DE2925427C2 - Verfahren zur Herstellung von Protease - Google Patents

Description

Es ist allgemein bekannt und Gegenstand vieler industrieller Herstellungsverfahren, proteolytische Enzyme relativ hoher Aktivitäten durch Züchten von Mikroorganismen verschiedener Gattungen, z. B. Stämmen der Güiiung Füsarium, Gibereiia, Streptomyces, Aspergillus. Penicillium. Cytophage, Arthrobacter, Serratia, Pseudomc-nas, Bacillus zu gewinnen. Diese Proteasen weisen Unterschiede hinsichtlich ihrer Substratspezifität und ihrer optimalen Wirkung in Abhängigkeit vom pH-Wert und von der Temperatur, aber auch hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber verschiedenen schädigenden Einflüssen auf. So läßt das Beständigkeitsspektrum derart erhaltener marktgängiger, alkalischer Proteasen einige Wünsche offen, insbesondere im Hinblick auf die Stabilität gegenüber Chelatbildnzrn. Aber auch gegen die unterschiedlichen grenzflächenaktiven Verbindungen ist im allgemeinen keine einheitliche Stabilität vorhanden, sondern diese schwankt in sehr weiten Grenzen, wodurch die Einsatzmöglichkeiten der so gewonnenen proteolytischen Enzyme eingeschränkt werden.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung einer Protease hoher enzymatischer Aktivität mit breitem Beständigkeits-Spektrum und insbesondere hoher Stabilität gegenüber Chelatbildnern aufzufinden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Herstellen von Protease durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährboden, der assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, und anschließendes Abtrennen des während der Kultivierung erzeugten proteolytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus licheniformis, Varietät 300, hinterlegt unter der Nummer OR 48 am Laboratorium voor Microbiologie. Microbenverzameling, Delft, züchtet.

Der beanspruchte Mikroorganismenstamm P 300 wurde am 23.4.1971 unter der Hinterlegungsnummer OR 48 im Laboratorium voor Microbiologie, Microbenverzameling, Delft (Nederland), Julianalaan 67 A deponiert.

Die morphologischen und stotfwechselphysiologischen Eigenschaften des Stammes P 300 wurden untersucht und zur Bestimmung der Gattung und Spezies insbesondere mit den Angaben des »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« verglichen. Es wurden folgende Eigenschaften festgestellt:

1. Größe der vegetativen Zellen: 0,8 μm breit und 2-3 μηι lang. Die Zellen sind an den Enden abgerundet: sie treten im allgemeinen einzeln,

häufig paarweise, jedoch selten in Ketten vereinigt auf. Die Zellen sind beweglich,
2. Die Sporen sind oval, zentral bis terminal, 0,8 μπι breit und 12 — 1,4 μιη lang.

3. Die Sporenmutterzelle ist meist leicht angeschwollen.

4. Die Gramfärbung ist positiv.

5. Die Gelatineverflüssigung ist positiv.

6. Die Kolonieform auf Bouillon-Agarplatten ist groß, ίο weißlich-grau, glatter Rand mit Einbuchtungen.

Ältere Kolonien haben eine rauhe Oberfläche. Junge Kolonien sind sehr schleimig. Die Kolonien bilden manchmal Blasen.

7. Wachstum des Stammes auf unterschiedlichen Nährboden.

a) Bouillon-Schrägagar: gutes Wachstum, weißlich-grau, schleimig-feucht, rauhe Oberfläche.

b) Glukose-Schrägagar: Wachstum vveniger gut als auf Bouillon-Agar, weißlich-grau, schleimig-feucht, mit Häutchenbildung.

c) Kartoffelagar:

Platte: rötlich-braune Kolonien, leicht feucht; Schrägagar: weißlich- bis rot-bräunlich, feuchtes Wachstum.

d) Glukose-Asparaginagar:

Platte: reichliches Wachstum, gelblich-weiß, schleimig;

Schrägagar: reichliches Wachstum, rötlichweiß, teils schleimig, teils trocken.

e) Nährbrühe: starke Oberflächenhaut, weißlichgrau, Brühe sonst klar.

0 NaCI-Bouillon: gutes Wachstum noch in 7%iger NaCI-Brühe; Wachstum noch bis zu 15%iger NaCI-Konzentration möglich.
g) Milch:starke Koagulation.

h) Magermilchplatten: gute caseolytische Hofbildung, Auswirkung der gebildeten Protease.

