DE2343963A1

DE2343963A1 - Staebchenbakterium-peptidase und verfahren zu ihrer herstellung durch kultivierung von staebchenbakterien

Info

Publication number: DE2343963A1
Application number: DE19732343963
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Goi; Hidemasa Hidaka; Takemi Koeda; Shinji Miyado; Tomizo Niwa; Kazuo Saito; Uichi Shibata; Yujiro Yamada; Kenji Yoshida
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1972-09-02
Filing date: 1973-08-31
Publication date: 1974-04-11
Also published as: DE2343963C3; JPS5039151B2; FR2197569B1; DE2343963B2; US3905869A; GB1451074A; FR2197569A1; CA990672A; JPS4942883A

Description

Stäbchenbakterium-Peptidase und Verfahren zu ihrer Herstellung durch Kultivierung von Stäbchenbakterien

Die Erfindung betrifft eine Stäbchenbakterium-Peptidase als wirksames entzündungshemmendes Mittel und ein Verfahren zu ihrer fermentativen Herstellung durch Kultivierung von Stäbchen- oder Bazillusbakterien.

Proteasen werden seit langem als Verdauungshilfen angewandt und finden seit kurzem Verwendung als entzündungshemmende Mittel, eiterabbauende Mittel, Detergents und als Zusatzstoffe bei der NahrungsmitteIverarbeitung. Mit steigender Nachfrage und Anwendung dieser Enzyme wurden umfangreiche Versuche angestellt und eine Anzahl von neuenund wertvollen Proteasen, insbesondere alkalische Proteasen entwickelt.

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Da die Funktionsweise und die Produktivität bekannter alkalischer Proteasen im Hinblick auf die Hemmung von Entzündungen nicht zufriedenstellend sind, ist es die Aufgabe der Erfindung, • Ine BaziI Ius-PeptIdase mit größerer Hemmwirkung gegen Entzündungen als bekannte Proteasen zu schaffen, die sich In Ihren Eigenschaften von den bekannten alkalischen Proteasen wesentlich unterscheidet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die neue alkalische Protease mit der Bezeichnung BaciIlopeptIdase C folgende Eigenschaften aufweist:

(1) Elementenanalyse: C 51,22 %, H 6,92 %, S 0,99 %, N 16,99 %, Asche 1,62 %,

(2) Molekulargewicht: etwa 27 000

(3) maximale Aosorption im ultravioletten Absorptions-Spektrum bei einer Wellen länge von 280 Millimikron E J *_ffl: 12,7 (pH - 6,8)

(4) Isoelektrischer Punkt: pH - 6,0

(5) spezifische Aktivität: M 400 u/mg N,

(6) optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 9,0 bis 9,3 bei •ln*r Temperatur von etwa 45 ° C,

(7) Stabilität Im pH-Wert-Berelch von 7 bis 10,5,

(β) Inhibition durch Äthylen-Oiamin-Tetraazetat, Dllsopropyl-FIuorphosphat oder Kartoffel-Hemmungsstoff, jedoch nicht gehemmt durch Trypsin-lnhIbitor, o-PhenanthroI I η oder Chlor-Quecksilber II-Benzoesäure.

In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird ein Stamm d«s Bazillus sp. Nr. 794 (ATCC 21 964 oder FERM-P Nr. 1522) zur Herstellung der BaciIlopeptidase C durch Kultivierung des Bazillus sp. Nr. 794 in einer Nährlösung bis zur Ansammlung des Enzyms in der Nährlösung und Gewinnung der Bad I lopeptIdas« C durch Extraktion und/oder Filtration der Nährlösung verwendet.

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Die gemäß der Erfindung entstehende alkalische Protease besitzt physikalische und chemische Eigenschaften, die sich von denen bekannter alkalischer Proteasen grundsätzlich unterscheiden, und zeigt eine erhebliche größere proteolytI sehe und entzündungshemmende Wirkung.

