DK157890B

DK157890B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotikum, bmg162-af2, eller et pharmaceutisk acceptabelt salt deraf

Info

Publication number: DK157890B
Application number: DK394281A
Authority: DK
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Hiroshi Naganawa; Hironobu Iinuma; Setsuko Kunimoto
Original assignee: Zaidan Hojin Biseibutsu
Priority date: 1980-09-08
Filing date: 1981-09-07
Publication date: 1990-02-26
Also published as: AU7489281A; CH655498B; GB2084999A; CS226036B2; GB2084999B; HU188077B; IT1209896B; US4474880A; KR830007834A; CA1175763A; DE3134353A1; DE3134353C2; JPS5748957A; IT8149237A0; ES505256A0; NL8104069A; AU523222B2; SE8105079L; AT376239B; DK394281A

Description

i

DK 157890 B

o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotikum/BMG162-aF2/ med formlen 5 nh2

XC-NH-(CKp).,-CH-CHp-CO

II 2 4 I 2 I

NH OH NH

10 f-0H

CO-NH-(0¾ ) ( 0¾ ) 3-NHg 15 eller et pharmaceutisk acceptabelt salt deraf, hvilket antibiotikum er aktivt ved behandling af tumorer hos varmblodede dyr.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

20 Den BMG162-aF2-producerende stamme. Bacillus late- rosporus, BMG162-aF2 FERM-P 5230, ATCC 31.932, er isoleret fra en jordprøve, opsamlet ved Mt. Taihei i Tochigi-præfekturet i Japan i august 1978 af opfinderne.

BMG162-aF2-stammens dyrkhingsmæssige og taksonomiske 25 kendetegn er beskrevet nedenfor.

1. Mikroskopisk morfologi BMG162-aF2-stammen er en bakterie, der udviser foranderlig Gram-reaktion og er en stavformet sporedanner, der i reglen måler 0,6-0,8 x 2-3,5 Ji i størrelse. Den har late-30 rale flageller og udviser aktiv bevægelighed. Sporen er ellipseformet, og dens overvejende stilling er central, og den måler 0,5-0,7 x 1,0-1,5 ji, og staven er tydelig kvældet. Sporen har i sin sidedel et afsnit (parasporalt legeme), der farves godt i kanoform med krystalviolet og er varmebestan-35 2

O

DK 157890B

digt. Sporen farves ikke med syrefast farve.

2. Karakteristika ved vækst på forskellige dyrkningssubstrater (1) På en plade af agarsubstrat: Kolonier er uigennemsigtige, matte og runde af form, og deres kant er uregel- 5 mæssig-1, 0g- de er brunlighvide.

(2) På skråtstillet agarsubstrat: Væksten er diffus og multipliceres på skråagarens overflade, som synes uigennemsigtig og tør. Vækstens farve er brunlighvid.

(3) Ί bouillonsubstrat: Dyrkningssubstratet bliver 10 uklart over det hele på den første inkubationsdag, og på den anden dag begynder en hinde at vokse på overfladen. På tredje dag har hinden bredt sig til hele overfladen, og substratet bliver klart, og myceliet bundfældes i bunden af reagensglasset.

15 (4) På gelatinesubstratstik: Ved inkubering ved 20°C fremkommer formering langs stikket på første dag. På anden dag begynder fordybning i dette formeringsafsnit. Gelatinen i substratet begynder at blive flydende fra ca. 6. dag. Når der derimod inkuberes ved 30°C, begynder en hinde 20 at gro på anden dag, og substratet begynder at blive flydende på den fjerde dag. Gelatinen i substratet er helt flydende på 7. dag.

(5) På BCP-mælk: Pra ca. 5. dags inkubation slår bromcresol-purpur (BCP) om til blåt, og fra ca. 12. dag be- 25 gynder peptonisering.

(6) På Sabouraud-dekstroseagar og i Sabouraud-deks-trosebouillon: / På skrå Sabouraud-dekstrose agar (indeholdende 10 g pepton, 40 g dekstrose, 15 g agar og 1000 ml afioniseret vand, pH ikke indstillet) og i Sabouraud-dekstrosebouil- 30 Ion (indeholdende samme stoffer som ovenfor, med undtagelse af agar) ved 30 og 37°C iagttages ingen vækst i flydende substrat, og svag vækst forekommer på skrå-agaren i dens nederste del.

3. Fysiologiske egenskaber 35 Medmindre andet er specielt anført, er inkubations temperaturen 37°C.

3

O

DK 157890 B

(1) Nitratreduktion: På et substrat af nitratbouil lon (indeholdende 10 g kødekstrakt, 10 g pepton, 5 g NaCl, 1 g KNO^ og 1000 ml afioniseret vand, idet pH er 7,2) påvises nitrit i hele dyrkningssubstratet på 1., 3. og 5. inku-5 bationsdag. På 5. dag iagttages specifikt kendelig reaktion, og når der tilsættes et reagens til dyrkningssubstratet, fremkommer et rødligbrunt bundfald.

(2) Afnitrificeringsreaktion: Når der foretages en afnitrificeringsreaktionsprøve ved hjælp af den af Komagata 10 m.fl. i T. Hasegawa "Taxonomy and Identification of Microorganisms", side 223, The University of Tokyo Press, 1975, beskrevne metode, er resultatet negativt.

(3) MR-prøve: På et dyrkningssubstrat indeholdende 5 g glukose, 7 g pepton, 5 g NaCl og 1000 ml afioniseret 15 vand,-hvor pH er 7,5 ved 30°C foretages en methylrødt-prøve (MR) på 1., 2. og 5. dag , og denne er positiv i alle tilfælde .

(4) VP-prøve: På et dyrkningssubstrat indeholdende 5 g glukose, 7 g pepton, 5 g NaCl og 1000 ml afioniseret vand, 20 hvor pH er 7,5, ved 30°C foretages en Voges-Proskauer-(VP)-prøve på 1., 2. og 5. dag, og denne er i alle tilfældene negativ.

(5) Indoldannelse: På et dyrkningssubstrat indeholdende 20 g polypepton, 5 g NaCl og 1000 ml afioniseret vand, 25 hvor pH er 7,4, iagttages på 1. og 2. dag ingen indoldannelse, derimod på 5. dag.

