DE1906001C3 - Alkaliproteasen und sie enthaltende Waschmittel - Google Patents

Description

Es wurde gefunden, daß gewisse Mikroorganismen, die zur Gattung Fusarium oder Gibberella gehören, Alkaliproteasen bilden, die eine hohe proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert um 11 haben. Ferner wurde gefunden, daß diese Proteasen die verschiedensten Arten von Proteinen bei hohem pH-Wert auch in Gegenwart von oberflächenaktiven Mitteln und'oder Chelatbildnern wirksam abbauen, so daß sich ihre Eignung auf dem Waschmittelgebiet anbietet

Zwar werden bereits gewisse Enzyme beim Waschprozeß verwendet, jedoch werden hierbei nicht immer gute Ergebnisse erzielt Einer der möglichen Gründe hierfür liegt darin, daß der pH-Wert der Waschlauge in den meisten Fällen über 8 liegt Ein weiterer Grand liegt darin, daß die enzymatische Aktivität zuweilen durch oberflächenaktive Mittel und/oder Chelatbildner, die in Waschmitteln enthalten sind, gehemmt wird.

Die Enzyme gemäß der Erfindung, die nachstehend als »Alkaliproteasen« bezeichnet werden, weisen diese Nachteile nicht auf, sondern haben eine hohe Aktivität im pH-Bereich von 8,0 bis 12,0, insbesondere von 10,0 bis 11,5. Sie können gemäß der Erfindung nach einem vorteilhaften Verfahren großtechnisch hergestellt und in Waschmitteln und anderen Reinigungsmitteln verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung sind Alkaliproteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie über den pH-Bereich zwischen 8,0 und 12,0 wirksam sind, daß ihre optimale Temperatur für die Enzymaktivität zwischen etwa 20 und 6O⁰C liegt, und daß sie durch Züchten von einem der Stämme

Fusarium oxysporam IFO 5942,
Fusarium oxysporam f. batatas IFO 4468,
Fusarium oxysporam f. gladioli IFO 5894,
Fusarium oxysporum f. lini IFO 5880,
Fusarium oxysporum f. neveum IFO 4471,
Fusarium oxysporum f. lini vasinfectum
IFO 4472,
Fusarium solani IFO 5232,

50

60

65 Fusarium sp. S-19-5 IFO 8884,

GibbereUa fujikuroi IFO 5268 und

Gibberella saubinetii IFO 6608

in einem flüssigen oder festen Nährmedium und durch Isolierung und Reinigung aus den Nährmedia gewonnen worden sind.

Die in Klammern genannten IFO-Nummern sind die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan.

Vod diesen Mikroorganismen ist Fusarium sp. S-19-5 einer der vorteilhaftesten Stämme für die Bildung der Alkaliprotease. Das erfindungsgemäße Enzym, das der Stamm der Nummer IFO 8884 bildet besitzt die in Beispiel 3 angegebenen Eigenschaften. Dieser Stamm wurde von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert und hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:

1. Kultureigenschaften (24° C, 7 Tage)

1) Malzsuppe: gutes Wachstum, weiß; Bildung einer flockigen Haut, auf der Rückseite faltig, im Medium ein scharlachpurpurrotes Pigment

2) Malzagar: gutes Wachstum, weiß und flockig; reichliche Lufthyphen, auf der Rückseite faltig, scharlachpurpurrotes Pigment im Medium.

3) Czapek-Nährlösung: gutes Wachstum, weiß, Bildung einer flockigen Haut auf der Rückseite faltig, im wesentlichen kein Pigment

4) Czapek-Agar: gutes Wachstum, weiß und flockig; auf der Rückseite faltig, im wesentlichen kein Pigment

5) Gelatine: gutes Wachstum, weiß und flockig; dunkles schwärzlichpurpurrotes Pigment auf der Rückseite; schwache Verflüssigung.

6) Kartoffeldextrose: gutes Wachstum, weiß und flockig; Oberfläche uneben, erhaben, auf der Rückseite faltig, weiß bis hellpurpurrot; Bildung von purpurrotem Pigment im Medium.

