DE2044984A1 - Mikrobielle Amylase und deren Her stellung - Google Patents

Description

2044984 PATENTANWALT DR.-ING. LOTTERHOS

^(MAIN) Ajinomoto Co., Inc·, No₀ 7, 1-chome, Takara-cho . fernsprecher, (o^s/sso** Chuo-fcu, Tokyo, Japan TELEGRAMME; LOMOSAPATENT
LANDESZENTRALBANK 4/951
POSTSCHECK-KONTO FFM. 1Ö67

Y/K FRANKFURt(MAIN)₁ lOoSeptember 197c

Mikrobielle Amylase und deren Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf neue Arten von Amylasen und deren Produktion durch Bakterien«»

Es sind schon zahlreiche Amylasen aus Tier- und P'flanzenkörpern isoliert worden seit den Arbeiten von Kohn und Ohlsson in den ' 2oer Jahren. Einige der Amylasen werden auf dem Gebiet der stärkeverwendenden Industrien, Pharmazeutika und Enzymologie verwendet. Alle bekannten Amylasen sind im sauren oder neutralen pH-Bereich wirksam. Amylasen, die im alkalischen Bereich wirksam sind, sind bislang nicht bekannt gewordene

Es wurde gefunden, dass man Amylasen herstellen kann, die im neutralen und alkalischen Bereich wirksam sind, wenn man Bakterien des Genus Bacillus auf einem Nährmedium unter aerohen Bedingungen kultiviert·

Amylasen, die gemäss Erfindung erhalten werden können, umfassen , Amylasen, deren optimaler pH-Wert innerhalb eines Bereiches von 6,5 bis 8, Amylasen, deren optimaler pH-Wert innerhalb eines Bereiches von 9>o bis 1o,o, sowie Amylasen, deren optimaler pH-Wert innerhalb eines Bereiches von 9»5 bis 11,5 liegto

Bakterien, die Amylasen dieser neuen Typen produzieren, umfassen Bacillus subtilis AJ-3249, Bacillus subtilis AJ-325o (FEEM P-374)j> (Mikroorganismen mit FEEM P-Nummern sind hinterlegt in the Fermentation Sesearch Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry, Japan, von wo die Stämme der Allgemeinheit zugänglich sind) Bacillus subtilis AJ-3252 (FEEM P-375), Bacil-

'j fit I '"'■■ O c U >-\ ~'r ·.·; .)

lus sp AM255 (WEBM. P«376^ Bacillus sp AJ&-3298 (I¹EHM B-660); so« wi· Bacillus sp AJ«3299 (FERM P~661),>

Zar Produktion der Amy lasen wird ein Bakterium des Genus Bacillus mit der Fähigkeit, neutrale oder alkalische Amylase zu. produzieren, auf einem Medum, das mindestens einen assimilierbaren Kohlenstoff lieferanten_f mindestens einen assimilierbaren Stickstoff«« lieferanten₃ anorganisch© Salze und organische Nährstoffe' enthält₉ kultiviert» Die assimilierbaren Kohlenstofflieferanten umfassen

i Kohlenhydrate, wie Glucose, Stärke, Dextrin oder Maltosej und

organische Säuren, wi© Essigsäure· Beispiele für die assimilier«· baren Stickstofflieferanten sind anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid j Aiamoniumsulf at oder Ammoniumnitrat _s und tirgani·«

t. sehe Stickstoffverbindungen, wie So^abohnenkuchen_e Sojaboh.ien·-

pmlver, Milchkasein, Pepton₉ Milchmolke^ Fleischextrakte ui.d ' Amino säurea© *.

Die Kultivierung wird bei einer Temperatur im Bereich von 25^bis 45$ vorzugsweise von 3© bis 4©*G_S unter aeroben Bedingungen, I Schütteln^, Eühran und/oder Belüftung durchgeführt» Der pH-Wer:, des Kulturmediums hängt von den eingesetzten Stämmen ab und beV> trägt z.B. für Bacillus subtilis ΑΛ.324-9, AJ-325o (FERM Ρ*·37^)/, und AJ-3252 (EEHM P«375)₅6,5 bis 8,0, für Bacillus sp AJ«3255 (ΈΈΗΜ P-376) 8»p bis 10,0 und für Bacillus sp AM298 (FERM P« 660) und AJU3299 (FEHM P-661) 9,0 bis