(6) Dannelse af hydrogensulfid: På TSI-agar (tredobbelt sukker-jernagar: kødekstrakt 3g, gærekstrakt 3 g, pepton 15 g, proteosepepton 5 g, lactose 10 g, saccharose 30 10 g, dekstrose 1 g, ferrosulfat 0,2 g, natriumchlorid 5 g, natriumthiosulfat 0,3 g, agar 12 g, phenolrødt 0,024 g og destilleret vand 1 liter, pH 7,2) iagttages i et tidsrum på 7 dages inkubation ingen dannelse af hydrogensulfid.

(7) Stivelseshydrolyse: På en plade af agarsubstrat 35 indeholdende 0,2% opløselig stivelse gennemføres stregkultur, og afprøvning med iod/kaliumiodopløsning sker på 1., 2., 3., 5., 6., 13. og 15. dag; der iagttages ikke i noget tilfæl 4

O

DK 157890B

de nedbrydning af stivelse.

(8) Udnyttelse af citronsyre: På Koser citratsubstrat og- Christensen-agar i 5 dage iagttages ingen vækst på disse substrater.

5 (9) Udnyttelse af uorganiske nitrogenkilder til vækst: Der afprøves ved at tilsætte nitrogenkilderne (1 g NaNO.j/ 0,78 g (NH^^SO^ eller 1,7 g natriumglutamat) til grundsubstratet (indeholdende 10 g glukose, 1 g K^PO^, 0,5 g MgS04.7H20, 0,2 g KC1 og 1000 ml afioniseret vand, idet 10 pH er 7,2) , og der iagttages ingen vækst i nogen af de afprøvede nitrogenkilder.

(10) Pigmentdannelse: Efter inkubation natten over

på King's A-agar (20 g pepton, 1,4 g magnesiumchlorid, 10 g ammoniumsulfat, 15 g agar og 1 liter detstilleret vand, pH

15 7,2) får kulturen lov at stå ved stuetemperatur i 6 dage, og på King's B-agar (20 g pepton, 1,5 g dibasisk kaliumphos-phat, 1,5 g magnesiumsulfat, 15 g agar og 1 liter destilleret vand, pH 7,2) i 6 dage; der iagttages intet opløseligt pigment i noget af tilfældene.

20 (11) Urease: På urease-substrat (2 g pepton, 20 g urinstof, 5 g natriumchlorid, 9 g monobasisk kaliumphosphat, 3 g dibasiskr natriumphosphat, 0,01 g rød phenol og 1 liter destilleret vand, pH 6,2) i 24 timer er resultatet ureasene-gativt.

25 (12) Oxidase: Frisk dyrkning på skråtstillet agar substrat natten over viser positiv oxidasereaktion med "Cytochrome" oxidasepapir (fremstillet af Nissui Co.).

(13) Catalase: Frisk dyrkning på skråtstillet agarsubstrat natten over danner skum og er positiv ved catalase- 30 prøve med 3%'s vandig hydrogenperoxid.

(14) Vækstbetingelser: Afprøvet i 24 timer på bouillon ved pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 6,8, 7,8, 8,2 og 8,8 efter sterilisering iagttages vækst ved pH 5,0 til 8,2. Optimal pH for vækst er pH 6,0-7,8. Afprøvet ved 9, 15, 20, 24, 35 27, 30, 37, 40, 45 og 50°C i 24 timers inkubation iagttages vækst mellem 15 og 40°C. Optimal temperatur for vækst er i nærheden af 37°C.

DK 157890 B

O

5 (15) Oxygens virkning: Når kulturen suspenderes i agarsubstrat indeholdende 1% glucose og størkner på et dybt lag agar, iagttages god vækst rundt om på substratets overflade. På TEP-agar (7 g planteekstrakt, 5 g gærekstrakt, 5 3 g kødekstrakt, 10 g pepton, 10 g tripton, 3 g sojapepton, 3 g dekstrose," 2,5 g monobasisk kaliumphosphat, 2 g natrium-chlorid, 0,3 g L-cystein-HCl, 0,3 g natriumthioglycollat, 14 g agar og 1 liter destilleret vand, pH 7,2) under anaerobe betingelser, iagttages vækst.

10 (16) O-F-prøve (Hugh-Leifson-prøve): Både under aerobe og anaerobe betingelser nedbrydes glukose og der dannes syre.

(17) Udnyttelse af carbonkilder: Når udnyttelsen af carbonforbindelser undersøges ved hjælp af Ii'zuka og Ko-.jg magatas metode (T-Hasegawa, "Taxonomy and Identification of Microorganisms", side 230, The University of Tokyo Press, 1975) udnyttes glukose, glycerin og natriumsuccinat til væksten, medens natriumacetat, natriumcitrat og natriumparahy-droxybenzoat ikke udnyttes.

20 (18) Syre- og gasdannelse fra sukkerforbindelser: BMG162-aF2-stamme stregdyrkes på skråtstillet substrat, der fremstilles ved sterilt at tilsætte forskellige sukkerforbindelser, der er steriliseret separat, til grundsubstratet (indeholdende 1 g (NH4)2HP04, 0,2 g NaCl, 0,2 g MgS04.7H20, 0,2 25 9 gærekstrakt, 15 g agar, 4 ml 0,2%’s vandig opløsning af bromeresolviolet og 1000 ml afioniseret vand, hvor pH er 7,2) ved 1% af slutkoncentrationen af hver sukkerforbindelse og derefter lade det størkne. Syredannelsen undersøges over et tidsrum på 40 dage. Der dannes syre fra D-glucose, D-mannose, 30 D-fructose, D-mannit, maltose, trehalose og glycerin, men ikke fra D-xylose, L-arabinose, D-galactose, rhamnose, D-sorbit, inosit, lactose, saccharose, raffinose og stivelse.

Også gasdannelsen undersøges ved anvendelse af et Durham-glas efter tilsætning af forskellige sukkerforbindel-35 ser på samme måde som nævnt ovenfor til grundsubstraterne (indeholdende 10 g pepton, 5 g NaCl, 0,008 g bromthymolblåt og 1000 ml afioniseret vand, idet pH er 7,2), over et tids 6

O

DK 157890B

rum på 2 uger. Der dannes ingen gas fra nogen af de afprøvede sukkerforbindelser.

-(19) Oxidationsprøve med gluconsyre: Ved hjælp af "Gluconaf'-substrat (2 g monobasisk kaliumphosphat, 0,5 g 5 magnesiumsulfat, 5 g natriumchlorid, 0,5 g ammoniumsulfat, 10 g kaliumgluconat og 1 liter destilleret vand, pH 6,3) * giver prøven et negativt resultat.