8. Amylasenachweis:

amylolytische Hofbildung auf Stärke-Agarplatten.

9. Lipasenachweis:

lipolytische Hofbildung auf Tributyrin-Agarplatten. 10. Voges-Proskauer-Nachweis:

Bildung von Acetylmethylcarbinol positiv.
■r> II. Verwertung von Zitrat:
positiv.

12. Reduktion von NOj-zu NO₂-:
positiv.

13. Reduktion von NO₂-:
ίο positiv

14. Anaerobe Gasbildung aus:
Nitratbouillon: positiv.

15. Anaerobe? Wachstum in Glukose-Peptonbrühe:
positiv.

16. WaChStUmJnNH₄-GlUkOSe:
positiv.

17. Kohlehydratverwertung: Säurebildung aus Arabinose, Xylose, Glukose, Laktose, Galaktose, Maltose, Mannit, Mannose, Fruktose, Rhamnose, Saccha-

M> rose und Stärke; keine Gasbildung.

18. Lecithinase-Nachweis; negativ,

19. Saccharase-Nachweis: Wachstum auf Saccharose als alleiniger Kohlenstoffquelle positiv.

20. Katalase-Nachweis: positiv.
t>5 21. Arginase-Nachweis: positiv.

22. Wachstums-Temperaturen: Wachstum zwischen 3O⁰C und 55°C,gutes Wachstum um 39⁰C.

23. Sauerstoff-Bedürfnis: aerob, fakultativ anaerob.

Bei Vergleich der vorstehenden Testergebnisse mit den Angaben des »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« über das Wachstum des Organismus auf speziellen, unterschiedlichen Nährmedien sowie über spezielle Stoffwechsel- und Nachweisreakiionen wurde in den meisten Punkten die weitestgehende Ähnlichkeit mit der Spezies Bacillus licheniformis festgestellt Wir möchten daher den neu isolierten Organismus als eine Varietät des Bacillus licheniformis bezeichnen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Protease kann in einem flüssigen oder festen Niihrmedium durchgeführt werden, wobei das flüssige Nährmedium im allgemeinen bevorzugt wird Bei Züchtung in einer Nährlösung wird nach dem üblichen Schüttel-Kultur oder Fermentationsverfahren gearbeitet

Der zu verwendende Nährboden wird auf die übliche Weise hergestellt und soll eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere von dem Mikroorganismus benötigte Nähr- und Wachsstoffe enthalten. Als geeignete KohleiKrtoffquellen sind Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glukose, Fruktose, Maltose und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen. Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, Harnstoff, Casein, Gelatine, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl bzw. -kuchen in Frage. Weiterhin können anorganische Salze wie beispielsweise Natrium), Kalium-, Ämmoniumhydrogenphosphate. Calcium- und Magnesiumsalze dem Nährboden zugesetzt werden. Ferner kann es vorteilhaft sein, Fermentationsbeschleuniger wie z. B. Hefeextrakt und Vitamine d<:m Nährboden zuzusetzen.

Die Fermentationstemperatur kann sich in den Grenzen von 25°C bis 55°C bewegen, ist aber vorzugsweise zwischen 35—tO°C zu wählen. Der pH-Wert des Nährbodens kann 5,0 ?.■■; 9,0 betragen, js vorzugsweise 6,5-8,0. Die Züchtung wird im allgemeinen in einer Zeit von 20-72 Stunden durchgeführt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease kann aus der filtrierten oder zentrifugierten Nährlösung nach üblichen Methoden durch Zusatz organischer Lösungsmittel oder durch Aussalzen mit z. B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Calciumchlorid ausgefällt und konzentriert werden. Eine Reinigung läßt sich durch Dialyse-Verfahren oder durch Behandlung an Ionenaustauscherharzen bewerkstelligen. Auch eine direkte, selektive Absorption an Kationenaustauschern, die sowohl synthetischer Art sein können als auch durch Substitution von Cellulose oder ihren Abkömmlingen gewonnen werden, ist aus der geklärten, mit Wasser im Verhältnis 1 : 1 bis ><> 1 :10 verdünnten Kulturlösung möglich.