Öle herkömmlichen alkalischen Proteasen werden von etwa 10~ M DiIsopropyI-Fluorphosphat (nachfolgend mit DFP bezeichnet), welches ein spezieller Hemmstoff gegen Serln-Enzyme Ist, völlig Inaktiviert, wogegen sie von EDTA, welches einen speziellen Hemmstoff gegen neutrale Proteasen ergibt, kaum beeinflußt wird (L. Keay und B. S. Wildi, Biotech, and Bioeng. 12, 179 (1970); K. Morlhara, Biochem. and Biophys. Research Communications 26, 656-657 (1967); D. Tsuru et al., Agr. BIoI. ehem., 30, 1266 (1966); K. Horikoshi, Agr. BIoI. ehem. 35, 1407 (1971)).

Demgegenüber stellt die neue Protease gemäß der vorliegenden Erfindung, die BaclIlöpeptIdase C, ein vollkommen neues Enzym dar, das sowohl von DFP als auch von EDTA nicht aktiviert wird. Es ist für die BaciIlopeptidase charakteristisch, daß sie bei einem Test über die Hemmung der EntzündI Ichke11 entsprechend einem Verfahren, bei dem Karrageen als Entzündungemittel In ein ödem einer Ratte gespritzt wird, bemerkenswerte entzündungshemmende Eigenschaften zeigt.

Der Bad IlopeptIdase-C-produzlerende Stamm gemäß der Erfindung ist aus dem Erdreich isoliert und im Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Chlba, Japan, unter F£RM-P Nr. 1522 und in der American Type Culture Collection, RockvlI Ie, Maryland, USA, unter ATCC Nr. 21 964 hinterlegt worden. Der Stamm weist folgende Eigenschaften auf:

Vermehrungsstäbe 0,7 bis 0,9 mal 2,5 bis 3,5 Mikrons, beweglich mittels perltrlchenähnIlchen Hagellaten; gramindifferent;

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Sporen 1,3 bis 1,6 Mikron mit kugelförmigen Enden; optimales Wachstum bei pH-7 bis 9; gutes Wachstum bei 28 bis 40 ° C; kein Wachstum bei 50 C; aerobe Bakterien.

Kolonien auf FI β Ischextrakt-Agar-Nährböden zeigen glatte Oberfläche mit Oberflachenglanz, die Ilchtundurchlässig und In der Farbe leicht gelblich-braun ist.

Sonstige Agar-Nöhrböden: ergiebiges Wachstum, glatte Oberfläche.

Glukose-Agar-Nährböden: Wachstum gleich dem oder besser als bei sonstigen Nährböden;

Sojibohnenextrakt-Agar-Nährböden: die gleichen Eigenschaften wie Glukose-Nährböden, cremige Oberfläche;

Flelschextrakt-Bruhe enthaltend NaCI: Wachstum bei 5 % NaCI-Antell, kein Wachstum bei 10 % NaCI-Anteil; die Fleischextrakt-Brüh· Ist gleichmäßig trübe (schlammig), und es bildet sich kein BakterienfI Im;

Fielschextrakt-Gelatlne-Stlchkultür zeigt sch Ichtenförmlge Verflüssigung bei 22 ° C innerhalb einer Woche;

Lackmus-Milch: schwach rosa gefärbt; Glukose-Asparagin-Agar-Nährböden: kein Wachstum; Hydrolyse von Stärke: negativ; Bildung von Indol: negativ; Bildung von AzetyImethyI a IkohoI: negativ; Katalase: positiv; Verflüssigung von Gelatine: positiv; Hydrolyse von Kasein: positiv;

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Reduktion von Nitrat: negativ;

pH-Wert der Glukose-Brühe beträgt 7,8 bis 8,0;

Urease: negativ; Reduktion von Methylen-Blau (Farbe): positiv;

Gaserzeugung von Nitrat unter anaerob I sehen Bindungen: negativ;

Wachstumsfaktor: Thlamin (Vitamin B.) erforderlich;

Wachstum in Glukose-Brühe unter anaerob!sehen Bedingungen: negativ.