(20) Dannelse af dihydroxyacetone: Efter inkubation af dyrkningsmediet indeholdende 10 g gærekstrakt, 20 g gly- 10 cerin, 15 g agar og 1000 ml afioniseret vand, hvor pH er 7,0, i 3, 5, 10‘og 24 dage iagttages ingen dannelse af dihydroxyacetone i nogen af tilfældene, der afprøves med Fehling's reagens .

(21) Modstandsevne over for natriumchlorid: Efter 15 at stammen er inokkuleret i dyrkningssubtratet, der er fremstillet ved at tilsætte natriumchlorid til grundsubstratet indeholdende 10 g trypticase ("Trypticas", BBL) og 1000 ml afioniseret vand, pH 7,0, så at natriumchloridkoncentrationen i hvert substrat er 2, 5 og 7%, iagttages stammens formering 2o på overfladekulturen i et tidsrum på 4 dage. I grundsubstratet med 2% natriumchlorid iagttages stammens formering, men ved en koncentration på over 2% natriumchlorid iagttages ingen vækst.

(22) Sønderdelingsprøve i hippursyre: Ved inkube-25 ring på substrat (pH 7,4) fremstillet ved at tilsætte 10 g natriumhippurat til 1000 ml Heart-infusionsbuilion ("Difco") i 4 dage iagttages sønderdeling af hippursyre ved anvendelse af ferrichloridopløsning.

(23) Prøve med phenylpyrudruesyre (PPA): Efter 30 tæt inokulering på skråtstillet substrat indeholdende 3 g gærekstrakt, 2 g DL-phenylalanin, 1 g NaHPO^, 5 g NaCl, 12 g agar og 1000 ml afioniseret vand ved pH 7,3 og derefter in-kubering i 24 timer er prøven ved anvendelse af 10%'s ferrichloridopløsning negativ.

35 (24) Opløsningsprøve med tyrosin: Ved inkubering på tyrosinagar (indeholdende 1000 ml agarsubstrat og 5 g tyrosin, pH 7,2) ved 30 og 37°C iagttages opløsning af tyrosin

DK 157890 B

7 efter 2 og 4 dages inkubation.

Ved opsummering af de ovennævnte egenskaber bemærkes følgende: BMG162-aF2-stammen er en bakterie, der er fakultativ 5 anaerobisk og udviser skiftende Gram-reaktion, og som har sporer og laterale flageller og altså udviser en vis bevægelighed. Sporen er elliptisk og central og har i siden et afsnit (Parasporallegeme), der farves godt i kanoform med krystalviolet og er varmebestandig. Stavene er klart kvældede 10 og ikke syrebestandige, og stammen breder sig og formerer sig på agarsubstrat og danner hinde i flydende dyrkningssubstrat. Den gør gelatine flydende og peptoniserer BCP-mælk, efter at mælken er blevet blå. Der iagttages ingen vækst på Sabouraud-dekstrosebouillon, men der iagttages svag vækst 15 på Sabouraud-dekstroseagar. Den reducerer nitrat, og deni-trificeringsreaktionen er negativ, og MR-prøve er positiv, medens VP-prøve er negativ. Der påvises indol på 5. dagen, og der dannes intet hydrogensulfid. Den nedbryder ikke stivelse og udnytter ikke citronsyre. Resultaterne af urease-, 20 oxidase- og catalase-prøver er henholdsvis negativ, positiv og negativ. Vækst iagttages inden for et pH-interval på 5,0-8,2, og den optimale pH-værdi for vækst er 6,0-7,8. Der iagttages også vækst inden for et temperaturinterval fra 15 til 40“C, hvor den optimale temperatur for vækst er ved ca.

25 37°C. Der iagttages ligeledes vækst under aerobe betingelser.

Den nedbryder glucose under oxiderende og fermenterende betingelser og danner syre. Den danner syre men ingen gas fra D-glucose, D-mannose, D-fructose, D-mannit, maltose, trehalose og glycerin. Den oxiderer ikke gluconsyre og danner 30 heller ikke dihydroxyacetone. Den nedbryder ikke hippursyre og phenylalanin men opløser tyrosin. Der iagttages ingen vækst i dyrkningssubstrat med mere end 5% natriumchlorid.

På basis af ovenstående karakteristika for stammen BMG162-aF2 bemærkes det, at denne stamme tilhører slægten 35 Bacillus og især ligner Bacillus firmus, Bacillus laterospo-rus, Bacillus brevis eller Bacillus sphaericus, der er en

DK 157890B

δ artsgruppe med fælles karakteristika: catalase-positiv og ingen dihydroxyacetoneproduktion som beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udg., side 542 (R.E. Buchanan og N.E. Gibbons, The Williams & Wilkins Com-5 pany, Baltimore, 1974). Karakteren af stammen BMG162-aF2 vises i tabel I i sammenligning med de ovennævnte fire arter.

' Som det fremgår af tabel I, ligner stammen BMG162- aF2 meget Bacillus laterosporus. Forskellen mellem stammen BMG162-aF2 og Bacillus laterosporus ligger hovedsagelig i 10 beskrivelsen af vækstens udseende på Sabouraud-glucoseagar.

15 20 25 30 35

O

DK 157890B

9

Tabel I

Sammenligning mellem BMG162-aF2-stammen og dermed beslægtede arter B-fir- B.latero- B. bre- B.sphae- BMG162- 5 _mus_sporas_vis_ricus_-aF2_

Spore

Form Ea E E S elliptisk

Udvikler klart spo- - + + + + rangium

10 Dcminerende stilling C C CT T C

Dannelse fra glucose af

Syre +(svag) + + el. - +

Gas

Acetoin - 15 Stave

Bredde, pm 0,6-0,9 0,5-0,8 0,6-0,9 0,6-1 0,6-0,8 Længde, jim 1,2-4 2-5 1,5-4 1,5-5 2-3,5

Gram-reaktion + d&v d&v d&v d&v

Let farvelig del på + (t)*5 - - + 20 sporens ene side

Bevægelighed d + + + +

Væksttanperatur °C

Maksimum 40-45 35-50 40-60 30-45 40

Minimum 5-20 15-20 10-35 5-15 15 25 Syre fra

Arabinose og xylose d

Mannitol + + d - +

Hydrolyse af stivelse + Vækst i 30 Anaerob agar + - - + 7% NaCl + - - d - 3d -

Sabour. dekstrose b. - -(+)° d d +

Sabour. dekstrose ag. -

Produktion af alk. re- + + 35 akt. i V-P-bouillon ife)

Indoldannelse d - - + N03~ til N02” + + d - +

10 DK 157890 B

O

Tabel I (forts.) B.flr- B.latero- B-bre- B.sphae- BMG162- _mas_sporus_vis_ricus -aF2

Nedbrydning af 5 Casein + + + d +

Tyrosin d + + +

Deaminering af phenylalanin_d_-_-_+_- a: E = elliptisk eller cylindrisk, S = sfaarisk eller næsten, 10 C = central, T = endestillet eller delvis endestillet, CT = central til endestilletvariationer indenfor eller mellem stammer, + = positiv for 90-100% af stammer, - = negativ for 90-100% af stammer, d = reaktionerne forskellige, positiv for 11-89% af stammer, v = karakter uens inden for én 15 stamme.

b: Forsøgsresultat jfe) Ved 5 dages dyrkning.