Zur Kennzeichnung der erhaltenen Protease ist deren Molekulargewicht anzuführen, das 25 000±3000, bestimmt durch Gelfiltration, beträgt. Als Nebenprodukt sind ca. 1% höhermolekulares Protein und ca. 25 — 50% r"> niedere Proteine bzw. Peptide in der gewonnenen Protease enthalten. Aus der Inaktivierung durch Phenylmethansulfonylfluorid ist weiterhin zu schließen, daß es sich um eine Protease mit essentiellem Serin handelt.

Messungen der proteolytischen Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert und der Temperatur haben ergeben, daß das pH-Optimum der erfindungsgemäß erhältlichen Protease bei 50°/15 Minuten Inkubation bei pH 10—11, und daß ihr Temperaturoptimum bei 15 Minuten Inkubation in Gegenwart von 0.5% Pentanatriumtriphosphat (TPP) und 0.9% Casein bei 65° C liegt.

Die nach dem erfindungsgemaßen Verfahren hergestellte Protease kann aufgrund ihrer hohen Aktivität und ihres breiten Beständigkeitsspektrums, insbesondere gegen Chelatbildner, z. B. weitestgehende Verwendung in der industriellen Reinigung finden, z. B. in Brauereien, Molkereien, Fleischwaren-, Fischwaren- und sonstigen Lebensmittelfabriken.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten Protease und handelsüblicher Produkte sowie die Messung der Restaktivitäten nach der Inaktivierung durch verschiedene Zusätze wie Seife, Chelatbildner, Perborat und synthetische grenzflächenaktive Verbindungen erfolgte nach einem Verfahren, das in der Zeitschrift »Tenside«, 7. Jahrg., Heft 3 (1970), Seite 125-132 in allen Einzelheiten beschrieben ist Die üblichen Analysenmethoden zur Bestimmung der proteolytischen Enzymaktivitätec sind sämtlich auf die Untersuchung reiner Enzyme oder technischer, handelsüblicher Enzymkomzentrate abgestellt Durch die inaktivierenden Zusätze wie Seife. Perborat, Chelatbildner usw. können nach den bisherigen Methoden Ergebnisverfälschungen auftreten, die in der Methode begründet sind und nach dem hier verwendeten Verfahren vermieden werden.

Das Arbeitsprinzip der Bestimmungsmethode ist kurz folgendes. Man läßt eis Enzym oder enzymhaltige Produkt in Wasser von 15° deutscher Härte und in Gegenwart von Natriumtripolyphosphat unter festgelegten Bedingungen auf Standardcasein einwirken. Durch Zugabe von Trichloressigsäure unterbricht man die Reaktion und fällt das unabgebaute Casein. Nach Filtration wird die Extinktion des Filtrates gegen eine Blindprobe bestimmt, bei der ein enzymatischer Abbau durch Vorlage einer genügenden Menge Trichloressigsäure verhindert wurde. Die gemessene, von den aromatischen Anteilen (besonders Tyrosin) der in verdünnter Trichloressigsäure löslichen Abbauprodukte herrührende Extinktion dient als Maß für die Enzymaktivität. Praktisch wird so vorgegangen, daß man die Extinktion des Filtrats der Probe im Maximum bei 275 μπι gegen das der Blindprobe mit einer Schichtdicke von 1 cm mißt. Von der gefundenen Extinktion wird der bei 300 μπι gemessene Wert abgezogen. Die Differenz ΔΕdient in der Formel zur Berechnung der Aktivität in Proteaseeinheiten (PE) pro Gramm Enzympräparat. Dieser Untergrundabzug soll den eventuellen Einfluß unterschiedlicher Trübung von Probe und Blindprobe so gut wie möglich eliminieren. Die Aktivität in Proteaseeinheiten pro Gramm Enzympräparat ergibt sich dann: PE/g = zlE Verdünnungsfaktor/Schichtdicke (cm) ■ 20. wobei der Verdünnungsfaktor = Volumen der angesetzten Enzymlösung (ml)/Einwaage (g) ist. Als Definition für die Enzymaktivitätseinheit ergibt sich, daß eine Enzympräparation eine Proteasen-Aktivität von 1000 Einheiten besitzt, wenn eine Lösung von 1 g Enzympräparation in 100 ml einer Extinktionsdifferenz von 0,500 liefert.