2. Mikroskopische Eigenschaften

Auf jedem der vorstehend genannten Medien entwickeln sich Konidienträger aus den Lufthyphen; unverzweigt, 10 bis 60 μ lang, 1,0 bis 1,5 μ breit, Hyalin. Konidien werden apikal auf den Konidienträgern gebildet und ballen sich zu einem schleimigen Büschel zusammen; eiförmig oder nierenförmig, ein- bis zweizeilig, selten dreizellig; 5 - 8 χ 1 - 2 μ, Hyalin. Keine Geschlechtsausbildung. Chlamydosporen fehlen gewöhnlich und sind zuweilen vorhanden.

3. Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumsbedingungen: Wasserstoffionenkonzentration: wächst vorzugsweise in alkalischen Medien, optimal zwischen pH 8,0 und 9,0. Temperatur: optimal bei etwa 24° C; wächst auch zwischen 15 und 28° C, jedoch ist bei etwa 15° C besseres Wachstum als bei 28° C zu beobachten. Sauerstoff: aerob.

2) Gelatineverflüssigung: gering.

3) Ausnutzung von Äthylalkohol: negativ.

4) Abbau von Pektin: sehr gering.

5) Abbau von Tannin: negativ.

6) Abbau von Fetten und ölen: positiv.

7) Ausnutzung von Kohlehydraten: nutzt Maltose, Galactose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, Fructose, Mannose, Raffinose, Dextrin, Stärke, Glucose

und Lactose aus. Nutzt Inulin, Xylose, Arabinose und Cellulose nur in geringem Maße aus. Gemäß »Dictionary of the Fungi« (G. CAinsworth,5.

Auflage) zeigen diese mikrobiellen Eigenschaften,

daß dieser Stamm zur Gattung Fusarium, Familie

Tuberculariaceae, Ordnung Moniliales, Unterklasse Deutermycetes, Klasse Fungi Imperfecti, gehört Nach der Klassifizierung von Sny<jer & Hansen wird Fusarium in die Sektionen Ai und A₂ wie folgt unterteilt: Ai: Mikrokonidien werden gebildet, gewöhnlich einzel-

lig. A₂: Mikrokonidien werden nicht oder selten gebildet; spindel-, komma- oder nierenförmig, ein- bis mehrzellig.

Der Mikroorganismus Fusarium sp. S-19-5 bildet überwiegend Mikrokonidien und kann in die Elegans-Gruppe von Sektion A einbezogen werden. Typisch für die Elegans-Gruppe ist Fusarium oxysporum. Sie umfaßt 36 Spezies, die sämtlich Pflanzenpathogene sind, die reichlich Makrokonidien bilden.

Der Mikroorganismus Fusarium sp. S-19-5 bildet jedoch in den meisten Fällen nur Mikrokonidien, während die Bildung von Makrokonidien sehr selten ist Dieses Merkmal zeigt, daß der Mikroorganismus keiner der bisher bekannten Spezies dieser Gruppe zugeordnet werden kann.

Zur Kultivierung der in dem Anspruch 1 genannten Mikroorganismen, die Alkaliprotease bilden, können übliche Kulturmedien verwendet und übliche Bedingungen angewendet werden. Das Medium kann flüssig oder fest sein. Die Kultivierung kann unter stationären Bedingungen durchgeführt werden, jedoch ist es vorteilhafter, mit Schüttelkulturen oder aeroben Kulturen zu arbeiten.

Beliebige Medien, auf denen die Alkaliprotease bildenden Mikroorganismen zu wachsen vermögen, können verwendet werden. Das Medium kann beispielsweise als Kohlenstoffquellen Glucose, Saccharose, Dextrin, Stärke, Cellulose, Glycerin, Sorbit u. dgl. und als Stickstoffquellen Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Sojabohnenkuchen, Reiskleie, Weizenkleie, Kartoffelextrakt, Kasein, Gluten, Kaseinhydrolysat, Maisquellwasser, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate und andere organische oder anorganische Stickstoffverbindungen enthalten. Als anorganische Salze können beispielsweise verschiedene Phosphate, Sulfate und Hydrochloride zugesetzt werden. Unter gewissen Bedingungen können zur Förderung des Wachstums des Mikroorganismus verschiedene Vitamine, Aminosäuren, Nukleinsäuren und ihre verwandten Verbindungen zugesetzt werden. Je nach dem Kulturverfahren und den anzuwendenden Bedingungen kann durch Zusatz eines natürlichen oder synthetischen Schaumverhütungsmittels, z. B. Sojabohnenöl oder Siliconöl, eine verstärkte Anhäufung des Enzyms erreicht werden.