Ein Vergleich der Mikroorganismen mit den obengenannten mykologlschen Eigenschaften nach der Erfindung mit bekannten MlkroorganIsmen, wie sie beispielsweise in Bergey's Handbuch der Üestimmungs-Bakteriologie, 7, Ausgabe, 1957, beschrieben sind, zeigt, daß dieser Stamm nahe dem Bacillus brevis und dem Bacillus sphaerlcus liegt. Jedoch unterscheidet er sich vom Bacillus sphaericus durch die Verwertung von Kasein und Gelatine und vom Bacillus brevis in Jeder Hinsicht in bezug auf die Morphologie der Sporen, auf das Wachstum im 5Jt-NaCI-hai tigen Medium und auf die Notwendigkeit des Vorhandenseins von Thlamin für das Wachstum. Unter den bekannten Mikroorganismen Ist keiner festzustellen, der mtt dem die Bad IlopeptIdase-C-bildenden Mikroorganismus völlig übereinstimmt.

Demgemäß Ist der bei der Erfindung benutzte Stamm wegen setner Zugehörigkeit zu den BaciI Iaceae-Stämmen als neuer Bacillus sp. Nr. 794 bezeichnet worden.

Ote neue Protease, BaclIiopeptidase C, wird durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einer Nährlösung erzeugt, welcher mit den Bad I Iaceae-StJSmm·π verwandt zu sein scheint und vom Bacillus sp. Nr. 794 repräsentiert wird.

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Die Kultivierung oder Züchtung wird in der Regel auf die übliche Welse durchgeführt, wie sie für die Kultivierung der wichtigsten Mikroorganismen entweder in fester oder flüssiger Form angewandt wird. im allgemeinen wird die flüssige Kultivierung bevorzugt. Anwendbare KuI ti νterungslösungen sind synthetische, halbsynthetische und natürliche Nährlösungen. Als Kohlenstoff liefernde Nährlösungen kommen In Betracht Glukose, Saccharose, Maltose, Glukonsäure, Stärke, Hydrolysate von Stärke und anderen Kohlehydraten, als Stickstoff liefernde Nährlösungen Pepton, Fleischextrakt, Maiswasser, Whisky aus Mals, Sojabohnenmehl, trockene Hefe, Gluten, KäseIn-Abbau-Produkte, Harnstoff, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, einzeln oder In Kombination zu zweit oder zu mehreren. Wahlweise können Magnesiumkarbonat, -sulfat oder -hydrochI or Id. Mangan oder Kalzium und weiterhin Natriumchlorid oder schaumgebremste Mittel in geeigneten Mengen hinzugefügt werden. Die bevorzugt· Temperatur liegt bei 25 bis 40 ° C. Die Kultivierungszeit Ist abhängig von der Kultivierungstemperatur, dem Kultivierungsvolumen und dem Kultivierungssystem, jedoch kann die Herstellung der neuen Protease BaciIlopeptIdase C Im allgemeinen innerhalb von 40 bis 100 Stunden durchgeführt werden. Die Isolierung der erzeugten Protease aus der Nährlösung wird nach einem der üblichen Verfahren für die Reindarstellung von Enzymen durchgeführt, beispielsweise Filtrieren, Ausfällen durch wasserlösliche anorganische Salze, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, Fällung durch Zugabe von mit Wasser vermischbarem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Azeton und Adsorbierung und Elution unter der Verwendung von Kalziumphosphat, Aluminiumoxid, Bentonit, Austauscherharz oder Ionenaustauscher, bestehend aus synthetischen organischen Zusammensetzungen, die von PolysaccharId-0extran (erhältlich unter dem Handelsnamen OEAE-Sephadex A-50, ein Produkt der Pharmacia Co., Schweden) abgeleitet sind. Das auf diese Weise erhaltene Enzym wird in der nachfolgend beschriebenen Weise gereinigt,

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um ·Ιη·η elektrophoretisch reinen EinzeIkrlstalI zu erhalten.

