 당밀 및 기타 탄수화물과 지방 및 기름이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이밖에, 염화나트륨, 인산염, 탄산칼슘, 황산마그네슘 및 기타 무기염들을 배지의 염첨가물로 사용할 수 있다. 필요한 경우에는 다른 금속염 및 기타 물질들이 BMG 162-aF2 생산균주에 의해서 이용되고 또 BMG 162-aF2의 생산에 불리하지 않는 한, 이들 물질을 또한 극미량 첨가할 수도 있다. 세균 배양에서 공지된 영양물질은 어느 것이든지 이것이 BMG 162-aF2 생산용 BMG 162-aF2 생산균주에 의해서 동화될 수 있는 한예는 본 발명 방법에서 사용될 수 있다.
BMG 162-aF2를 대량 생산하는 데는 액체배양이 바람직하다. BMG 162-aF2 생산균주가 생장해서 BMG 162-aF2를 생산할 수 있는 온도라면 어느 것이나 본 발명 배양에서 사용될 수 있지만, 특히 바람직한 배양온도는 20℃ 내지 35℃의 범위이다.
배지의 pH 범위는 5.0 내지 8.2이고, 또 바람직한 pH 범위는 6.0 내지 7.8이다. 배양은 배지 또는 배양액에 충분한 량의 BMG 162-aF2가 생산 축적되는데 충분한 시간동안 계속한다. 예컨데 2.0% 글리세린, 2.0% 글루코오스, 1.0% 펩톤, 0.3% 이스트 추출물, 0.2% 탄산칼슘으로 구성된 액상배지(최적 pH는 약 7.4이다)를 제조 살균한 후, BMG 162-aF2 균주의 사면배양에서 수확한 포자아포와 균체를 접종하고 또 호기성 조건하의 27℃에서 회전식 진등배양을 한 경우에 BMG 162-aF2의 생산과 축적은 1일간의 배양으로 관찰되었다.
BMG 162-aF2의 분속은 공지의 항생물질분석에 통상적으로 사용하고 있는 표준 컵-플레이트(cup-plate)방법에 따라 서브틸리스(subtilis) PIC 219 간균을 시험생물로 사용해서 행할 수 있다.
간균속의 BMG 162-aF2 생산균주의 배양에는 전술한 진등배양 방법 이외에 통기교반배양에 일반적으로 사용하는 단지(far) 발효기 배양이나 또는 탱크배양 방법이 대량 생산용으로 사용된다. 대규모 배양인 경우에 전술한 액상배지는 20 내지 40시간의 진동배양에 의해서 배양되고 도 종자배지로서 0.5 내지 2.0%(융적)로 접종시키는 것이 바람직하다.
발효 배양여과액으로부터 BMG 162-aF2 회수는 활성기로서 카르복시산을 갖는 약한 양이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피 방법으로 행하였다. 약한 양이온 교환수지로서는, 엠비라이트 IRC-50
Figure kpo00003
및 CG-50
Figure kpo00004
(활성도가 전적으로 카르복시기에서 유래하는 양이온 교환수지의 상품명, Romn & Hass Co. 제조), Lewatit CNP
Figure kpo00005
(활성도가 카르복시산 술 폰산기에서 유래하는 양이온 교환수지의 상품명 Bayer Ltd. 제조), 또는 CM-Sephadex
Figure kpo00006
(Phatmacia Fine Chemicals 제조의 양이온 교환체, 카르복시메틸덱스트란의 상품명)이 H-형, Na-형, NH4-형 및 이들의 혼합형으로 이용될 수 있다.
수지에 흡착된 BMG 162-aF2는 염산, 아세트산 등과 같은 수산용액과 염화나트륨과 같은 염수용액으로 용리된다. 추출, 분리 및 정제방법으로서는, 수지를 사용한 전술한 방법들을 포함하는 겔 여과, 한외여과방법을 적당히 결합 또는 반복함으로서 순수한 형태의 BMG 163-aF2를 수득하는 방법이 있다.
