DE1952012C3

DE1952012C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease

Info

Publication number: DE1952012C3
Application number: DE19691952012
Authority: DE
Inventors: Jyuichiro Takarazuka Fukumoto; Daisuke Sakai Tsuru; Takehiko Amagasaki Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-10-25
Filing date: 1969-10-15
Publication date: 1974-01-24
Also published as: GB1292319A; IT941535B; FR2021538A1; DE1952012B2; DE1952012A1

Description

im Hinblick auf die bekannte Verwendung sehr stabil Trichloressigsäure enthaltenden Lösung zu 1 ml der

sein, ihre enzymatische Aktivität in Gegenwart der Enzymlösung, anschließende Zugabe des Kaseins und

verschiedensten Arten von grenzflächenaktiven Ver- 65 lOminutiges Inkubieren bei 30°C hergestellt. Die

bindungen beibehalten und bei erhöhter Temperatur Einheit der Enzymakt.ivität ist definiert als diejenige

und hohen alkalischen pH-Werten aktiv sein. Menge an Enzym, die trichloressigsäurelösliche Stoffe

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren entsprechend 10y Tyrosin in 10 Minuten in Freiheit

Setzt. Die pH-Aktivitätskurven der F i ß. 2 wtrden nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten, jedoch wurde der entsprechende pH-Wert mit Hilfe eines Puffers eingestellt.

Die Enzymaktivität wird also hinsichtlich der Wirkung des Enzyms gegenüber Kasein bestimmt. Wenn das Kasein durch das Enzym auf die vorstehend beschriebene Weise hydrolysiert wird, wird neben den anderen Aminosäuren eine bestimmte Menge Tyrosin in Freiheit gesetzt. Diese Menge an gebildetem Tyrosin ist ein Maß für die Enzymaktivität. Sie läßt sich leicht mit einer bestimmten Merge an reinem Tyrosin an Hand der UV-Absorption vergleichen. So hat z. B. Tyrosin eine spezifische Absorption bei 275 πιμ. Die Differenz zwischen der Absorption des Testmaterials und der Kontrollprobe im Vergleich zu einer bekannten Menge an Tyrosin, z. B. 10y, bei dieser Wellenlänge ist dann ein Maß für die Aktivität des Enzyms.

In der nachstehenden Tabelle I sind fünf typische Proben von gereinigter Protease von verschiedenen Bacillus subtilis-Stämmen hinsichtlich pH- und Tenv peraturop'timum, pH-Stabilität und Heständiskeit gegenüber verschiedenen Inhibitoren miteinander verglichen. Die neutrale Protease I und die alkalische Protease I wurden aus Kulturflüssigkeit von Bacillus subtilis \ar. amyloliquefaciens Fukumoto isoliert und gereinigt. Die neutrale Protease Il und die alkalische Protease 11 wurden aus Kühlflüssigkeit von Bacillus subtilis var. amylosacchariticus Fukumoto isoliert und gereinigt. Die alkalische Protease 111 wurde unter Einsatz der vier obengenannten ATCC-Stämme von Bacillus subtilis erhalten. Aus der Tabelle geht hervor, daß die alkalische Protease III gegenüber ionischen oder nicht ionischen grenzflächenaktiven Verbindungen überraschend stabil ist. Dies ist bei den angegebenen neutralen und alkalischen Proteasen nicht der Fall. Es liegt auf der Hand, daß die für Waschmittel zu verwendenden Enzyme gegenüber grenzflächenaktiven Verbindungen beständig seiii müssen und unver alkalischen Bedingungen eine 'üo'ne Aktivität und Stabilität aufweisen sollen.

Tabelle

A. Vergleich der Eigenschaften von Proteasen, die von verschiedenen Stämmen von Bacillus subtilis erzeugt wurden

Neutrale Protease

ι Ι π Alkalische Protease

III

pH-Optimum

pH-Stabilitätsbereich

Temperaturoptimum (15 Minuten Umsetzung), °C

Wärmebeständigkeit (in Gegenwart von Calciumionen), "C

6,8 bis 7,3 6 bis 9,5

55 50 7,0
bis 10

52
50

10,3 bis 10,7
5,5 bis 10,8

55 50

10,3 bis 10,7
5,5 bis 10,8

55 50

10,5 bis 11,0 5,5 bis 11.2

55 50

B. Einfluß verschiedener Inhibitoren:

Relative Restaktivität *) nach lstündiger Inkubation

bei pH 7,5 und 30^cC

Neutrale
Protease

I j Il

Alkalische Protease

1 I 11 I ι»

ÄDTA (5 10^Jm)
DFP(2,5 · 10-'m)..