Die neue Protease Bad Hopeptidase C gemäß der Erfindung zeigt folgende enzymologisehen und physlkochemisehen Eigenschaften:

(1) Wirksamkeit

Wie aus Flg. 1 hervorgeht, ist das vorliegende Enzym bei einem pH-Wert von 6 bis 11 In einem Ml Ich-Kaseln-Substrat aktiv. Oer optimale pH-Wert betrügt 9 bis 9,3 und laßt erkennen, daß es sich bei diesem Enzym um eine alkalische Protease handelt.

(2) Spezifische Substrat-Wirksamkeit

Die folgende Tabelle 1 zeigt die spezifische Substrat-Wirksamkeit der Bad Ilopeptldase C.

TabelI	Substrate	e 1	relatlve Anfangsgeschwindigkeit
Ml Ich-Kasein		100
Albumlη		40
HHmoglobi η		1 11
Fibrinogen		50
Messung der Enzym-AktIvI
tat

Die Protease-AktIvitut wurde gemäß einem Verfahren gemessen, das auf Anson & Haglwara's basiert (B. Haglwara et al.. The J. of Blochem., 45, 185, 1958, ibid. 45, 251, 1958) und welches wie folgt leicht abgewandelt wurde: Ein Milliliter der Enzymiösung, der mit M/50 CAPS Pufferlösung In geeigneter Weise verdünnt ist, wird mit 5 ml einer 0,6llgen Kasein-Lösung (pH - 9,0) bei 40⁰C vermischt. Nach 10 Minuten Inkubationszelt wird die Reaktion durch Zugabe von 5 n\ einer trlchioresslgsauren Lösung mit dem Molgewicht 0,44 (■ 0,44 M) gestoppt, danach folgen 30 Minuten weitere Inkubationszeit bei 40 ° C. Im Anschluß daran werden 2 ml

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einer 0,55 M Natrlumkarbonatlösung und 1 ml FoIIn-Reagenz zugefügt und die Mischung noch 30 Minuten lang bei 40 C stehen gelassen. Die optische Dichte der sich ergebenden Mischung wird bei 660 mu Im Vergleich zu dem reinen Substrat gemessen. Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert, die Peptid in einer solchen Menge freisetzen kann, daß es bei der besagten optischen Dichte 1 /J9 Tyrosin in einer Reakttonsmlschung bei pH · 9,0, 40 C in einer Minute gleichkommt.

(4) Auswirkungen des pH-Wertes auf die Aktivität und die StablIItät der Enzyme

Der Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität des vorliegenden Enzyms in einem Ml Ich-Kaselη-Substrat Ist in Flg. 1 dargestellt. Der optimale pH-Wert liegt bei 9,3, und die Aktivität wird bei pH > 6,5 bis 7 oder 10,5 bis 11 auf die Hälfte reduziert. In Flg. 2 Ist der Einfluß der verschiedenen pH-Werte auf die Stabilität der Enzyme dargestellt, wobei die Restaktivität nach einer Behandlung mit M/50 CAPS Puffer-Lösung, bei der es sich um ein schwaches Reagenz aus ZyklohexyI-Amlnopropansuifonsäure handelt, bei einer Veränderung der pH-Werte bei 40⁰C innerhalb von 60 Minuten bestimmt wird. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, ist das Enzym über einen weiten Bereich von pH-Werten stabil; die Restaktivität von mehr als 90 % existiert Im Bereich von pH-Werten 7 bis 10,5.