Zur Isolierung der in dem Kulturmedium produzierten neutralen und/oder alkalischen Amylase werden die Bakterienzellen abzen*· trifugiert oder abfiltriert, die Amy läse durch Zusatz von anor*· ganischen Salzen, wie Ammoniumsulfat oder natriumsulfat, und/ oder organischen. Lösungsmitteln, wie Aethanol oder Aceton, gekrallt und der erhaltene Nieder solllag ab zentrifugiert oder abfil«· triert· Man kann auch Ionenaustauscher zur Reinigung und Isolierung benutzen*

Die gemäse Erfindung produzierten Amylasen haben sich für viele Zwecke nützlich erwiesen· In roher Form können die Amylasen als Additive für Protease enthaltende Waschmittelkempoeitionen einge* setzt werden· Sie eignen sich auch zur Zersetzung unlöslicher

109812/1S29

BAD ORIGINAL

•bestärken in Dränagen, die aus Fabriken für Kartonpapier (cardboard) abgeführt werden und aus alkalischer Paste besteheno

Die Amylaseaktivität wurde mittels einer Variante der Methode von Wahlgenuth bestimmt, wonach 9 ecm M/10 Phosphatpuffer (pH 7,o) öder M/10 Boratpuffer (Atkins-Pantin-Puff er) (pHi 9»5) mit einem Gehalt von o_e65 g/1oo ecm löslicher Stärke mit 1 ecm Enzymlösung gemischt und die Mischung statisch bei 4o^eG der Inkubation unterworfen wurde» Danach wurde 1 ecm Proben die in Intervallen entnommen worden war* zu einer Mischung aus 4 ecm 0,44 M Trichloressigsäure und 3 ecm ' J -KJ-lösung gegeben und die Zeit, bis die optische Dichte der Reaktionsmischung bei 66·πιμ betrug, gemessen»

Einheit/cem « Min· bis* zur 0.D. von o_t$oo bei 66ο 'ητμ ^{x io x}

Verdünnung der Enzymlösung

Als Einheit wurde die Amylaseaktivität definiert, die 6,ο mg lösliche Stärke in 1o Minuten zersetzte©

Eigenschaften der Amylasan

Die durch Bacillus subtil!« AJ-3249, AJW325o (EEEM P-374) und AJ-3252 (PERM P«375) produzierten Amylasen haben folgende Eigenschaften:

1) Dir optimale pH-Bereich liegt im Bereich von 6,5 bis 8,0 bei 4o^eG, wie Fig« 1 zeigt»

2) Die Enzymaktivität ist noch, nach einem Erhitzen auf 5o°C für 60 Miauten vorhanden»

3) Die Enzyme sind stabil bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9»o»

4) Glucose, Maltose undÄxtrin werden während der Hydrolyse von Stärke durch Amylase innerhalb einer längeren Zeit produziert, und 80 % der eingesetzten Stärke wird zersetzt»

5) Die Amylaeen werden durch Chelatbildner, wie Natriumtripoly*· phosphat (TPP), EDTA und Ifatriuianitrilotriacetat (HTA) nicht inaktiviert» was Tabelle 1 zeigt· In der Tabelle ist die restlich.« Amylaseaktivität in Prozenten der initialen Aktivität angegeben· Bei allen Untersuchungen wurden 1o· Einheiten / ecm reine Enzy»18aung und 100 mg TPP (5o mg EDTA oder 5· mg NTA) in 5o ecm ©$o3 M Barbitalacetat-Pufferlösung (pffi

109812/1R29

BAD ORIGiNAL

21

1) h

7fO) gelöst und die Reaktionsmischung bei 5o*C der Inkubation unterworfen*

Tabelle .1

Enzym	Chelate	Aktivität	1o	nach	Minuten	(%)
	bildner	O	34	2o	3©	6o
Spitase GP«-3	TPP	1oo	35	O	G	O
Klei st as e M«2o	TPP	1oo	98	O	O	O
Amy läse von AJ»*325o	TPP	1oo	95	95	93	9©
Amylase von AJ«325o	EDTA	1oo	97	92	89	8o
Aiaylase von AJ«325o	NTA	1oo	95	91	85

Spitase CP<-«3: Amylase des Handels, hergestellt von Nagase & Go. Ltdο 9 Osaka Japan

P Kleistase M«2e: Amylase des Handels, hergestellt von

Daiwa Kasei Co«, Ltd_#i Osaka, Japan'

Die alkalische Amylase von Bacillus sp AJ«3298 (FERM P«66o) hat folgende Eigenschaften:

1) Der optimale pH-Bereich liegt im Bereich von 1o,o bis 1o,7, wie Figo 2 zeigt· In Fig„2 ist die relative Amylaseaktivität

gegen die maximale Aktivität aufgetragen» In allen Versuchen wurden 1oo Einheiten/ccm ieines Enzym in 5o ccüoa o,1 M Borat« puffer (pffi 9#o bis 11_$o) gelöst und die Reaktionsmischung bei M-O⁰G 1o Minuten der Inkubation unterworfen»

2) Das Enzym ist stabil bei pH«Werten von 7«ο und 1o_so, wie Ta« belle 2 zeigt» In allen Versuchen wurde eine Mischung ν·η

h 1oo Einheiten /ecm Enzymlösung und M/25«Britton«Robinson·-.