Opfinderne har undersøgt og sammenlignet en stamme 20 af Bacillus laterosporus fra National Institute of Animal Health, Japan, med den foreliggende stamme, og resultatet heraf er, at begge stammer har et kanoformet legeme (et afsnit farvet i kanoform, parasporalt legeme) på siden af deres sporer, hvilket er et bemærkelsesværdigt træk ved denne 25 art. Væksten af begge stammer på Sabouraud-dekstroseagar falder sammen. I betragtning heraf betegnes stammen BMG162--aF2 som Bacillus laterosporus BMGl62-aF2.

Desuden blev denne BMG162-aF2-stamme den 12. oktober 1979 deponeret i det autoriserede japanske "Fermentation 30 Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Inage, Chiba-City, Japan, under deponeringsnummeret FERM-P 5230 og derefter den 31. juli 1981 i American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA med nummeret ATCC 31932. Deponeringen er foretaget i 35 overensstemmelse med Budapesttraktaten.

DK 157890B

11 o

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede antibiotikum har antitumor-virkning og kan anvendes som aktivt stof i antitumorpræparater, der kan anvendes til behandling af tumorer hos varmblodede dyr.

5 Fremgangsmåden til fremstilling af BMG162-aF2 ved hjælp af ovennævnte stamme vil blive beskrevet nedenfor.

På tegningen viser fig. 1 ^I-NMR-spektret for BMG-162-aF2-hydrochlorid i (CD3)2SO, hvor tetramethylsilan anvendes som intern standard (100 MHz), 13 10 fig. 2 viser C-NMR-spektret for BMGk62-aF2-hydro- chlorid i D20, hvor tetramethylsilan anvendes som ydre standard (25 MHz), 15 fig. 3 viser N-NMR-spektret for BMG162naF2-hydro-15 chlorid i D20, hvor NH^ NO^ anvendes som ydre standard (10 15 MHz), og fig. 4 viser det.infrarøde absorptionsspektrum for BMG162-aF2-hydrochlorid i kaliumbromid.

Ved dyrkningen kan næringsstoffer i substrater, der almindeligvis anvendes til dyrkning af almindelige 20 bakterier, anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Således ’er i handelen værende pepton, kød ekstrakt, maj s støbevæske, bomuldsfrømel, jordnøddemel, sojabønnemel, gærekstrakt, N-Z-amin, hydrolysat af casein, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og lignende anvendelige nitrogenkilder. I han-25 delen værende glycerin, saccharose, stivelse, glucose, malto se, melasse og andre carbonhydrater samt fedt og olie er anvendelige carbonkilder. Yderligere kan der som saltadditiv i substratet anvendes natriumchlorid, phosphater, calciumcar-bonat, magnesiumsulfat og andre uorganiske salte. Der kan 30 også tilsættes andre metalsalte eller andre salte i spormængder, om nødvendigt, hvis de udnyttes af den BMG162-aF2-producerende stamme og de ikke er skadelige for produktionen af BMG162-aF2. Alle de næringsstoffer, der er kendt til dyrkning af bakterier, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge op-35

O

DK 157890B

12 findelsen, når de blot kan assimileres af den BMG162-aF2--producerende stamme til produktion af BMG162-aF2.

Til fremstilling af BMG162-aF2 i stor målestok foretrækkes dyrkning i væske. Der kan anvendes en hvilken som 5 helst temperatur, ved hvilken den BMG162-aF2-producerende stamme er i stand til at vokse og producere BMG162-aF2, til ' dyrkningen, men en særlig foretrukket inkubationstemperatur ligger i intervallet 20-35°C. Substratets pH-værdi er 5,0- 8,2, fortrinsvis 6,0-7,8. Dyrkningen fortsættes i tilstræk-10 kelig lang tid til at der kan produceres og akkumuleres en tilstrækkelig mængde BMGl62-aF2 i dyrkningsmediet eller bouillonen. Således iagttages der produktion og akkumulering af BMG162-aF2 efter en dags inkubation, når der fremstilles et flydende dyrkningssubstrat indeholdende 2,0% glycerin, 2,0% 15 glucose, 1,0% pepton, 0,3% gærekstrakt, 0,2% calciumcarbonat (den bedst egnede pH-værdi er ca. 7,4) og dette substrat steriliseres, efterfulgt af inokulering med sporer og stave høstet fra en skrå-kultur af BMG162-aF3-stammen og ved roterende rystedyrkning ved 27°C under aerobe betingelser.

20 Afprøvning for BMG162-aF2 kan foretages med Bacil lus subtilis PCI 219 som prøveorganisme ved hjælp af en standard skål-plade-metode, som almindeligvis anvendes til afprøvning af kendte antibiotika.

Ved dyrkningen af en BMG162-aF2-producerende stamme 25 af slægten Bacillus anvendes foruden den ovennævnte rystedyrkning også dyrkning i krukker eller dyrkning i tank, som almindeligvis anvendes til iltnings-omrøringsdyrkning, til produktion i stor målestok. Når det drejer sig om dyrkning i industriel målestok/dyrkes det ovennævnte flydende 30 substrat ved 20-40 timers ryste-dyrkning og inokuleres fortrinsvis ved 0,5-2,0 volumenprocent som podningssubstrat.