(5) Auswirkung der Temperatur auf die Aktivität und die StablIitat der Enzyme

Fig. 3 zeigt die ausw irkung der Temperatur auf dl· Enzymaktivität. Aus dieser Figur geht hervor, daß die fflr die Aktivität der vorliegenden Enzyme günstigste Temperatur bei 45⁰C liegt und mehr als 80 % der Aktivität im Bereich von 35 ° C bis 55 ° C auftritt. Aus FIg. 4 Ist ersichtlich, daß die Enzyme unterhalb von 40⁰C relativ stabil sind und bei 60⁰C noch 50 % Restaktivität zeigen.

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(6) InaktIvlerungsbedlngungen In Abhängigkeit von pH-Wert und Temperatur

Bei einem pH-Wert unterhalb von 6 und oberhalb von 12 sind die Enzyme im wesentlichen Inaktiv. Sie sind völlig inaktiv nach 1-stUndlger Behandlung bei 40⁰C und einem pH-Wert ■ 4 oder 12. Sie sind bei einem pH-Wert von 7 und 60⁰C beträchtlich und bei einem pH-Wert ■ 7 und 65 ⁰C völlig inaktiv, desgleichen bei pH - 9,5 und 70 ° C.

(7) Einfluß der Hemmstoffe

Tabelle 2 zeigt den Einfluß einer Anzahl von hemmenden Substanzen. Die Zahlenwerte sind in Einheiten der Restaktivität angegeben. Bekannte alkalische Proteasen sind Serin-Enzyme, welche an der aktiven Stelle Serin enthalten und dafür bekannt sind, daß sie durch spezielle Hemmstoffe, wie beispielsweise OFP und Kartoffelhemmstoff, Jedoch nicht durch EOTA oder o-PhenanthrolI η gehemmt werden. Andererseits sind neutrale Proteasen als Metall-Enzyme bekannt, deren Verhalten gegenüber den DFP- und EDTA-Hemmstoffen im Vergleich zu den Seriη-Enzymen völlig entgegengesetzt ist.

In der nachstehenden Tabelle 2 besitzen die angeführten Symbole folgende Bedeutung:

DFP Pl TI EDTA PCMB

DiIsopropyI-Fluorphosphat Kartoffel-Hemmstoff Trypsin-Hemmstoff Xthylend!amin-Tetraazetat

p-Chlor-QuecksiIber !!-Benzoesäure.

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Tabelle 2

Enzym

Hemmstoffe Konzentrationen gemäß der _____ Erfindung

T-Enzym A-Enzym

DFP

Il

Pl

Il

TI

Il

EOTA

Il

ö-PhenanthrolI η PCMB

1.1 χ 10"³(Mol)

1.1 χ 10~⁴

0.1 (mg/ml)

0.5

0.1

0.01

1 χ 10

3 χ 10

-3 -4 -2 -4 -5

(Mol )

0 (Ji)	100 (f)	7
35	100	21
41	100	76
0	100	!8
100	100	100
100	too	100
0	0	133
0	57	116
95	0	93
100		110
103		119

Bei der Erfindung handelt es sich eindeutig um ein neues Enzym; es Ist einerseits ähnlich einem Serin-Enzym, mit Serin auf seiner aktiven Seite, wie es alkalische Proteasen aufweisen, jedoch wird es andererseits offensichtlich von Äthylendlamin-Tetraazetat beeinflußt, wodurch die maßgebende Rolle der zweiwertigen Metalle bei der Enzymwirkung angezeigt w I rd.

Zum Vergleich werden als Vertreter für neutrale und für alkalische Proteasen T-Enzym und Α-Enzym verwendet.

T-Enzym; Thermolysin (Oaiwa Kasei Kabushiki Kaisha), neutrale Protease, kristallin

Α-Enzym: Alkalische Protease ΓΙ (Seikagaku Kogyo), erhalten vom Bacillus subtil is var amylosacchariticus, dreifach kristallisiert.