유리염기 상태에서 불안정이기 때문에, BMG 162-aF2는 염산염으로 수득한다. 이것은 흡습성이기 때문에 수화물을 형성한다. BMG 162-aF2 하이드로클로라이드 수화물의 물리화학적 특성은 다음과 같다.
흡습성이 극히 크기 때문에 융점을 측정하기가 불가능하다.
[a]
Figure kpo00007
=-11°(c=1.0, 몰)을 나타낸다.
분석 : 실측치 : C 37.55, H 7.89, N 17.52, C 118.61
계산치 : (C17H37N7O4·3HCl·2H2O)
C 37.20, H 8.08, N 17.86, C 119.38
1H-NMR 스펙트럼은 제1도에 수록하였다.13C-NMR 스펙트럼은 제2도에 수록하였다.15N-NMR 스펙트럼은 제3도에 수록하였으며, 7개의 질소원자가 관측되었다(구아니딜기 중의 3개 질소원자는 2 피이크시그널로 관찰되었다). 자외선 흡스 스펙트럼은 말단(end) 흡수만을 가지고 있다. 적외선 스펙트럼은 제4도에 수록하였다.
BMG 162-aF2 하이드로클로라이드는 물과 메탄올에 쉽게 용해되지 않거나 또는 불용성이다. 이는 닌히드린, 사카구치(Sakaguchi) 및 리돈-스미스(Rydon-Smith) 반응에서 양성을 나타낸다. 부탄올-피리딘-아세트산-물(6 : 4 : 1 : 3) 및 부탄올-에탄올-물(4 : 1 : 2 )로서 전개되는 Avicel
Figure kpo00008
(미세결정질 셀룰로오스)를 사용한 박막 크로마토그래피에서 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드는 Rf=0.14 및 Rf=0.20에서 각각 단일 반점을 나타내었다. 포름산-아세트산-물(1 : 3 : 36)을 사용하는 고압종이 전기 영동법(3,500V, 15분)에서, BMG 162-aF2는 알라닌(1.00)에 대해서 1.70 내지 1.74의 상대이동도를 나타내었다.
BMG 162-aF2의 생물학적 특성은 다음에 수록하였다. 다음에 수록된 바와같이, BMG 162-aF2 하이드로클로라이드는 그램양성 및 음성세균에 대해서 단지 약한 억제활성을 갖고 있으며, 또 백혈병 L 1210, EL-4, 에롤리치 복수종양 및 육종(Sarcoma) 180의 쥐를 사용한 실험에서 현저한 치료 및 생종기간 연장 효과를 나타내었고, 또 본 발명의 항생물질이 항암제로서 유용하다는 것이 명백히 입증되었다.
(1) BMG 162-aF2의 항균활성. BMG 162-aF2는 약한 항균활성을 갖고 있으며, 또 영양한천에서 각종 세균에 대한 최제억제농도를 표 2-1 내지 2-3에 수록하였다. 시험은 BMG 162-aF2를 사용해서 한천 희석방법으로 진행하였다. 표 2-1에서와 같이, BMG 162-aF2는 그램양성과 음성세균의 발육을 약하게 억제한다.
[표 2-1]
항균활성
Figure kpo00009
사용 배지 : 영양한천
At 37℃에서
[표 2-2]
항균활성
Figure kpo00010
사용 배지 : 영양한천
At 27℃에서
[표 2-3]
항균활성
Figure kpo00011
사용 배지 : 영양한천 + 1% 글루코오스
At 27℃에서
(2) BMG 162-aF2의 항암 활성
(a) 쥐 백혈병 L1210에 대한 효과(ip-ip 시스템) 8마리의 CDG1쥐(암컷, 6 내지 7주령)로 구성된 1균의 쥐에 대해서, 105세포/0.25ml/L1210 쥐 백혈병 세포를 복강내에 접종시켰다. 24시간 후에, 식염수에 용해한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 9일간 계속적으로 1일 1회씩 복강내에 투여하고, 또 치사율과 생존기간 연장율을 측정하였다.