Udvinding af BMGl62-aF2 fra det fermenterede bouillonfiltrat kan udføres ved hjælp af søjlechromatografi ved anvendelse af en svag kationisk ionbytterharpiks, der har carb-35 oxylsyre som den aktive gruppe. Som den svage kationbytter-harpiks kan anvendes "Amberlite IRC-50'® og "CG-50'® (varemærker for kationbytterharpikser, hvor aktiviteten udeluk-

DK 157890 B

O

13 kende skyldes carboxylgruppen, og som fremstilles af Rohm &

Haas Co.), "Lewatit CNP"® (varemærke for en kationbytterhar-piks, hvor aktiviteten skyldes carboxylsyre- og sulfonsyre-grupper, fremstillet af Bayer Ltd.) eller "CM-Sephadex"® 5 (varemærke for carboxymethyldekstran, en kationbytter fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals), og disse fås i H-form, Na-form, NH^-form eller blandet form. Den BMGl62-aF2, der adsorberes på harpiksen, elueres med vandig syreopløsning såsom saltsyre, eddikesyre etc. og vandig saltopløsning så-10 som natriumchlorid. Som ekstraktions-, fraskillelses- og rensningsmetoder anvendes gelfiltrerings- og ultrafiltreringsmetoder tillige med de nævnte metoder med harpiks til opnåelse af den rene form for BMG162-aF2 ved passende kombinering eller gentagelse deraf.

15 Da BMG162-aF2 er ustabil i form af fri base, isoleres den fortrinsvis som hydrochloridet. Og dette er så hygroskopisk, at det danner et hydrat. BMG162-aF2-hydrochlorid-hydratets fysisk'/kemiske egenskaber er følgende:

Det er umuligt at måle et smeltepunkt, på grund af 24 o 2o stoffets meget store hygroskopicitet. [a] D = -11 ( c = 1,0, vand).

Analyse:

Beregnet for C^yH^^NyO^. 3HC1.2^0: C 37,20, H 8,08, N 17,86, Cl 19,38.

25 Fundet: C 37,55, H 7,89, N 17,52, Cl 18,61.

1 13 H-NMR-spektret er vist i fig. 1. C-NMR-spektret 15 er vist i fig. 2. N-NMR-spektret er vist i fig. 3, der i-agttages 7 nitrogenatomer (3 nitrogenatomer i guanidylgruppe iagttages som signal med 2 spidser). Det ultraviolette ab-30 sorptionsspektrum har kun endabsorption., Det infrarøde spektrum er vist i fig. 4.

BMGl62-aF2-hydrochlorid er let opløseligt i vand og methanol, men tungt opløseligt eller uopløseligt i ethanol, ethylacetat, chloroform og benzen. Det giver positive ninhy-35 drin-, Sakaguchi- og Rydon-Smith-reaktioner. Ved tyndtlags-chromatografi med "Avicel'® (mikrokrystallinsk cellulose) fremkaldt med butanol/pyridin/eddikesyre/vand (6:4:1:3) og

O

DK 157890B

14 butanol/ethano1/vand (4:1:2) udviser BMG162-aF2-hydrochlo-rid en enkelt plet ved Rf = 0,14 og Rf = 0,20. Ved høj-spændingspapirelektroforese (3.500 volt, 15 minutter) med myresyre/eddikesyre/vand (1:3:36) udviser BMGl62-aF2-en 5 bevægelighed på 1,70-1,74 i forhold til alanins, som sættes til 1,00.

* BMG162-aF2's biologiske egenskaber er vist i det følgende. Som vist nedenfor har BMG162-aF2-hydrochlorid kun svag inhiberende virkning på Gram-positive og -negative 10 bakterier jog udviser bemærkelsesværdige virkninger med hensyn til bedring og forlænget overlevelsestid i forsøg med museleukæmi L1210, EL-4, Ehrlich ascites tumor og Sarcoma 180, og det er derfor klart, at antibiotikumet er et nyttigt anti-cancermiddel.

15 (1) BMG162-aF2's antibakterielle virkning.

BMG16.2-aF2 har svag antibakteriel virkning, og den inhiberende minimumskoncentration over for forskellige mikroorganismer på agarsubstrat er vist i tabellerne II-l til II-3. Prøven udføres ved hjælp af agar-fortyndingernetoden 20 ved anvendelse af BMG162-aF2-hydrochlorid. Som det ses i tabel XI—1, inhiberer BMGk62-aF2 svagt Gram-positive og -negative bakterier.

Tabel II-l 25 Antibakteriel aktivitet

Inhib. minim.-koncentration

Prøveorganisme_(mcg/ml)_ 30 1. Staphylococcus aureus FDA209P 100 2. Staphylococcus aureus Smith 12.5 3. Micrococcus flavus FDA16 25 4. Micrococcus lysodeiktieus IF03333 100 35 5. Sarcina lutea PCI1001 100 6. Bacillus anthracis 25

DK 157890B

15

O

Tabel II-l (forts.)

Inhib. minim. -koncentration

Prøveorqanisme_ (mcg/ml)_ 5 7- Bacillus subtilis NRRL B-558 100 8. Bacillus subtilis PCI219 6.25 9. Bacillus cereus ATCC10702 >100 10. Corynebacterium bovis l8l0 50 10 11. Escherichia coli NIHJ >100 12. Escherichia coli K-12 100 13- Escherichia coli ML1629 >100 14. Shigella dysenteriae JS11910 100 15- Shigella flexneri 4bJSll8ll >100 16. Shigella sonnei JS11746 >100 17. Salmonella typhi T-63 >100 20 18. Salmonella enteritidis >100 19. Proteus' vulgaris 0X19 12.5 20. Proteus mirabilis IPM OM-9 >100 21. Proteus rettgeri GN311 >100 25 22. Proteus rettgeri GN466 >100 23- Serratia marcescens >100 24. Pseudomonas aeruginosa A3 >100 25. Klebsiella penumoniae PCI602 >100

uU

26. Mycobacterium smegmatis ATCC607 >100

Anvendt substrat: næringsagar ved 37°C

35 16

DK 157 890 B

0

Tabel II-2

Antibakteriel aktivitet

Inhib. minim.-koncentration 5 Prøveorganisme_(mcq/ml)_ 1. Aeromonas punctata IAM1646 >100 2. Aeromonas salmonecida ATCC14174 >100 3. Aeromonas sp. (KT-444) >100 10 4. Vibrio anguillarum NCBM6 50 5. Pseudomonas fluorescens >100 6. Pseudomonas lachrymans 50 '7. Erwinia aroideae 50 15

Anvendt substrat: Næringsagar ved 27°C.