Pufferlösung bei 3©^eO 24 Stunden bei den in der Tabell· ange« gebenen pH-Werten der Inkubation unterworfen und die restli*»» ch® Enzymaktivität bei pH 9^5 (ο_β1 Μ Boratpuffer) bestimmt»

Tabelle 2

Restliche Enzymaktivität (%) bei pHi

5·ο β^ο 7«o 8.ο 9«ο Ιο,ο 11,0 ο 1ο 75 83 92 88 ο

3) Das Enzym ist stabil in Gegenwart von Ohelatbildnern oder einem im Handel erhältlichen Reinigungsmittel, wie Tabelle 3 seigt© 1o Einheiten/cem der Enzymlösung wurden bei 5o*C in Gegenwart von 1/1oo M (molar) Galciumionen» 2 g/1oo ecm TPP oder o,2 g/1oo cem "Tide" (im Handel erhältliches Reinigung®« mittel von Procter & Gamble) der Inkubation unterworfen*

10981?/ 1F29

BAD ORIGINAL

Tabelle 5

in Gegen** wart von	restliche O	Enzymaktivität nach Minuten (%) 1o 2o 3o	So	7o
	1oo	83	1oo	9o
Ga+	1oo	1oo	74	63
TPP	1oo	86	5	O
Tide	84	25

Die alkalische Amylase von Bacillus sp AJ~3299 (FEBM P«-661) hat folgende Eigenschaften:

Alle Untersuchungen wurden in der gleichen Weise wie bei der Amylase von Bacillus sp AJV-3298 durchgeführt«

1) Der optimale pEWffert liegt im Bereich von 1o,o bis 11_f$i_t wie Figo 3 zeigt.

2) Die Stabilität des Enzyms ist in Tabelle 4-gezeigt»

Tabelle 4

restliche Enzymaktivität (%) bei pH

6«o 7.0 8»o 8«5 9»o 1o#o 1o«5 11«o ο 21 8o 95 9o 7o 5 ο

3) Die restliche Enzymaktivität bei Inkubation in Gegenwart verschiedener Ionen ist in Tabelle 5 angegeben»

Tabelle 5

in Gegen**-	restliche Enzymaktivität	1o	2o	42
wart von	ο	7©	55	55
	1oo	75	6o	O
0a++	1oo	1o	O	58
TPP	1oo	75	6o	O
TPP und Ga+*	1oo	O	O	2o
Tide	1oo	4o	32
Tide und Ga+*	1oo

Die alkalische Amylase von Bacillus sp AJ-3255 (FESK P»376) hat folgende Eigenschaften:

1) Der optimale pH-Wert liegt im Bereich von 9»o bie 1e_fo bei 4o^eG, wie Fig» 4 zeigt*

2) Die Enzyaaktivität ist vorhanden bei pH-Wertem im Bereich von 6,o bis 11 to bei 4o°G« Die Enzymaktirität wurde in der gleit« chen Weise wie bei Baoillue lubtilie AJm3298 beatimnt»

3) Die restlich· Sasymaktivität bei der Inkubation in Gegenwart von Galoiuaionen oder TPP ist in Tabelle 6 angegeben»

1Π 4 4 Γ) Ö A

»•6*··-
Tabelle 6

in Gegen- restliche Enzymaktivität (%) nach. Minuten wart von ο 1o 2o 3o

— 1oo 9o 8o 6o Ca⁺⁺ 1oo 98 95 94 TPP 1oo 2o ο ο

Die Erfindung soll durch folgende Beispiele näher erläutert, hieraus jedoch keine Beschränkung hergeleitet werden»