제3표에 수록한 바와 같이, BMG 162-aF2는 쥐 백염병 L1210에 대해서 치료효과와 생존기간 연장효과를 타나내었다.
[제3표]
쥐 별혈병 L1210에 대한 BMG 162-aF2의 효과(ip-ip 시스템)
Figure kpo00012
* 독성징후가 나타났다.
대조용의 평균 생존일수 : 8.2
(b) 일쥐백혈병 L1210에 대한 효과(sc-ip 시스템) 5마리의 CDF1쥐로 구성된 1군의 쥐(암컷, 6 내지 7주령)에 쥐 백혈병 세포 L1210(105세포0.25ml/쥐)울 복부에 피하주사하였다. 24시간 후에 9일간 계속적으로 1일 1회씩 식염수에 용해한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 복강내 투여하고, 치사율과 생존기간 연장율을 측정하였다.
제4표에 수록한 바와같이, BMG 163-aF2는 전술한 (a)의 실험과 같은 강력한 치료효과와 생존기간의 연장을 보여주었다.
[제4표]
쥐 밸혈병 L1210에 대한 BMG 162-aF2의 효과(ip-ip 시스템)
Figure kpo00013
대조용 쥐의 평균 생존일수 : 9.7일
(c) 쥐 별혈병 EL-4에 대한 효과
5마리의 C57BL/6 쥐로 구성된 1군의 쥐(암컷, 10주령)에 쥐 백혈병 세포 세포(105세포/0.25ml/쥐)를 복강내에 접종하였다. 24기간 후에 식염수에 용해한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 9일간 1일 1회씩 복강내에 계속적으로 투여하여 치료하고, 또 치사율과 생종기간 연장율을 측정하였다.
제5표에 수록한 바와같이, BMG 162-aF2는 EL-4에 대해서도 또한 치료효과와 생존기간의 연장을 나타내었다.
[제5표]
백혈병 EL-4에 대한 BMG 162-aF2의 효과
Figure kpo00014
대조용 쥐의 평균 생종일수 : 11.0일
(d) 쥐의 에르리히(Ehrlich) 복수종양에 대한 효과
4마리의 ICR 쥐로 구성된 1군의 쥐(암컷, 6주령)에 에르리히 복수종양 세포(2×106세포/0.25ml/쥐)를 복강내 접종하였다.
24시간 후에 식염수에 용해한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 9일간 계속적으로 1일 1회씩 복강내 주사하여 치료하였다.
제6표에 수록한 바와같이, BMG 162-aF2로 또한 에르리히 복수종양에 대해서도 항암효과를 나타내었다.
[제6표]
쥐의 에르리히 복수종양에 대한 BMG 162-aF2의 효과
Figure kpo00015
* 독성징후가 나타남.
대조용 쥐의 평균생존일수 : 13.8일
(e) 사르코마(Sarcoma) 180에 대한 효과
4마리의 ICR 쥐로 구성된 1군의 쥐(암컷, 6주령)에 쥐의 사르코마 180세포(2×106세포/0.25ml/쥐)를 복강내 접종하였다.
24시간 후에 식염수에 용해한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 9일간 계속적으로 1일 1회씩 복강내 주사하여 치료하였고, 또 생존기간 연장율을 시험하였다.
제7표에 수록한 바와같이, BMG 162-aF2는 사르코마 180에 대해서도 또한 항암효과를 나타내었다.
[제7표]
쥐의 사르코마 180에 대한 BMG 162-aF2의 효과
Figure kpo00016
* 독성징후가 나타남.