Tabel II-3

Antimikrobiel aktivitet 20

Inhib. minim.-kone entrati on

Prøveorganisme_(mcg/ml)_ 1. Candida tropicalis F-l >100 25 2. Candida pseudotropicalis NI7494 >100 3. Candida albicans 3147 >100 4. Candida Yu-1200 >100 5· Candida krusei NI7492 >100 30 6. Saccharomyces cerrevisiae >100 7. Cryptococcus neogormans >100 8. Helminthosporium oryzae >100 M 9· Pyricularia oryzae >100 10. Pellicularia filamentosa sasakii >100 11. Xanthomonas citri >100

DK 157890 B

O

17

Tabel II-3 (forts.)

Inhib. minim.-koncentration

Prøveorganisme_(mcg/ml)_ _ 12. Xanthomonas oryzae >100 5 13. Aspergillus niger 100 14. Trichophyton asteroides 429 >100 15- Trichophyton mentagrophytes >100 10 Anvendt substrat: næringsagar + 1% glucose ved 27°C.

(2) BMG162-aF2's anticanceraktivitet.

(a) Virkning på museleukaami L1210 (ip-ip-system).

En gruppe på 8 CDF, hunmus, 6-7 uger gamle får inoku-5 ^ 15 leret intraperitonealt 10 celler/0,25 ml/mus af L1210 leukæmiceller. Efter 24 timer doseres BMGl62-aF2-hydrochlorid opløst i saltvandsopløsning intraperitoenalt en gang daglig i 9 dage kontinuerligt, og dødelighed og størrelsen af forlænget overlevelsestid bestemmes. Af de i tabel III viste re-20 sultater fremgår, at BMG162-aF2 udviser en helbredende virkning og har indvirkning på forlængelsen af overlevelsestiden for museleukæmi L1210.

Tabel III

25 BMG162-aF2"s virkning på museleukæmi L121Q (ip-ip-system)

Gen.sn. overlevel- sesdage for behandl. Antal mus overlevet

Dosis Gen.sn. overlevel- _i 60 dage_ (mg/kg/dag) sesdage for kontrol_Antal afprøvede mus 30 50 295S) 0/8 25 334 0/8 12,5 586 4/8 6,25 732 8/8 3,13 441 3/8 35 1,56 301 1/8 0,78_107_0/8_; £) Der ses tegn på toksicitet

Kontroldyrenes gennemsnitlige antal overlevelsesdage: 8,2

DK 157890B

18

O

(b) Virkning på museleukæmi L1210 (sc-ip-system)

En gruppe på 5 CDF, hunmus, 6-7 uger gamle, får in- -1 5 jiceret museleukæmiceller L-1210 (10 celler/0,25 ml/mus) subcutant. på siden af abdomen og behandles 24 timer efter 5 med BMGl62-aF2-hydrochlorid i saltvandsopløsning intraperi-tonealt en gang daglig i 9 dage kontinuerligt, og dødelighed og størrelsen af forlænget overlevelsestid bestemmes.

Som det fremgår af tabel IV, udviser BMG162-aF2 kraftig terapeutisk virkning og forlængelse af overlevelsestiden lige 10 som ved eksperimentet i afsnit (a).

Tabel IV

BMG162-aF2's virkning på museleukæmi 1.1210 (sc-ip-system)

Gen.sn. overlevel- 15 sesdage for behandl. χ 100 Antal mus overlevet

Dosis Gen.sn. over level- _i 30 dage_ (mg/kg/dag) sesdage for kontrol_antal behandlede mus 50 >309 5/5 25 >309 5/5 . go 12/5 >309 5/5 6,25 >240 3/5 3,13 120 0/5 1,56_105_0/5_

Kontroldyrenes gennemsnitlige antal overlevelsesdage: 9,7.

25 (c) Virkning på museleukæmi EL-4.

En gruppe på 5 C^BL/6 hunmus, 10 uger gamle, inoku-leres med museleukaaniceller EL-4 (10^ celler/0,25 ml/mus) in-traperitoenalt og behandles efter 24 timer med BMG162-aF2--hydrochlorid i saltvandsopløsning intraperitonealt en gang 30 daglig kontinuerligt i 9 dage, og dødelighed og længden af forlænget overlevelsestid bestemmes. Som det fremgår af tabel V, udviser BMG162-aF2 også terapeutisk virkning og forlænger overlevelsestiden ved EL-4.

35

O

DK 157890B

19

Tabel V

BMG162-aF2*s virkning på museleukæmi EL-4 Dosis Gennemsn. ant, overlevelsesdage for behandl. χ 1qQ

(mg/kg/dag) Gennemsn. ant. overlevelsesdage for kontrol_ 5 5 193 2,5 164 1.25 159 0,625 130 0,313_131_ 10 Kontroldyrenes gennemsnitlige antal overlevelsesdage: 11,0 (d) Virkning på Ehrlich ascitestumor.

En gruppe på 4 ICR hunmus, 6 uger gamle, inokule- g res intraperitonealt med Ehrlich ascitestumorceller (2 x 10 celler/0,25 ml/mus) og behandles efter 24 timer med BMG162-15 -aF2-hydrochlorid i saltvandsopløsning ved intraperitoneal injektion en gang daglig kontinuerligt i 9 dage, og størrelsen af forlænget overlevelsestid afprøves. Som det fremgår af tabel VI, udviser BMG162-aF2 også anticancervirkning over for Ehrlich ascitestumor.

20

Tabel VI

BMG162-aF2*s virkning på muse-Ehrlich ascites tumor Dosis Gennemsn. ant. overlevelsesdage for behandl.

(mg/kg/dag)Gennemsn. ant. overlevelsesdage for kontrol_ 25 50 54* 25 72* 12,5 170* 6.25 236 3,13 188 30 1/56_133___ * Der viser sig tegn på toksicitet

Kontroldyrenes gennemsnitlige antal overlevelsesdage: 13,8.

(e) Virkning på sarcom 180.

En gruppe på 4 ICR hunmus, 6 uger gamle inokuleres g 35 intraperitonealt med musesarcom 180-celler (2 x 10 celler/ 0,26 ml/mus) og behandles efter 24 timer med BMG162-aF2-hy-drochlorid i saltvandsopløsning ved intraperitoneal injektion en gang daglig kontinuerligt i 9 dage, og størrelsen

DK 157890B

20 0 af den forlængede overlevelsestid afprøves. Som det fremgår af tabel VII, udviser BMG162-aF2 også anticancervirk-ning over for sarcom 180.

5 Tabel VII

BMG162-aF2's virkning på musesarcom 180 Dosis Gennemsn/ ant. overlevelsesdage for behandl...