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium aus 1 g/1oo ecm Sojabohnenkuchenex·«· trakten (als Trockensubstanz), 1 g/1oo ecm Polypepton und 8 g/ ™ 1oo ecm löslich® Stärke von pH 7»o hergestellt, Je 5o ecm des Mediums in 5oo ecm Schüttelkolben gegeben und 2o Minuten bei 12o°C sterilisierte Das Medium wurde mit einer Schlinge voll. - (loopful) Bacillus subtilis AJ~325® (FEBM P«374) beimpft, das auvor auf einer Agarschrägschnitte aus 2 g/1oo ecm löslicher Stärke, 1 g/1oo ecm Hefeextrakten, 1 g/1oo eem Polypepton und ^oi5 g/1oo ecm NaGl bei 34^eC 24 Stunden kultiviert worden war* und danach bei 34*0 96 Stunden unter Schütteln kultiviert» Das Kulturmedium enthielt - wie gefunden wurde » 25oo Einheiten pro ecm Amylase bei pH 7»0o

Aus 93o ecm Kulturmedium — gesammelt aus 2o Kolben — wurden ^ durch Zentrifugieren die Bakterienzellen entfernt, dem erhaltenen 85o com überstehende' Flüssigkeit wurden 365 g festes Ammoniumsulfat zugefügt und die Lösung über Nacht unter Kühlen stehen gelassen* Die ausgefallene Amylase zentrifugierte man ab (iooo Upm, 2o Minuten) und trocknete sie Ik Vakuum über Nacht unter Kühlen, wobei man rohes Enzympulver alt 36o ©oo Einheiten/ g Amylas« in einer Menge von 51₉o g (Isolationsausbeute 87 %) erhielt«

Beispiel 2

Man stellt· ein Kulturmedium, das 4 g/1oo ecm entfettetes Soja·· bohnenpulver und 3 g/1oo com Stärke enthielt« her (pH 7,o),beimpfte 5o eem des Mediums mit Bacillus sub tills 1JW3249 mud führte die Kultivierung bei 34*C % Standen vmter Sekiittel* durch· Das Kulturmedium enthielt 195© Einheiten/cc» Amylase ¥ei

pH 7»·»

109817/1529 _BAD

20U004

9oo ecm des Mediums wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise weiter aufgearbeitet, wobei man 28 g rohes Enzympulver, das 52 000 Einheiten/g Amylase enthielt, erhielt (Isolationsausbeute 80 %y*

Beispiel 3

Bacillus subtilis AJ~325² (FEEM P-375) wurde auf einem Medium , das 1 g/1oo ecm Polypepton, 1 g/1oo ecm Fleischex·- trakte und 5 g/1oo ecm lösliche Stärke (pH 8,0) enthielt, bei 37 ⁰C 12o Stunden kultiviert· Das Kulturmedium enthielt - wie ge« funden wurde ~ 21oo Einheiten/ccm Amylase bei pH 7,o.

Beispiel 4- ,

Von einem Kulturmedium, das 5 g/1oo ecm Kartoffelstärke, o,3 g/ I00 ecm Polypepton "und 1 g/100 ecm Natriumcarbonat enthielt, (pH 1o,5) wurden 2o ecm in ein grosses Testrohr gegeben, das Medium mit einerSchlinge voll Bacillus sp AJ-3255 (IERM P-376) beimpft, der zuvor auf einer Agarschrägschnitte, die 2 g/100 ecm lösliche Stärk·, o_$5 g/1oo ecm Natriumnitrilotriacetat_s 1g/ I00 cem Polypepton, 1 g/1oo ecm Hefeextrakte, o_t5 g/1oo ecm KaCl und 2 g/100 ecm Agar (pH, 8,0) enthielt, bei Jo ⁰C 27 bis 48 Stunden kultiviert worden war- Dei 3o°0 76 Stunden unter Schütteln kultivierte Das Kulturmedium enthielt ·-. wie gefunden wurde «- II.0 Einheiten pro ecm Amylase bei pH 1o,o«

Aus Kulturmedien aus 5o !Eestrohren - 87o ecm ~ wurden die Bakte« rienzellen absentrifugiert (1o 000 Upm, 1o Minuten) und die überstehende Flüssigkeit (72o ecm) mit 337 S festem Ammonium·-· sulfat versetzt, die erhaltene Lösung in einem Eisbehälter über Naeht gekühlt, der gebildete Niederschlag abzentrifugiert (1o 000 Upm, 2o Minuten) und im Vakuum getrocknet, wobei man 3*79 g rohee Amylasepulver mit 16 7oo Einheiten/g Amylase (Iso« lationsausbeute 80 %) erhielt»

Beispül 5

Bacillus sp AJ-3255 (FEBM P«376) wurde auf einem Medium, das 8g/ loo «em lösliche Stärk·9 1 g/100 ecm Polypepton und 1 g/100 ecm Sojabohnenkuchenextrakte enthielt» bei pHi 1ojo bei 3o°C 96 Stun» den unter Schütteln kultiviert· Das Kulturmedium enthielt ~ wie gefunden wurde ·· 35© Einheiten/ccm Amylase bei pffi 9,5.