대조용 쥐의 평균 생존일수 : 13.8일
(3) BMG 162-aF2의 급성독성
BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 ICR 쥐(암컷, 4주령)의 정맥에 주사했을 때, LD50는 80mg/kg이상이었다. BMG 162-aF2의 물리화학적 및 생물학적 특성은 이미 상세히 설명하였다. 스페르미딘(spermidine)이 분자의 공통성분이들는 사실로 부면, BMG 162-aF2는 스트렙토마이세스 베트리실루스에 의해 생산된 브레오마이신 ; 노카르디아에 의해 생산된 LL-BM123β, γ1및 ℓ22; 바실무스 브레비스에 의해 생상된 에데니(edenine) ; 과 바실루스에 의해 생산된 라테로스포라민에 유사하다. BMG 162-aF2의 구조는 전술한 바와같이 이미 결정되었으며, 이 BMG 162-aF2의 구조는 명브레오마이신, LL-BMβ, γ1및 γ2에덴니과는 명백하게 그 구조가 상이하다. 이밖에, 라테로스포라민[1976년 발행, The Jounal of Antibiotics 제29권, 390-393면과는 적외선 스펙트럼, 알코올에 대한 용해성, 항세균성 스펙트럼이 구별되며, 라테로스포라민의 성분인 C6H13N3O로 구성된 Sakaguchi 양성물질이 BMG 162-aF2의 분해 생성물에 함유되지 않는다는 사실에서 상이하다. 그러므로 BMG 162-aF2는 신규한 항생물질임이 확인된다.
전술한 결과로부터, BMG 162-aF2는 육종(sarcoma) 및 기타 종양류는 물론 인체를 포함한 온혈동물의 백혈병에 특유한 항암효과를 나타내며, 또 비교적 낮은 독성을 갖음을 알 수 있으며, 따라서 BMG 162-aF2는 탁월한 항종양제로 사용될 수가 있다.
항종양제로 BMG 162-aF2를 사용하는 경우에 그 제조 및 투여방법으로는, 각종 공지의 방법이 사용될 수 있다. 즉, 투여방법으로는 주사, 경구 및 직장투여가 가능하다. 약제의 제제형으로는 주사제, 분말제, 과립제, 정제, 좌약 등이 사용된다.
약제를 제조하는 경우에 필요하다면 고체담체, 액체담체와 같은 모든 종류의 약제학적으로 허용되는 담체, 안정제, 방부제, 무통제, 유화제 등이 BMG 162-aF2에 무해인 한에는 모두 사용될 수 있다.
주사용 약제의 제법을 구체적으로 설명하면, BMG 162-aF2 바람직하게는 그 염산염과 같은 수용성염과 만니톨과 같은 당류를 증류수에 용해해서 작은 용기(바이알)에 넣거나, 또는 이 용액을 동결 건조한 후 투여시에 식염수 또는 증류수에 용해시켜서 주사용 용액을 만들어 사용한다.
약제에 있어서 함량비율은 제제상태에 따라서 광벌위하게 변화시킬 수 있으나, 일반적으로는 0.01 내지 100중량%, 바람직하게는 0.1 내지 70중량%위 BMG 162-aF2를 함유시키고 또 잔여 함량, 즉 0 내지 99.99중량%, 바람직하게는 99.9 내지 30중량%는 약제학적으로 허용되는 담체이다. 주사용 조성물인 경우에 함량비율은 다음과 같다.
BMG 162-aF2 0.1 내지 95.0중량%
당류 99.1 내지 5.0중량%
염화나트륨 0 내지 94.9중량%
BMG 162-aF2의 투여량은 증상에 따라서 달라지지만 0.01-800㎎/일/성인, 바람직하게는 0.1-600㎎/일/성인이 사용된다. 계속적으로 투약할 필요가 있는 경우에는, 1일 투여량을 감소시켜야만 한다.
BMG 162-aF2의 약제에서, BMG 162-aF2는 일반적으로 의료용으로 이용할 수 있는 염산염등과 같은 염형태로 사용된다.
본 발명은 다음의 실시예들로 설명되지만, 본 발명은 이들 실시예에만 국한되는 것은 결코 아니다.