(mg/kg/dag) Gennemsn. ant. overlevelsesdage for kontrol_ 50 53* 10 12,5 >279 6,25 181* 3,13 243 1,56_220_ £ Der viser sig tegn på toksicitet 15 Kontroldyrenes gennemsnitlige antal overlevelsesdage: 13,8.

(3) BMG162-aF2's akutte toksicitet Når BMG162-aF2-hydrochlorid injiceres intravenøst på ICR hunmus, 4 uger gamle, er LD,-0 mere end 80 mg/kg.

BMG162-aF2,s fysisk/kemiske og biologiske egenskaber 20 er blevet detaljeret beskrevet ovenfor. Baseret på den kendsgerning, at spermidin er en almindelig bestanddel i molekylet, ligner BMG162-aF2 bleomycin, der produceres af Streptomyces verticillus, LL-BM1238, og Ϊ2 produceret af Nocardia, ede-nin produceret af Bacillus brevis og laterosporamin produce-25 ret af Bacillus. .Eftersom BMG162-aF2's struktur allerede er bestemt og er som anført ovenfor, adskiller BMG162-aF2 sig klart fra bleomycin, LL-BM1233, og °U edenin, der er bestemt ved deres egne strukturer. Desuden adskiller den sig fra laterosporamin (The Journal of Antibiotics 29, 390-30 393 (1976)) med hensyn til infrarødt spektrum, opløselighed i alkohol, antibakterielt spektrum og den kendsgerning, at et Sakaguchi-positivt stof, indbefattende CgH^NgO, der er en bestanddel i laterosporamin, ikke indeholdes i sønderdelte produkter af BMGl62-aF2. Det må derfor fastslås, at 35 BMG162-aF2 er et hidtil ukendt antibiotikum.

Ud fra de foregående resultater udviser BMG162-aF2 karakteristiske anticancer-virkning over for leukæmi hos

DK 157890B

21

O

varmblodede dyr, herunder mennesker, samt sarcomer og andre tumorer og har forholdsvis lav toksicitet. BMG162-aF2 kan derfor anvendes som et udmærket anti-tumorpræparat.

Med hensyn til metoder til fremstilling af pharma-5 ceutika og indgivelse, når der anvendes BMG162-aF2 som antitumor-præparat, kan der anvendes forskellige kendte procedurer. Indgivelsesmetoderne omfatter oral og rectal indgivelse samt injektioner. Ved fremstilling af pharmaceutika anvendes injektionsmidler, pulvere, granulater, tabletter, suppo-jq sitorier og lign.

Til de pharmaceutiske præparater kan der anvendes alle slags pharmaceutisk acceptable bærestoffer såsom faste bærestoffer, flydende bærestoffer, stabilisatorer, antiseptika, hjælpemidler, emulgeringsmidler etc. om nødvendigt, når 15 de blot er uskadelige for BMG162-aF2. En konkret fremgangsmåde til fremstilling af et injektionspræparat er at opløse BMGl62-aF2, fortrinsvis dets vandopløselige salte såsom hy-drochloridet og sukkerforbindelser såsom mannitol i destilleret vand og fylde dette i små beholdere (ampuller), eller 2Q opløsningen kan yderligere lyophiliseres og opløses i saltvandsopløsning eller destilleret vand, så at der fås en opløsning til indgivelse ved injektion.

I de pharmaceutiske præparater kan indholdets størrelsesforhold varieres inden for et bredt interval i overens-25 stemmelse med præparaternes fysiske form, og præparaterne indeholder i reglen 0,01-100 vægtprocent, fortrinsvis 0,1-70 vægtprocent BMGl62-aF2, og det øvrige indhold, dvs. 0-99,9 vægtprocent, fortrinsvis 99,9-30 vægtprocent, er pharmaceutisk acceptable bærestoffer. Når det drejer sig om et in-3ø jektionspræparat, er indholdets størrelsesforhold som følger: BMG162-aF2 0,1-95,0 vægtprocent

Sukkerforbindelser 99,1- 5,0 vægtprocent Natriumchlorid 0 -94,9 vægtprocent.

Selvom indgivelsesmængden af BMG162-aF2 varierer 35 afhængigt af symptomer, anvendes fortrinsvis 0,01-800 mg/dag/ voksen, fortrinsvis 0,1-600 mg/dag/voksen. Dersom kontinuerlig indgivelse er nødvendig, må den daglige mængde reduceres.

22 DK 157890B

O

Til et pharmaceutisk præparat anvendes BMG162-aF2 1 reglen i form at sit salt såsom hydrochloridet, etc., som er velegnet til medicinsk anvendelse.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere be-5 lyst ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1 5 liter flydende substrat indeholdende 2,0% glycerin, 2,0% dekstrin, 1,0% sojapepton ("Bacto-soytone" frem-1Q stillet af Difco Laboratories), 0,3% gærekstrakt (Daigo-

Eiyo-Kagaku Co., Ltd.), 0,2% ammoniumsulfat og 0,2% calcium-carbonat, idet pH er 7,4, anbringes i 125 ml portioner i Sa-kaguchi-kolber med et volumen på 500 ml. Efter sterilisation inokuleres i kolberne 1% podesubstrat fremstillet i forvejen 15 (Bacillus laterosporus BMG162-aF2 (FERM-P 5230, ATCC 31932) dyrkes på skrå-agar i et substrat med samme sammensætning i 2 dage), og dyrkes ved 28°C i 5 dage. Derfås et bouillonfiltrat (4.900 ml), der hældes i en kolonne (500 ml, diameter 5,2 cm) "Amberlite IRC-50'® (Rohm and Haas Co., Na+-type og + 20 H -type-blanding (7:3)), og den aktive komponent adsorberes. Kolonnen vaskes med vand, og den aktive bestanddel elueres med 2000 ml 1,0N HC1 og neutraliseres med ION NaOH til pH 6.

Den neutraliserede opløsning fortyndes 4 gange med vand og hældes i en kolonne (400 ml, diameter 4,3 cm) "CM-Sephadex 25 c-25'® (Pharmacia Fine Chemicals, kvældet ved forbehandling med vand), hvorpå den aktive bestanddel adsorberes. Den aktive bestanddel elueres med 0,3 molær NaCl-^O. Den aktive fraktion inddampes til tørhed under formindsket tryk. Remanensen opløses i 5 ml methanol for at fjerne NaCl-krystaller 30 ved filtrering. Filtratet hældes i en kolonne (445 ml, diameter 2,6 cm) "Sephadex LH-201® (varemærke for dekstran til gelfiltrering med organisk opløsningsmiddel fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals, kvældet ved forbehandling med methanol) , og kolonnen fremkaldes med methanol. Den aktive 35 fraktion tørres under formindsket tryk, hvorved der fås 460 mg ren BMG162-aF2-hydrochlorid som et hvidt pulver.