1098 1711£70

„_ - . _ _{BAD 0RJGINAL}

2 Π 4 4 ^Λ: ^ 4

115ο ecm des Kulturmediums wurden in der in Beispiel 4 angegebenen Weise weiter aufgearbeitet, wobei man 7»56 g (Isolationsausbeute 89 %) rohes Enzympulver erhielt, das 4o 1oo -Einheiten/g Amylase enthielt«.

Beispiel 6

Ein Kulturmedium, das 5 g/1oo ecm Mais(corn)stärke, 1 g/1oo ecm Polypepton₉ 1 ccm/1oo ecm ¹¹AJi Eki" (Warenzeichen für Sojabohnenpro teinhydrοIysat), o,o5 g/1oo ecm KEyPO^ und o,o2 g/1oo ecm MgSO^oTH₂O enthielt, wurde mit Bacillus e sp AJ-3298 (FERM P-66o), der zuvor auf einer Agarschrägschnitte, die 2 g/ 1oo ecm lösliche Stärke, 1 g/1oo ecm Polypepton, 1 g/1oo ecm Hefeextrakte, o,5 g/1oo ecm NaCl und 2 g/1oo ecm Agar (pH 9»5) enthielt, kultiviert worden war,* Dei pK 9»5 bei 34*!C 6o Stunden unter Schütteln kultivierte Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zusatz von Ammoniakwasser auf 9|5 gehalten» Das Kulturmedium enthielt « wie gefunden wurde - I2o Einheiten/ccm Amylase bei pH 1o,5o

8oo ecm des Kulturmediums wurden in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise weiter aufgearbeitet, wobei man 3₉5 g rohes Enzympulver erhielt, das 19 ooo Einheiten/g Amylase enthielt (Isolationsausbeute 79,3 %)o

Beispiel 7

Bacillus sp AJ«3299 (FEEM P-661) wurde auf einem Kulturmedium, das 8 g/1oo ecm lösliche Stärke, 2 g/1oo ecm Fleischextrakte, 2 g/1oo ecm Polypepton, o,25 g/1oo ecm NaCl, ο,5 g/1oo ecm Sojabohnenkuchenextrakte und 1g/1oo ecm Natriumcarbonat (pH 9»5) enthielt, bei 34^eC 96 Stunden unter Schütteln kultivierte Das Kulturmedium enthielt - wie gefunden wurde — 25o Einheiten/ccm Amylase bei pH. 1o,5·

Aus 21oo ecm Kulturmedium wurden 13j4 g rohes Enzympulver mit 25 ooo Einheiten/g Amylase erhalten (Isolationsgmsbeute 74»7%)ο

* beimpft und

109817/1529

BAD ORIGINAL

Claims (8)

Patentansprüche

1) Mikrobielle Amylase mit optimalem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 11,5·

2) Mikrobielle Amylase mit optimalem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis S₉O, die in Gegenwart von Chelatbildnern stabil ist»

3),. Alkalische Amylase mit optimalem pH-Wert im Bereich von 9«o bis 11,5» die im pifr-Bereich von 6,o bis 11,5 stabil ist©

4) Verfahren zur Produktion von Amylase . mit optimalem pH*-Wert im Bereich von 6,5 bis 11$5t dadurch gekennzeichnet, dass ein Bakterium auf einem Medium, das mindestens einen Kohlenstoff*» lieferanten, mindestens einen Stickstofflieferanten, anorganische Salze und organische Nährstoffe enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert wird»

5) Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierung ein Bacterium des Genus Bacillus unterworfen wird«

6) Verfahren nach Ansprüchen 4 oder 5· dadurch gekennzeichnet, dass als Bacterium ein Stamm von Bacillus subtilis eingesetzt wird«

7) Verfahren nach Ansprüchen 4· oder 5» dadurch gekennzeichnet, dass als Bacterium Bacillus subtilis PERM P-374- oder PERM P-375 eingesetzt wird«

8), Verfahren nach Ansprüchen 4 oder 5% dadurch gekennzeichnet, dass als Baoteriua Bacillus ep PERM P-66o_s PERM P-661 oder PERU Ρ·-·376 eingesetzt wird»

10981?/1629

L e e r s e i t e