[실시예 1]
2.0% 글리세린, 2.0% 덱스트린, 1.0% 간장 펩톤(Bacto Soyston, Difco 연구소 제품), 0.3% 이스트 추출물(Daigo-Eiyo-Kagaku 주식회사 제품), 황산암모늄 및 0.2% 탄산칼슘으로 구성된 pH 7.4의 5l의 액상배지를 500ml 용량의 Sakaguchi 플라스크에 125ml씩 넣었다. 살균후, 이 플라스크에 미리 준비한 1%의 종자배지 영양한천의 사면에서 배양한 라케로스포러스 간균 BMG 162-aF2(FERM-P5230, ATCC 31932)를 동일조성물의 배지에서 2일간 배양함을 접종하고 또 5일동안 28℃에서 배양하였다. 수득된 육즙 여과액(4,900ml)을 Amberlite IRC-50
Figure kpo00017
의 컬럼(500ml, 직경 5.2㎝)[Rohm & Hass 캄파니 제품, Na+형 및 H+형(7 : 3) 혼합물]에 주입하고, 또 활성성분을 흡착시켰다.
이 컬럼을 물로 세척하고, 또 활성성분을 2,000ml의 1.0N-HCl로 용리한 후 10N-NaOH를 사용 pH6으로 중하였다.
중화액을 4배 용적이 되게 물론 희석하고 또 CM-Sephadex C-25
Figure kpo00018
(Pharmacia Fine Chemicals, 물로 전처리해서 팽윤시킴)의 컬럼(400ml, 직경 4.3㎝)에 주입해서 여기에 활성화합물을 흡착시켰다. 활성성분을 0.3M-NaCl-H2O로 용리하였다.
활성분획을 감압하에서 건고시까지 농축하였다. 잔류물은 5ml의 메탄올로 용해한 후 여과해서 NaCl 결정을 제거하였다.
여과액은 Sephadex LH-20
Figure kpo00019
(유기용매로 겔 여과하는 넥스트란의 상품명 Pharmcia Fine Dhemical제품, 메탄올로 전처를하여 팽윤시킴)의 컬럼(445ml, 직경 2.6㎝)에 주입하고, 또 이 칼럼을 메탄올로 전개시켰다. 활성분획을 감압하에 건조시켜서 460㎎의 순수한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 백색분말로서 수득하였다.
[실시예 2]
2.0% 글리세린, 2.0% 덱스트린, 1.0% 간장 펩톤(Bacto Soystone
Figure kpo00020
, Difco 연구소 제품), 0.3% 이스트 추출물(Daigo-Eiyo-Kagaku 주식회사 제품), 0.2% 황산암모늄 및 0.2% 탄산칼슘으로 및 0.03% 소포용 실리콘유로 구성된 pH 7.4의 배지(10l)를 20분간 120℃로 살균한 30l 용량의 스테인레스 탱크에 장입하였다. 이어 BMG 162-aF2 생산균주, 라테로스 포러스 간균 BMG 162-aF2 FERM-P5230, ATCC 31932를 48시간 진탕 배양한 육즙 125ml를 냉각시킨 전술한 탱크에 무균상태하에서 접종하였다.
호기성 배양과 28℃ 교반(15L/분의 통기율과 350r.p.m의 교반기 속도로 출발했으며, 16시간 후에는 10L/분 및 350r.p.m.를 유지하였다)을 진행하였으며, 또 40시간 후에 수득된 9,500ml의 육즙여과액을 실시예 1과 실제적으로 동일한 방법으로 Amberlite IRC-50
Figure kpo00021
및 CM-Sephadex C-25
Figure kpo00022
의 컬럼크로마토그래피로 처리하였다.
CN-Sephadex C-25
Figure kpo00023
의 컬을 4l의 0.3M-NaCl-H2O로 전개시켰다. 또 290적의 용리액을 1개부분으로 수집하고, 2개의 활성분획 : I(부분번호 14-93), Ⅱ(부분번호 64-154)로 분리하였다.
280nm 파장을 흡수하는 물질을 함유하지 않는 활성분획 Ⅱ, 1,660ml에 활성성분을 흡착하도록 33g의 활성탄을 첨가하였다. 활성탄을 수세한후, BMG 162-aF2를 80% 메탄올-물중의 0.5N-HCl 500ml로 용리하였다. 이 용리액을 Amberlite IR-50
Figure kpo00024
(Rohm & Hass 캄파니, OH-형)으로 중화하고, 또 감압하에 건조시켜 305g의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 수득하였다.