(8) RelndarstelIung

Das rohe Enzympulver wird in Wasser aufgelöst, eine 10£ige Lösung daraus hergestellt und diese bei 5

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C mehrere

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Stunden lang gerührt, um das Enzym völlig zu extrahieren. Es wird Kalziumazetat hinzugefügt, bis schließlich die Konzentration etwa 1 % beträgt. Der pH-Wert wird auf 7,5 bis 8,0 eingestellt und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt, um eine auf der Oberfläche schwimmende Flüssigkeit zu erhalten. Es wird Ammoniumsulfat hinzugefügt, bis schließlich die Konzentration eine Sättigung von 0,6 erreicht. Nachdem die obenauf schwimmende Flüssigkeit einige Stunden abgestanden ist, wird sie zentrifugiert, um den abgesetzten Niederschlag zu gewinnen. Dann wird dieser zum Entsalzen In einer TrI-hydrochlorsauren Pufferlösung mit einem Gewicht M/200 und einem pH-Wert von 7,5 und einem Gehalt von M/500 Kalziumazetat gelöst und einer Dialyse gegen die Pufferlösung unterworfen. Danach wird es einer Kolonne von DEAE Sephadex A-50 zugeleitet, die von der Pufferlösung im Gleichgewicht gehalten wird, und mit der Pufferlösung auf eine Menge eluiert, die fünf bis sieben mal so hoch ist wie das Bettvolumen (Nutzvolumen). Mit einer ähnlichen Pufferlösung, die einen Gehalt von 0,1 M NaCI aufweist, wird dann weiter eluiert, um eine Fraktion zu erhalten, In der das vorliegende Enzym enthalten ist. Eine weitere Chromatographie unter den gleichen Bedingungen liefert die maximale spezifisch« Aktivität des Enzyms, daran schließt eine Konzentrierung auf 1/10 bis 1/15 des Volumens an, um das Enzym in Kristallform zu erhalten.

(9) Physikalische und chemische Eigenschaften

TabelIe 3

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Tabelle 3 Phys. und ehem. Größe

UV-Absorptton (E J ^%^ _2QQ ^ Isoelektrischer Punkt

Molekulargewicht

Spezifische Aktivität Elementenanalyse

Wert

) 12.7 (pH 6.8)

6.0 (ZeIlulose-Azetat-Hembran)

	C	27 000	(GeI-FIItrations- Verfehren)
t	H	11 400	u/»g N
S	51.22	m
N	6.92	(*)
Asche	0.99	(*)
16.99	(Jf)
1 .62	U)

0Ie neue Protease Baclllopeptidase C Ist nicht nur als entzündungshemmendes MIttel anwendbar, sondern auch infolge Ihrer großen proteolytlsehen Aktivität als Verdauungshilfsmittel, Weichmacher für Leder und Fleisch und als Waschmittel usw.

Im folgenden wird das Ergebnis eines Versuches beschrieben, der die entzündungshemmende Wirkung der neuen Protease Bad Mopeptidase C aufzeigt.

Vier Donryu-Ratten (mit einem Gewicht zwischen 130 und 150 g) wurde pro Ratte 0,5 mg einer Jeden Enzym-Proben lösung Intraperltonal, d. h. im Bereich des Bauchfells, verabreicht und nach einer Stunde 0,05 ml einer Karrageenlη lösung subkutan in die Sohle eines Hinterbeins einer Jeden Ratte gespritzt. Nach drei Stunden wurde das Ausmaß des entstandenen Ödems mit einer Schieblehre gemessen, um die Auswirkung eines Jeden Enzyms zu beurteilen. Im Ergebnis zeigte sich, daß das Haß der ödembiIdungsverhtndorung von Trypsin 33 %, von OC-ChymotrypsI η 25 % und von Bromelln 37 % betrug, wehrend das des erflndungsgemaßen Enzyms bei 85 % lag.