PPI (0,05 °/o)

CuSO₄ (5-10-³m)
HgCI₂ (5-10-³Ti-I)

Tw (0,5%)

Tr (0,5%)

NLS (0.2%)

BKCL (0,2%) ....
ABS (5· 10-³m)...

0	0'	98	98
100	100	40	55
100	100	14	18
5	15	75	98
3	8	12	17
85	90	100	100
92	94	.,,96	98
0	0	59	0
0	0	42	38
0	0	40	30

98 2 1

90 40 100 98 93 67 70

*) Relative Restaktivität: Jede ursprüngliche Enzymlösung

wurde auf eine Konzentration von 100 Einheiten/ml mit kaltem Wasser verdünnt und 1 Stunde auf 30^rC erwärmt. Diese Kontroljösungen haben die Aktivität 100.

ÄDTA = Äthylendiamintetraess'gsäure.

DFP -- Diisopropylfluorphosphat.

PPI - Proterse-Inhibitor aus Kartoffeln.

NLS -- Natriumlaurylsulfat.

BKCL ---- Benzalkoniumchlorid (Gemisch aus Alkyldimetl.ylbenzylammoniumchloriden der allgemeinen Forme! CeH₅CH₁N(CH₃I₅RCI, in der R einen Alkylrest mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeuten.

ABS = Alkylbenzolsulfonat.

Tw -- Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat.

Tr - ' Isooctylphenylpolyäthoxyalkohol.

Die im erfindungsgemälien Verfahren verwendeten Bacillus subtilis-Stämme wachsen im Gegensatz zu den anderen Stämmen sehr gut in einem Nährmedium, dem Natriumlaurylsulfat in einer Endkonzentration von 0,15% einverleibt wurde, und können die gleiche Menge an Protease bilden, unabhängig davon, ob das Nährmedium Natriumlaurylsulfat enthält oder nicht.

Das Verfahren der Erfindung mit den obengenannten vier ATCC-Stämmen von Bacillus subtilis kann entweder in einem flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt werden. Ein flüssiges Nährmedium wird im allgemeinen bevorzugt, und in diesem Fall wird die

Züchtung entweder durch Schütteln oder Belüften durchgeführt.

Das Nährmedium enthält eine KohlenstoRquelle, eine Stickstoffquelle und andere, für den jeweils eingesetzten Stamm notwendige Nährstoffe in solcher

Form, daß sie von Bacillus subtilis assimiliert werden können. Be.spiele für geeignete Kohlenstoffqucllen Sind Kohlenhydrate, wie Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Lactose, Maltose, Glucose. Fructose, Melasse und Abfälle, die bei der Verzuckerung von Holz entstehen. Geeignete Stickstoffquellt η sind Ammoniumsalze, Harnstoff. Pepton, Fleischextrakt, säurehydrolysiertes Kasein, Maisquellflüssigkeit. Sojabohnenmehl. Kasein und Weizenkleie. Als Fermentationsbeschlcuniger können z. B. noch Hefeextrakt, Trockenhefc

und Vitamine zugesetzt werden. Ferner können anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze. Calciumsalze, Kaliuinsalze, Natriumsalze, Eisensalze. Mangansalze oder Zinksalze einzeln oder im Gemisch

zugesetzt werden. Die optimale Fermentationstemperatur liegt bei etwa 25 bis 40~C, der optimale pH-Bereich der Fermentation bei 5,5 bis 8,5, und die Züchtung wird im allgemeinen etwa 20 bis 72 Stunden lang durchgeführt.