Beispiel 1

Zur Bereitung des Nährbodens wurden in 1 I Wasser 50 g lösliche Stärke. 20 g Sojabohnenmehl, 10 g Casein. 5 g (NH₄J₂HPO₄ und 0.5 g Magnesiumsulfat dispergiert. Der pH-Wert des Mediums wurde vor dem Sterilisieren mit verdünnter Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt. Nach der Sterilisation ergab sich ein pH-Wert von annähernd 7.0. In den Nährboden wurde der Bacillus licheniformis. Varietät 300 eingeimpft und unter Schütteln bei 37 C 42

Stunden gezüchtet. Nach dieser Zeit wurde zentrifugiert und die zentrifugierte Brjhe zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäß vorgenanntem Verfahren verwendet. Dabei ergab sich, daß die Brühe eine enzymatische Aktivität von 13 800 Proteaseeinheiten (PE) pro ml besaß.

Beispiel 2

Bei diesem Versuch wurde zur Züchtung des Bacillus licheniformis, Varietät 300 in einem 20-1-Fermenter mit 121 Nährmedium gearbeitet Der Nährboden enthielt 10% durch Bakterieri-Amylase abgebaute Kartoffelstärke, 2% Sojabohnenmehl, 1,5% Gelatine und 1% Na₂HPO₄ in Leitungswasser. Die Rührgeschwindigkeit des eingebauten Blattrührers betrug 700 Umdrehungen pro Minute. Die Belüftung betrug 12 l/Minute, d. h. ein Verhältnis von Volumen-Nährlösung zu zugeführtem Volumen Luft von 1 :1. Der pH-Wert des Nährbodens wurde während der Fermentation nachreguliert und bei 7,0 gehalten. Die Temperatur betrug während der Züchtung, die über einen Zeitraum von 55 Stunden durchgeführt wurde, 39° C. Nach dieser Zeit wurde zentrifugiert und in der zentrifugierten Lösung nach vorstehend genanntem Verfahren die Prouaseaktivität bestimmt. Hierbei wurde festgestellt, daß die erhaltene Lösung eine enzymatische Aktivität von 18 000 Proteaseeinheiten (PE) pro ml besaß.

Beispiel 3

Dieser Versuch zur Züchtung des Bacillus licheniformis, Varietät 300 wurde in einem 15-I-Fermenter mit 10 1 Nährmedium durchgeführt. Zur Bereitung des Nährbodens wurden 1000 g durch Amylase abgebaute Kartoffelstärke, 250 g Sojabohnenmehl, 100 g Casein, 50 g Gelatine, 100 g Maisquellwasser, 150 g Na₂HPO₄ und 5 g Magnesiumsulfat in Leitungswasser suspendiert und auf 101 aufgefüllt. Der pH-Wert des Nährbodens wurde mit verdünnter Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert der Lösung 6,5. Nach Beimpfung des Nährbodens mit dem Bacillus licheniformis, Varietät 300 wurde 50 Stunden bei 39°C gezüchtet. Dabei wurden zur Belüftung pro Minute 101 Luft eingeleitet, und die Rührgeschwindigkeit betrug 300 Umdrehungen pro Minute. Nach Abschluß der Züchtung w?irde zenfrifugiert und in der erhaltenen Lösung wurde nach oben genanntem Verfahren die enzymatische Aktivität bestimmt. Diese betrug 19 400 PE/ml.

Zur weiteren Aufarbeitung wurden 5 I der zentrifugierten Fermenterbri'he mit 100 g Calciumchlorid krist. versetzt, auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und filtriert Das Filtrat wurde im Vakuum bis auf 1,7 1 eingeengt. Durch langsamen Zusatz von 425 g Natriumsulfat sicc. wurde aus der eingeengten Lösung das Enzym ausgefällt und durch Filtration abgetrennt. Dabei wurden aus den 5 I zentrifugierter Brühe 98 g Protease in Pulverform erhalten. Die enzymatische Aktivität der gewonnenen Pulverprotease wurde nach dem vorstehend genannten Verfahren zu 750 PE/mg bestimmt.