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	0.5 mg/Ratte	2343963
0.1 mg/Ratte	37 5t	1.0 mg/Ratte
- t	33	52 %
0	25	-
20	11	-
_—	23

Broffleli η

Trypsin

Chymotrypsi η

Lysozym

Enzym der Erfindung 55 85

(Die Zahlenwerte geben das Maß der ödemblIdungsverhlnderung gemäß dem Ratten-Ödem-Verfahren an, wobei Karrageenln als phloglstisches Agens benutzt wird).

Aus dem Vorangegangenen ergibt sich, daß die neue Protease Bad Ilopeptidase C Eigenschaften aufweist, welche sich deutlich von denen bekannter Proteasen unterscheiden. Während bekannte Proteasen von DFP zwar völlig, von EDTA aber nicht inaktiviert werden, wird das Enzym nach der Erfindung sowohl von DFP als auch von EDTA angegriffen. Im Gegensatz zu den bekannten alkalischen Proteasen, die einen isoelektrischen Punkt von pH ■ 8 oder mehr aufweisen, besitzt das Enzym gemäß der Erfindung einen Isoelektrischon Punkt von 6,0 und zeigt eine weit größere EntzUndungshemmwIrksamke11. Die Bad IlopeptIdase C weist nur geringe Toxizltät auf. Die akute Toxizltät der Bad Ilopeptldase C wurde durch orale Abgabe getestet. LD₅₀ des Enzyms wurde mit 9 500 mg/kg bestimmt (mit 95Jtlger Sicherheit zwischen den Grenzen von 8 796 bis 10 260 mg/kg) für Mäusemännchen und 8 900 mg/kg (mit 95iiger Sicherheit zwischen den Grenzen von 8 240,7 bis 9 612 mg/kg) für Mäuseweibchen nach dem Verfahren von Litchfield & Wllcoxon (J. Pharmacol. Exp. Therap. 96, 99 113, 1949) berechnet. Die erfindungsgemäße Bad IlopeptIdase C kann deshalb als wirksames entzündungshemmendes Mittel benutzt werden. Für den Gebrauch bei der therapeutischen Behandlung von Entzündungen und Ödemen nach Operationen oder nach schweren Verletzungen können 2,5 bis 10 mg der BaciIlopeptIdase C zusammen mit Stärke oder Laktose (Milchzucker) In Tabletten oder Kapseln gepreßt werden und Jeweils in einer Dosis von 2 bis 3 Stück drei bis vier mal am Tag oral verabreicht werden.

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Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung der Erfindung, ohne den Schutzumfang zu begrenzen.

Beispiel 1

Zwanzig Liter einer Nährlösung mit 1 % Stärke, 2 t Sojabohnenölkuchen, 1 i Weizenkleie, 0,5 % Kaliumphosphat, 0,5 % Kalzium* karbonat und 0,05 % Magnesiumsulfat werden in einen Fermentationsbehälter mit 30 I Inhalt gegeben und bei 120 ° C 20 Minuten lang unter Druck sterilisiert. Die Nährlösung wird dann mit 200 ml einer Zuchtkultur des Bazillus Nr. 794 (Identifiziert als ATCC Nr. 21 964 oder FERM-P Nr. 1522) geimpft, der getrennt in einer Nährsubstrat-Lösung gezüchtet wird. Die
Kultivierung erfolgt unter Rühren bei 300 U/mln bei 30⁰C
drei Tage lang bei lOOilger Belüftung. Unmittelbar nach Beendigung der Kultivierung werden die Kulturen zentrifugiert, um die Bakterien zu entfernen, wobei 15 Liter Flltrat erhalten werden. Das Flltrat wird unter reduziertem Druck auf 3 Liter konzentriert, sein pH-Wert auf 8,0 durch Zugabe von 27 g Kai*· zlumazetat eingestellt. Der gebildete Niederschlag wird gefiltert und das Filtrat mit Ammoniumsulfat bis zu 0,6 Sättigung gesättigt und zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Auf diese Welse werden 80 % der Aktivität beim Abschluß der Fermentation gewonnen. Der Niederschlag wird
nochmals in 300 ml einer Lösung gelöst, die M/500 Kalziumazetat In M/200 TrI-ChIorwasserstoffs8ure-Puffer lösung mit
einem pH-Wert - 7,5 enthält. Anschließend wird die Lösung
gegen die Pufferlösung dialisiert. Die sich daraus ergebende Enzymlösung wird in einer 3-Liter-Säulβ mit DEAE Sephadex A-50 adsorbiert, mit der Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht, mit etwa 10 Liter der gleichen Pufferlösung und zuletzt mit
einer ähnlichen Pufferlösung gewaschen, die einen Gehalt von 0,1 M NaCi aufweist, wonach das Enzym gemäß der Erfindung
ausgewaschen ist.