Die nach dem Verfahren der Erfindung erzeugte alkalische Protease kann durch Zusatz organischer Lösungsmittel, wie Aceton und/oder Äthanol, in Mengen von etwa 50 bis 65 Volumprozenten oder durch Aussalzen z. B. mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Calciumchlorid oder Natriumchlorid in Mengen von etwa 40 bis 70 Gewichts-Volumprozenten ausgefällt und konzentriert werden. Bei der Züchtung auf festen Nährboden wird das Lösungsmittel oder Salz zu einem wäßrigen Extrakt gegeben. Bei der Züchtung in einem flüssigen Nährmedium wird das Lösungsmittel oder Salz dem Kulturfiltrat einverleibt. Die Protease läßt sich leicht nach herkömmlichen Methoden reinigen, z. B. durch Adsorption und Desorption oder durch Behandlung an Ionenaustauschern.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Anzuchtmedium wurde folgendermaßen zubereitet (alle Prozentangaben in Gewichtsprozent): Bacillus subtilis ATCC 21 415 wurde 2 Tage bei 35⁰C unter Schütteln in einem flüssigen Nährmedium vorgezüchtet, das 5% mit Alkali extrahiertem Sojabohnenkuchen, 3°/o Dextrin, l°/₀ Ammoniumphosphat, 0,03 7o KCl und 0,02°/₀ MgSO₁ ■ 7 H₂O enthielt. Anschließend wurde diese Anzuchtkultur auf einer Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 8 cm und 120 bis 180UpM bei 37°C weiter gezü;ht;t. Es wu den jeweils 50 ml Medium je eine 500 ml fassende Sakaguchiflasche verwendet.

Nach etwa 20 Stunden setzte die Bildung der alkalischen Protease ein, und sie erreichte nach 50 Stunden ein Maximum (13 000 Einheiten/ml). Während der Züchtung stieg der pH-Wert von 7,0 auf 8,0. Neben der alkalischen Protease enthielt das Medium eine geringe Amylase (0,5 bis 1,0 Einheiten/ml) sowie Spuren von Hemicellulase, jedoch keine neutrale Protease oder Cellulase.

Nach beendeter Züchtung wurden 101 des Fermentationsansatzes durch Zusatz eines wasserlöslichen

ίο Calciumsalzes auf eine Endkonzentration von 0,05molarem Calciumsalz und mit 1 normaler Natronlauge auf pH 8,0 eingestellt. Die erhaltene Fällung wurde abzentrifugiert. Das Filtrat wurde zur Entfernung einer geringen Menge von schleimigen Stoffen mit Benzalkoniumchlorid (s. Fußnoten Tabelle I) bis zu einer Endkonzentration von 0,2% versetzt. Nach 2stUndigem Stehen wurde die erhaltene Fällung abfiltriert. Aus dem Filtrat wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration

ao von 70% Sättigung die alkalische Protease ausgefällt. Nach 15stündigem Stehen in der Kälte wurde die erhaltene Fällung abzentrifugiert und getrocknet. Nach teilweiser Reinigung durch Aussalzen wurden etwa 500 μ Enzym mit einer Aktivität von 200 000 Einheiten/g erhalten.

Beispiel 2

Es wurde Bacillus subtilis ATCC 21 416 verwendet. Eine gemäß Beispiel 1 erhaltene Anzuchtkultur wurde entsprechend einer lnoculationsmenge von 10 Volumprozent in 500 ml fassende Flaschen überimpft, d^e je 50 ml des nachstehend genannten Nährmediums enthielten. Dh Züchtung wurde 40 Stunden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die Aktivität der alkalischen Protease im flüssigen Nährmsdium erreichte 10 000 Einheiten/mi.

Zusammensetzung des Nährmediums:

Glucose 1%

Lösliche Stärke 5%

Sojabohnenmehl 1 °/₀

Ammoniumphosphat 0,5°/₀

MgSO₄ · 7 H₂O (pH 7,0) 0,05%

Die Kulturbrühe wurde mit Calciumchlorid auf eine Endkonzentration von 0,05molarer und mit 1 normaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die erhaltene Fällung wurde abzentrifugiert, das Filtrat auf 4'C abgekühlt, mit 2 Volumteilen kaltem Aceton versetzt und 4 Stunden in der Kälte stehengelassen. Die Fällung wurde abzentrifugiert, zweimal mit kaltem Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurde ein gelbstichigbraun gefärbtes Pulver erhalten. Die Ausbeute betrug 88%, und die spezifische Aktivität (Proteaseeinheiten/mg Protein) stieg um das Dreifache an.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde Bacillus subtilis ATCC 21 417 verwendet. Die Aktivität der alkalischen Protease erreichte nach 40 Stunden Fermentation 8000 Einheiten/ml.

Beispiel 4

Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde Bacillus subtilis ATCC 21 418 verwendet. Die Aktivität der alkalischen Protease erreichte nach 40 Stunden 7000 Einheiten/ml.