Zur Bestimmung der Stabilität der gemäß vorliegendem Verfahren durch Züchtung des Bacillus licheniformis, Varietät 300 gewonnenen Protease wurden Lösungen des nach Beispiel 3 gewonnenen Enzyms bei unterschiedlichen Temperaturen der inaktivierenden Einwirkung verschiedener Chelatbildner, grenzflächenaktiver Produkte und Perborat ausgesetzt. Die Einwirkungszeiten wechselten dabei von 15 Minuten bis zu 60 Minuten. Zum Vergleich wurde mit handelsüblichen proteolytischen Enzymen (nachfolgend Protease A, B, C oder D genannt) in gleicher Weise verfahren. Anschließend wurden die Restaktivitäten bestimmt und au-^f die Anfangsaktivität, die mit 100 eingesetzt wurde, bezogen. In die vergleichenden Stabilitätsprüfungen wurden folgende proteolytischen Enzyme einbezogen:

1. Erfindungsgemäße Protease P 300. Unverschnitte-

nes Enzym, ca. 600 000 PE/g.
ίο 2. Protease A.

U η verschnittenes Enzym, ca. 500 000 PE/g.
3. Protease B.

Mit Na₂SO₄ auf ca. 100 000 PE/g verschnittenes Enzym.
is 4. ProteaseC.

Mit Na₂SO₄ auf ca. 100 000 PE/g verschnittenes Enzym.
5. Protease D.

Mit Na₂SO₄ auf ca. 100 000 PE/g verschnittenes Ehzym.

Die Stabilität wurde geprüft gegen folgende Produkte:

A) Nitrilotriessigsäure, Natriumsalz

B) Äthyiendiamintetraessigsäure, Natriumsa.'z
C) Natriumperborat

D) Lineares Alkylbenzolsulfonat mit einer Alkylkettenlängenverteilung 4,1% Ci₀, 51% Cn, 343% C_T2 und 10,6% Cu

E) Natriumsalz des Sulfates eines Anlagerungsproduktes von 22 Mol Äthylenoxid an 1 Mol Fetialkohol der Kettenlängen C₎₂/C|₄ im Verhältnis 70/30

F) Natronseife auf Basis gesättigter Fettsäuren einer Kettenlängenverteilung 38% C₁₂-Ci₆, 30% Ci₈-C₂₀ und 32% C₂₂

G) Anlagerungsprodukt von 10 Mol Ethylenoxid an 1 Mol Oleyl-Cetylalkoholgemisch der Jodzahl 45.

Zur Bereitung der einzelnen Lösungen wurden folgende Hilfsreagenzien benötigt:

Synthetisches Leitungswasser, das entsprechend den Angaben des Verfahrens zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten, wie es in der Zeitschrift Tenside, 7. Jahrgang, Heft 3 (1970), Seite

4-5 125—132 beschrieben ist, hergestellt wurde. Hierzu wurden jeweils 58,15 g CaCl₂ ■ 2 H₂O, 28 g MgCI₂ - 6 H₂O und 42 g NaHCO₃ in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf 2 1 aufgefüllt 100 ml dieser Vorratslösung wurden unter Rühren in

ίο einem 5-L-Stutzen zu 3 I destilliertem Wasser gegeben, diese Menge in ein IO-1-Gefäß überführt und mit destilliertem Wasser auf 101 aufgefüllt. Das so erhaltene synthetische Leitungswasser von 15° deutscher Härte ditni für die Zubereitung eines Teils der Lösungen von Substanzen, gegen die die Stabilität der Enzyme geprüft wurde.

Pufferlösung, die zur Herstellung der einzelnen Enzymlösungen diente. Als Pufferlösung wurde eine 0,005 molare Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan verwendet, die durch Lösen von 6,05 g dieser Substanz in 91 dest. Wasser, Erwärmen auf die später gewünschte Inkubationstemperatur_v Zugabe von Salzsäure bis zum Erreichen des gewünschten pH-Weries, Abkühlen und Auffüllen auf 10 I erhalten wurde.

b5 Für die Durchführung der Stabilitätsprüfung wurden zunächst jeweils die in den Tabellen angegebenen Lösungen 1 und 2 hergestellt und zwar Lösung 1 durch Lösen der angegebenen Mengen Prüfsubstanz in 100 ml