280nm 파장을 흡수하는 물질을 함유하는 활성분획 I을 농축건조시키고 메탄올로 추출한 후 1l의 탈이온수로 용해하고, 또 O-1M-NaCl(4)을 사용하는 경사용리(傾斜溶離)를 수반하는 CM-Sephadex C-25
Figure kpo00025
의 컬럼(400ml, 직경 4.3㎝)으로 재차 크로마토그래피 분리를 행해서 활성분획을 수득하고, 또 이를 농축 건조시켰다. 잔류물은 메탄올로 추출하고 또 Sephadex LH-20
Figure kpo00026
의 컬럼(780ml, 직경 2.8㎝)에 주입하였다. 이 컬럼을 메탄올로 전개하여 NaCl을 유리시켜서 670mg의 순수한 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 수득하였다. 전체적으로, 975mg의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 회수하였다.
[실시예 3.]
1ml의 메탄올로 용해한 실시예 2에서 수득한 150mg의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 함유한 용액에 1ml의 포화 피크산-메탄올 용액을 첨가하고 또 가열 비등시켰다. 농축후에, 잔류물을 벤제과 에탄올로 세척해서 과잉 피크르산을 제거하고 62mg의 BMG 162-aF2 피크레이트 결정을 물-에탄올 혼합물 용액으로부터 수득하였다.
[실시예 4.] 주사제
실시예 1에서 수득한 30 중량부의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 정제수 970부로 용해하고 또 Millipore 여과기 GS 형을 사용 여과해서 세균유리용액을 만들었다. 이 여과액(1g)을 10ml 용량의 바이알에 옮기고, 또 동결 건조해서 30mg의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드를 함유하는 동결 건조 주사제를 수득하였다.
[실시예 5.] 과립제
실시에 1에서 수득한 50 중량부의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드, 600 중량부의 락토오스, 330 중량부의 크리스탈린 셀룰로오스 및 20 중량부의 히드록시 프로필 셀룰로오스를 충분히 혼합하고 회전압축기(Roler-compactor
Figure kpo00027
)를 사용하여 압축하고 또 분쇄하여 과립을 만들고 16 메시 내지 60 메시 크기로 사별하였다.
[실시예 6.] 정제
실시예 1에서 수득한 30 중량부의 BMG 162-aF2 하이드로클로라이드, 20 중량부의 크리스탈린 락토오스, 147 중량부의 크리스탈린 셀룰로오스 및 3 중량부의 스테아린산 마그세슘을 V-형상 혼합기를 사용해서 혼합하고 또 300mg의 BMG 162-aF2를 함유하는 정제를 수득하였다.

Claims (10)

  1. 래터로스포러스 간균속(Bacillus Laterosporus)의 BMG -aF2(FERM-P5230, ATCC 31932)를 배양해서 BMG 162-aF2를 생산 축적하고 이 배양물로부터 구조식(Ⅰ)의 항생물질 BMG 162-aF2를 회수하는, 항생물질 BMG 162-aF2를 제조하는 방법.
    Figure kpo00028
  2. 제1항에 있어서 배지가 질원소, 탄소원 및 무기염을 함유하는 항생물질 BMG 162-aF2를 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 배양을 충분한 양의 BMG 162-aF2를 축적하는데 충분한 시간 PH 5.0 내지 8.2, 15° 내지 40℃의 액상 배양액 중에서 호기적으로 진행시키는 항생물질 BMG 162-aF2를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서 배지로부터의 BMG 162-aF2의 회수를 활성기로서 카르복시산을 갖는 약한 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그라피 처리로 진행시키는 항생물질 BMG 162-aF2를 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 수지에 흡착된 BMG 162-aF2를 산수용액 또는 염수용액으로 용리시키는 항생물질 BMG 162-aF2를 제조하는 방법.
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