Vergleichsversuche

Die Versuche wurden unter Verwendung des im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums bei einer Fermentationstemperatur von 30⁰C und einer Fermentationsdauer von 50 Stunden durchgeführt, mit der Ausnahme von Streptomyces moderatus NRRL-3150, der wegen seines langsamen Wachstums 120 Stunden gezüchtet wurde. Die Fermentation erfolgte in einem 250 ml fassenden konischen Kolben mit 30 ml Nährmedium auf einer Rotationsschüttelmaschine.

Die Proteaseaktivität der so erhaltenen Kulturbrühen wurde, wie vorstehend beschrieben, bestimmt. Die F.rgebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Stamm	Lileralurstelle	P/otease- aktivität, Einheiten/ml
Serratia sp. ATCC 21 074 Candida lipolytica ATCC 16 617 Pseudomonas aeruginosa IFO 3446 Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 Streptomyces moderatus NRRL-3150 Cytophaga NCIB 9497 Bacillus subtilis ATCC 21 415 ATCC 21 416 : ATCC 21417 ATCC 21418	französische Patentschrift 1 533 993 französische Patentschrift 1 491 343 britische Patentschrift 967 848 USA.-Patentschrift 3 345 269 USA.-Patentschrift 3 331751 USA.-Patentschrift 3 330 738 gemäß Beispiel 1 gemäß Beispiel 2 gemäß Beispiel 3 gemäß Beispiel 4	700 335 40 60 25 kein Wachstum 13000 10000 8 000 7000

Aus der Tabelle II ist ersichtlich, daß unter Verwendung der im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Stämme von Bacillus subtilis weit höhere Proteaseaktivitäten erhalten werden als mit den bekannten Stämmen der Tabelle II.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

^zur Herstellung alkalischer Protease mit einem pH Optimum von 10,5 bis 11,0, einem Stabihtäts-

Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease bereich von 5,5 bis 11,2 und einem Temperatur-

mit einem pH-Optimum von 10,5 bis 11,0, einem optimum von 55* C, das dadurch gekennzeichnet ist,

Stabilitätsbereich von 5,5 bis 11,2 und einem 5 daß man Bacillus subtilis AICC 21415 Bacillus

Temperaturoptimum von 55 C, dadurch g e- subtilis ATCC 21 416, Bacillus subtilis ATCC 21 417

kennzeichnet, daß man Bacillus subtilis oder Bacillus subtilis ATCC 21 418 in einem flussigen

ATCC 21415, Bacillus subtilis ATCC 21416, oder festen Nährmedium züchtet.

Bacillus subtilis ATCC 21 417 oder Bacillus Untersuchungen der Bildung von Protease durch

' subtilis ATCC 21 418 in einem flüssigen oder io Bacillus subtilis haben ergeben, daß verschiedene

festen Nährmedium züchtet. Stämme von Bacillus subtilis Protease mit erheblich

verschiedenen Eigenschaften bilden können (vgl.

Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 30 [1966],

S. 651 bis 658, S. 856 bis 862, S. 1164 bis 1169 und

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren 15 S. 1261 bis 1268, und Bd. 31 [1967], S. 330 bis 335

zur Herstellung alkalischer Protease. und S. 718 bis 723). Spätere Untersuchungen ergaben

Bekanntlich wird der größte Teil der gegenwärtig das überraschende Ergebnis, daß die mit Hilfe der

verfügbaren Proteaseenzyme bakterieller Herkunft obengenannten vier ATCC-Stämme von Bacillus

durch Züchtung von Stämmen von Bacillus subtilis subtilis erzeugte alkalische Protease eine hohe Be-

^rhalten. Der größte Teil dieser Protease fällt als 20 ständigkeit gegenüber allen Typen von grenzflächen-

Nebenprodukt bei der Amylaseproduktion an. Zahl- aktiven Verbindungen zeigt.

reiche Stämme von Bacillus subtilis bilden sowohl Wie aus F i g. 1 und 2 hervorgeht, können die neutrale als auch alkalische Protease. Da die neutrale Stämme von Bacillus subtilis in vier Typen unterteilt Protease ein instabiles Enzym ist, wird lediglich die werden, die sich durch ihre Proteasebildung unteralkalische Protease in der Lebensmittelindustrie, in der 35 scheiden. Der en.te Typ gehört zu den amylasebilden-Gerberei und der Textilindustrie verwendet. Seit einigen den Stämmen von Bacillus subtilis. Diese Stämme Jahren sind enzymatisch aktive Waschmittel mit einem zeigen eine ausgeprägte Neigung zur Bildung neutraler Gehalt an alkalischer Protease auf dem Markt. Protease, und sie können alkalische Protease erst auf