DK 157890 B

23 0

Eksempel 2 10 liter substrat indeholdende 2,0% glycerin, 2,0% dekstrin, 1,0% sojapepton, ("Bacto-soytone®, fremstillet af Difco Laboratories), 0,3% gærekstrakt (Daigo-Eiyo-Kagaku Co., 5 Ltd.), 0,2% ammoniumsulfat, 0,2% calciumcarbonat og 0,03% siliconeolie som antiskumningsmiddel, idet pH er 7,4, fyldes i en tank af rustfrit stål med en kapacitet på 30 liter og steriliseret ved 120°C i 20 minutter. Derefter inokuleres 125 ml bouillon, der er rystedyrket i 48 timer med den 10 BMG162-aF2-producerende stamme, Bacillus laterosporus BMG162--aF2 FERM P 5230, ATCC 31932, aseptisk i den afkølede tank. Dyrkningen udføres under luftning og omrøring ved 28°C (luftningsmængden er 15 liter/min og omrøringen sker med en hastighed på 350 omdr./min., efter 16 timer med 10 liter/min og -15 350 omdr./min.), og efter 40 timers forløb behandles det frem komne bouillonfiltrat på 9,500 ml ved søjlechromatografi på "Amberlite IRC-50® og "CM-Sephadex C-25'® på væsentlig samme måde som i eksempel 1. "Sephadex"-kolonnen fremkaldes med 4 liter 0,3 molær NaCl-^O. 290 dråber af eluatet opsam-20 les i én portion og adskilles i to aktive fraktioner: I (portion nr. 14-63),og II (portion nr. 64-154). Til den aktive fraktion II på 1.660 ml, som ikke indeholder noget stof med absorption ved 280 nm, tilsættes 33 g aktiv trækul for at absorbere det aktive stof. Efter at det aktive trækul er 25 vasket med vand, elueres BMG162-aF2 med 500 ml 0,05N HC1 i 80% methanol/vand. Eluatet neutraliseres med "Amberlite il) IR-45'*^ (Rohm and Haas Co. , OH-type) , og tørres under formindsket tryk, hvilket giver 305 mg BMG162-aF2-hydrochlorid.

Den aktive fraktion I, der indeholder et stof med en absorp-30 tion ved 280 nm, inddampes til tørhed, ekstraheres med methanol, opløses i 1 liter afioniseret vand og genchromato-graferes på en kolonne (400 ml, diameter 4,3 cm) "CM-Sephadex C-25 ' efterfulgt af gradienteluering med 0-1 molær NaCl (4 liter), hvorved der fås en aktiv fraktion, der inddampes 35 til tørhed. Remanensen ekstraheres med methanol og påføres en kolonne (780 ml, diameter 2,8 em) "Sephatdex LH-20®. Kolonnen fremkaldes med methanol for at befri den for NaCl,

O

DK 157890 B

24 og der fås 670 mg rent BMG162-aF2-hydrochlorid. Der udvindes ialt 975 mg BMG162-aF2-hydrochlorid.

Eksempel 3 5 Til en opløsning indeholdende 150 mg BMG162-aF2-hy- drochlorid fremstillet i eksempel 2 opløst i 1 ml methanol tilsættes 1 ml mættet picrinsyre/methanolopløsning, og der opvarmes til kogning. Efter inddampning vaskes remanensen med benzen og ethanol for at fjerne overskud af picrinsyre, 10 og der fås 62 mg krystaller BMG162-aF2-picrat af en opløsning i en blanding af vand og ethanol.

Eksempel 4 30 vægtdele BMG162-aF2-hydrochlorid fremstillet som 15 i eksempel 1 opløses i 970 dele renset vand og filtreres for at få en bakteriefri opløsning med Millipore-filter, type GS. Filtratet (1 g) kommes i en ampul med en kapacitet på 10 ml og lyophiliseres, hvilket giver et frysetørret injektionspræparat indeholdende 30 mg BMG162-aF2-hydro-2o chlorid.

Eksempel 5

Granulat 50 vægtdele BMG162-aF2-hydrochlorid som fremstillet 25 i eksempel 1, 600 vægtdele lactose, 330 vægtdele krystallinsk cellulose og 20 vægtdele hydroxypropylcellulose blandes omhyggeligt, komprimeres ved hjælp af en valsekompressor (‘'Roller-Compactor'*^ og knuses til dannelse af et granulat, der sigtes til en størrelse mellem 16 og 50 mesh.

30

Eksempel 6

Tabletter 30 vægtdele BMG162-aF2-hydrochlorid som fremstillet i eksempel 1, 20 vægtdele krystallinsk lactose, 147 vægtdele 35 krystallinsk cellulose og 3 vægtdele magnesiumstearat blandes i en V-formet blandemaskine, og der fås tabletter indeholdende 300 mg BMGl62-aF2.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum, BMGl62-aF2, med formlen

5 NH2 \ C-NH-(CH0 ) i.-CH-CH5-C0 II 2 4 I 2 I NH. OH NH i 1 CH-OH

10 I C 0-NH-(CH2)n-NH-(CH2)3-NH2 eller et pharmaceutisk acceptabelt salt deraf, 15 kendetegnet ved, at Bacillus laterosporus, BMG162-aF2 FERM-P 5230, ATCC 31.932, eller en mutant eller variant heraf med væsentligt samme egenskaber som denne dyrkes i et næringsmedium, der indeholder nitrogenkilder, carbon-kilder og uorganiske salte, hvorpå det dannede antibiotikum 20 udvindes fra kulturen, eventuelt i form af et pharmaceutisk acceptabelt salt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningen udføres aerobt i flydende kultur ved 15-40°C ved pH 5,0-8,2.. 25

3 . Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at udvindingen af BMG162-aF2 fra dyrkningsmediet udføres ved hjælp af søjlechromatografi ved anvendelse af en svag kationbytterharpiks med carboxylsyre som den aktive gruppe.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at det på harpiksen adsorberede BMG162-aF2 elue-res med en vandig syreopløsning eller en vandig saltopløsning. 35