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In 3 Litern des Eluats beträgt die erhaltene Aktivität zumindest 70 %. Ein weiterer Durchgang des Eluats durch den Chromatographen unter denselben Bedingungen und eine Konzentrierung auf 1/10 des EIuatsvolumens ergibt 0,8 g kristalline Bad IlopeptIdase C.

Beispiel 2

Zwei Liter des nach Beispiel 1 erhaltenen Fiitrats wird ohne Konzentrierung einem Aussalzungsvorgang mit Ammoniumsulfat, dann der Dialyse und schließlich einer Chromatographie mit DEAE-Sephadex unterworfen. Das durch ein abgestuftes Elutlons* verfahren erhaltene Eluat wird auf 1/8 seines Volumens konzentriert und dadurch 60 mg kristalline Bad Ilopeptldase C erhalten .

Kurze Beschreibung der Zeichnung
Es zeigen:

Flg. 1 den Verlauf des aktiven pH-Bereichs der Bad Hopeptidase C,

Flg. 2 den Verlauf des stabilen pH-Bereichs, Flg. 3 ein Diagramm des aktiven Temperaturbereichs, Fig. 4 ein Diagramm des stabilen Temperaturbereichs,

Flg. 5 den Trennungsverlauf bei Verwendung einer 8 ml-Sau I β DEAE-Sephadex A-50.

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche :

1. Stäbchenbakterium-Peptidase als wirksames entzündungshemmendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß die neue alkalische Protease mit der Bezeichnung BacI I Iopeptidase C folgende Eigenschaften aufweist:

(J) Elementenanalyse: C 51,22 %, 'h 6,92 %, S 0,99 %, N 16,99 %, Asche 1,62 %,

(2) Molekulargewicht: etwa 27 000

(3) maximale Absorption im ultravioletten Absorptions-Spektrum bei einer Wellenlänge von 280 Millimikron E j * : 12,7 (pH - 6,θ)

(4) Isoelektrischer Punkt: pH · 6,0

(5) spezifische Aktivität: 11 400 >j/mg N,

(6) optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 9,0 bis 9,3 wie in Fig. 1 angegeben, bei einer Temperatur von etwa 45 ° C, wie in Fig. 3 gezeigt,

(7) Stabilität Im pH-Wert-üereIch von 7 bis 10,5, wie In Fig. 2 dargestelIt,

(8) Inhibition durch A'thy len-Di ami n-Tetraazetat, Dlisopropy I-Fluorphosphat oder KartoffeI-Hemmungsstoff, jedoch nicht gehemmt durch Trypsin-InhIbitor, o-Phenanthroliη oder Chloi—Quecksilber II-Benzoesäure.

2. Verwendung eines Stammes des Bazillus sp. Nr. 794 (ATCC

21 964 oder FERM-P Nr. 1 522) zur Herstellung der Bad Mopeptldase C nach Anspruch 1 durch Kultivierung des Bazillus sp. Nr. 794 in einer Nährlösung bis zur Ansammlung des Enzyms in der Nährlösung und Gewinnung der BaciI Iopeptidase C durch Extraktion und/oder Filtration der Nährlösung.

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