Im allgemeinen bilden Proteine mit grenzflächen- einer späteren Stufe der Züchtung bilden, wobei die aktiven Verbindungen Komp'-xe. So bildet z. B. 30 neutrale Protease alimählich verschwindet (vgl. F 1 g. Invertase und durch Bakterien erzeugte Λ-Amylase 1-1 und F i g. 2-1). Unter diesen Umständen ist die kristalline Komplexe mit grei..'flächenaktiven Ver- sich ansammelnde Menge an alkalischer Protease bindungen, ohne daß ihre enzymatische Aktivität verhältnismäßig gering. Der zweite Typ kann gleichverlorengeht. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft zeitig alkalische und neutrale Protease bilden. In wurde ein Verfahren zur Herstellung eines sehr 35 diesem Fall tritt nach verhältnismäßig kurzer Zeit eine reinen, wirksamen Enzyms entwickelt (vgl. N ego ro, Abnahme der enzymatisch«! Aktivität auf, da sich J. Biochem. (Tokyo), Bd. 32 [1960], S. 306 bis 327). beide Proteasen gegenseitigbeeinflussen (vgl. F1 g. Mi Es ist ferner bekannt, daß die Wärmebeständigkeit und F i g. 2-II). Der dritte Typ von Bacillus subtilis von Enzymen durch Kombination mit grenzflächen- kann lediglich alkalische Protease bilden. Infolge des aktiven Verbindungen unter bestimmten Bedingungen 40 Fehlens einer Wechselwirkung zwischen zwei ververbessert werden kann (vgl. japanische Patentschrift schiedenen Proteasen kann sich in diesem Fall eine 483 896). Es ist ferner möglich, grenzflächenaktive beträchtliche Menge an alkalischer Protease ansam-Verbindungen zur Reinigung von Enzymen zu ver- mein. Dies trifft auf die vier obengenannten ATCC-wenden, indem man sie unter Bedingungen kombiniert, Stämme von Bacillus subtilis, die im Verfahren der bei denen lediglich das unreine Protein ausgefällt 45 Erfindung verwendet werden, zu (vgl. Fig. l-III und wird. Im Gegensatz zu anderen Enzymen verliert F i g. 2-111). Stämme von Bacillus subtilis des vierten jedoch Protease im allgemeinen ihre enzymatische Typs bilden lediglich neutrale Protease (vgl. F i g. 1-lV Aktivität, wenn sie mit ionischen grenzflächenaktiven und F i g. 2-IV).
Verbindungen in Berührung kommt. Die Proteaseaktivität wurde folgendermaßen be-

Es ist bekannt, alkalische Protease durch Züchten 50 stimmt: 5 ml einer 0,6°/_oigen Kaseinlösung wurden

bestimmter Stämme von Candida lipolytica (franzö- bei 30°C mit 1 ml Enzymlösung versetzt. Nach 10 Mi-

sische Patentschrift 1 491 343), Serratia (französische nuten wird die Umsetzung durch Zusatz von 5 ml einer

Patentschrift 1 533 993), Pseudomonos aeruginosa Lösung abgestoppt, die in einem Gesamtvolumen

(britische Patentschrift 967 848), Cytophaga (USA.- von 1000 ml 36 ml einer 50°/₀igen (Gewicht/Volumen)

Patentschrift 3 330 738), Streptomyces moderatus 55 Trichloressigsäurelösung, 220 ml einer lmolaren Na-

(USA.-Patentschrift3 331 751) und Arthrobacter urea- triumacetatlösung und 330 ml einer lmolaren Essig-

faciens (USA.-Patentschrift 3 345 269) herzustellen. säurelösung enthält. Das nicht umgesetzte Kasein

Bei Jiesen Verfahren werden jedoch nur realtiv wurde so ausgefällt und die erhaltene Fällung mit

niedrige Ausbeuten an alkalischer Protease erhalten. einem Filterpapier bestimmter Porengröße abfiltriert.

Ziel der Erfindung war es daher, ein mit hohen 60 Die optische Dichte des Filtrats wurde bei 275 mu.

Ausbeuten verlaufendes Verfahren zur Herstellung gegen eine Substrat-Kontrollösung bestimmt. Die

einer alkalischen Protease zu schaffen. Sie sollte ferner Kontroilösung wurde durch Zugabe von 5 ml der