synthetischem Leitungswasser bzw. destilliertem Wasser, Erwärmen auf die später gewünschte Inkubationstemperatur, Zugabe von Salzsäure oder Natronlauge bis zum Erreichen des gewünschten pH-Wertes und Abkühlen, und Lösung 2 durch Lösen der angegebenen Enzymmengen in 100 ml Pufferlösung. Gleiche Volumenteile der Lösungen I und 2 wurden bei Raumtemperatur vermischt, und gleich nach dem Vermischen wurde eine Probe zur Bestimmung der Aktivität (ΔΕυ) vor der Einwirkung der Priifsubstan/ bei erhöhter Temperatur entnommen. Der Rest wurde in J Teile aufgeteilt und bei der in den Tabellen angegebenen Temperatur inkubiert. Nach den angegebenen Inkubationszeiten wurden wiederum Proben zur Aktivitätsbestimmung [AEt) entnommen. Die erhaltenen Mittelwerte aus den 3 ι Bestimmungen wurden in die nachstehenden Tabellen eingetragen. Die prozentuale Änderung der Aktivität durch den Einfluß der Prüfsubsianzen ergibt sich durch die Rückbeziehungauf die AusKangsaktivität AEo= 100.

Bei der Ermittlung der Aktivitäten wurde in . Anlehnung an die in der Zeitschrift Tenside, 7. Jahrgang. Heft 3(1970),Seite 125-132 beschriebene Vorschrift so vorgegangen, daß man zu den vorstehend genannten Zeiten aliquote Teile der in den nachstehenden Tabellen genannten Lösungen mit Casein inkubierte, durch Zugabe von Trichloressigsäure abstoppte, filtrierte und die Extinktionen der Filtrate bei 275 und 300 μιη gegen entsprechend der angeführten Literaturstelle angefertigte Blindproben bestimmte. Diese Extinktionsunterschiede sind in den nachstehenden Tabellen mhAEound AEt bezeichnet und sind ein Maß für die Aktivität der Untersuchungsproben. Hierbei stellt AEo, wie bereits angegeben, die Werte für Proben dar, die zwar die Stabilitätsbeeinflussenden Chemikalien enthielten, aber die noch keiner Wärmebeeinflussung ausgesetzt waren. Die Werte von AEt sind bei den gleichen Proben nach der angegebenen Wärmebeeinflussung gemessen worden. Das Verhältnis von AEt :AEo ist ein Maß für die Stabilität des eingesetzten Enzyms unter den gewählten Bedingungen, und aus ihm wurde durch Rückbeziehung auf AEo=]00 die nach der Wärmebeeinflussung verbliebene Aktivität in Prozenten der ursprünglich vorhandenen errechnet.

Bei den Stabilitätsprüfungen wurden für die einzelnen Enzyme und Prüfsubstanzen die nachstehend aufgeführten Werte ermittelt.

Tabelle 1

Bei dieser Prüfung wurden die Stabilitäten gegen das Natriumsalz der Nitrilotriessigsäure bei einer Inkubationstemperatur von 55° C, einer Inkubationszeit von 60 Minuten und einem pH-Wert beider Inkubationstemperatur von 8,0 ermittelt.

Lösung I	Lösungs	Lösung 2	Aktivitäten	A El	Rest
Einwaage	mittel	Einwaage	J Ευ		aktivitäten
					A Ei ■ 100
					A Eo
g/100 ml	synthetisches	mg/100 ml		0,48	in %
0.08	Leitungswasser	10 mg P 300	0,505		95
				0,62
		7 mg Protease A	1,08	0,47	57
		25 mg Protease B	0,57	0,26	82
		25 mg Protease C	0,34	0,79	76
	50 mg Protease D	0,86	92

Tabelle 2

In diesem Fall wurden die Stabilitäten gegen das Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure bei einer Inkubationstemperatur von 50° C, einer Inkubationszeit von 15 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.

Lösung 1 Einwaage	Losungs mittel	Lösung 2 Einwaage	Aktivitäten A Eo A Ei	0,43	Rest- aktivitälen A El - 100
				0,11	A Eo
g/100 ml		mg/100 ml		029	in %
0,002	dest. Wasser	10 mg P 300	0,52	0,21	82
		7 mg Protease A	1,09	0,55	10
		25 mg Protease B	0355	52
		25 mg Protease C	0,34	62
		50 mg Protease D	0,84	66

IO

Tabelle 3

Bei diesem Versuch wurden die Stabilitäten gepen das Natriumperborat bei einer Inkubationstemperatur von 50° C, einer Inkubationszeit von 30 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.

Lösung 1	Lösungs	Lösung 2	Aktiv itä	le n	Rest
Einwaage	mittel	Einwaage	.1 Eo	Δ El	aktivitäten
					Δ Et ■ 100
					Δ Eo
g/100 ml	dest. Wasser	mg/100 ml			in *'«
0,02		2,3 mg P 300	0,16	0,10	64
		2 mg Protease A	0,35	0,215	61
		17 mg Protease B	0,34	0,20	59
		17 mg Protease C	0,225	0,14	62
	17 mg Protease D	0.225	0,15	67

Tabelle 4

Dieser Versuch diente der Stabilitätsermittlung gegenüber dem linearen Alkylbenzolsulfonat D) bei einer Inkubationstemperatur von 40° C, einer Inkubationszeit von 30 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur.

Lösung I	Lösungs	Lösung 2	Aktivitäten	A Et	Rest
Einwaage	mittel	Einwaage	A Eo		aktivitäten
					A Et ■ 100
					A Eo
g/100 ml	dest. Wasser	mg/100 ml		0,21	in%
0,10		10 mg P 300	0,48	0,19	44
		7 mg Protease A	0,90	0,24	21
		25 mg Protease B	0,52	0,02	46
		25 mg Protease C	0,24	0,31	8
	50 mg Protease D	0,75	41

Tabelle 5

Bei dieser Prüfung wurden die Stabilitäten gegenüber dem Alkyiäthersulfat E) bei einer Inkubationstemperatur von 50° C, einer Inkubationszeit von 60 Minuten und einem pH-Wert von 9 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.

Lösung 1 Einwaage

g/100 ml

0,05

Lösungsmittel

dest. Wasser

Lösung 2
Einwaage

mg/100 ml

Aktivitäten
A Eo A Ei

10 mg P 300
7 mg Protease A
25 mg Protease B
25 mg Protease C
50 mg Protease D

Restaktivitäten

A Et ■ 100 A Eo

0,53	0,17	32
0,825	0,63	76
0.585	0.10	17
0,39	0,05	12
0,84	0,07	8

Il

12

Tabelle 6

\,\ In diesem Versuch wurden die Stabilitäten gegenüber der Natronseife F) bei einer Inkubationstemperatur von (■;, 45° C, einer Inkubationszeit von 30 Minuten und einem pH-Wert von 9 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.

Lösung 1	Lösungs	Lösung 2	Aktivitäten	Resl-
[iinwaage	mittel	Einwaage	.1 Eo J El	aktivitaten
				Λ El ■ 100
				J Eo
g/100 ml	mg/100 ml		in 7»

0.04 dest. Wasser 15 mg P 300 0.79 0,67 84

mg Protease A 0.84 0.035 4

mg Protease B 0,63 0.515 82

mg Protease C 0,40 0.05 13

mg Protease D 0,90 0.46 51

Tabelle 7

Dieser Versuch diente der Stabililatsermittlung gegenüber dem Athylenoxidanlagerungsprodukt G) bei einer Inkubationstemperatur von 60° C, einer Inkubationszeit von 60 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur.

Lösung 1
Einwaage

g/100 ml

Lösungsmittel

I ösung 2 liinwaage

mg/!uOml Aktivitäten
J Eo .1 Ei

Restaklivitäten

.1 Ei ■ HH)

.1 Eo

in "j

0,05

synthetisches Leitungswasser mg P 300

mg Protease A
mg Protease B
mg Protease C
mg Protease D

0.S45 0.56

1.09
0.53
0.475
0.49

0.49
0.42
Ü.315
0.38

66

45

79 67 77

Wie den vorstehenden Stabilitätsprüfungen entnommen werden kann, besitzt die erfindungsgemäß hergestellte Protease eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber Chelatbildnern wie Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure. Wenn gegenüber anderen Prüfsubstanzen nicht immer der beste Wert erreicht werden konnte, so waren die Stabilitäten doch auch in diesen Fällen durchaus befriedigend und weisen die erfindungsgemäß hergestellte Protease als ein Produkt mit bemerkenswert breitem Beständigkeitsspekt um aus.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß mit seiner Hilfe eine Protease hoher en/ymatischer Aktivität mit einem breiten Beständigkeitsspektrum und insbesondere hoher Stabilität gegenüber Chelatbildnern in einer hohen Volumenausbeute hergestellt werden kann.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zum Herstellen von Protease durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährboden, der assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, und anschließendes Abtrennen des während der Kultivierung erzeugten proteolytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus licheniformis, Varietät 300, hinterlegt unter der Nummer OR 48 am Laboratorium voor Microbiologie. Microbenverzameling, Delft. züchtet.