Zur Kultivierung eines der Mikroorganismen wird vorzugsweise eine kleine Vorkultur hergestellt, die dann in ein Hauptkulturmedium geimpft wird.

Die Kluturbedingungen, z. B. Bebrütungstemperatur und -zeit, pH-Wert des Mediums, Belüftungsmenge usw. variieren mit den Mikroorganismen und mit der Zusammensetzung des Mediums. Voraussetzung ist, daß die Bedingungen so gewählt und geregelt werden, daß die Anhäufung der Alkaliprotease maximal ist. In vielen Fällen wird unter den folgenden bevorzugten Bedingungen gearbeitet: Bebrütungstemperatur 20 bis 30⁰C, Bebrütungsdauer 2 bis 7 Tage, pH-Wert des Mediums etwa 7, Belüftung 0,5 bis 1,5 l/Minute/l Medium. Hierbei häuft der Mikroorganismus große Mengen Alkalipro tease in der Kultur an.

Bei Verwendung eines flüssigen Mediums wird das gewünschte Enzym hauptsächlich in der Flüssigphase der Kultur angehäuft Es ist daher zweckmäßig, das Mycel durch Filtration oder Zentrifugieren abzutrennen

ίο und dann das Enzym aus dem Filtrat oder der obenstehenden Flüssigkeit zu gewinnen und zu isolieren.

Bei Verwendung eines festen Mediums ist es gewöhnlich zweckmäßig, die Kultur vorher mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes zu extrahieren ^nd dann das Enzym aus dem erhaltenen Extrakt abiutrennen.

Das Enzym kann aus dem Kulturfiltrat, der obenstehenden Flüssigkeit oder dem Extrakt nach beliebigen üblichen Methoden isoliert und gereinigt werden. Geeignete Methoden sind das Aussalzen des Enzyms mit einem anorganischen Salz, z. B. Natriumsifat, Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, und die fraktionierende Fällung des Enzyms durch Zusatz eines geeigneten hydrophilen organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol oder Aceton. Ferner kann eine Enzymlösung unter vermindertem Druck eingedampft und/oder durch Dialyse entmineralisiert werden. Geeignet sind ferner die Adsorption und Desorption an Calciumphosphatgel, Aluminiumoxyd, Bentonit und Ionenaustauschharzen, die Chromatographie unter Verwendung eines Cellulosederivate, z. B. Diäthylaminoäthylcellulose, die Gelfiltration, Fällung, Elektrodialyse, Elektrophorese und die Entfernung der Verunreini- gungen als Schwermetallkomplexe.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Alkaliproteasen sind über den weiten pH-Bereich zwischen 8,0 und 12,0, insbesondere im pH-Bereich von 10,0 bis 11,5 wirksam.

Die optimale Temperatur für die Enzymaktiv'tät liegt zwischen etwa 20 und 60⁰C, insbesondere zwischen etwa 40 und 50⁰C. Dieser Temperaturbereich für die Aktivität stimmt mit den üblichen Waschbedingungen überein. Die Aktivität wird ferner nicht durch oberflächenaktive Mittel und/oder Chelatbildner gehemmt, die die Bestandteile von Wasch- und Reinigungsmitteln sind.

Für Waschmittel können die Alkaliproteasen nicht nur als hochreine Präparate, sondern auch als rohe Enzymprodukte verwendet werden, die je nach dem Verwendungszweck in der gewünschten Reinheit erhalten werden. Als Bestandteil von Wasch- und Reinigungsmitteln können reine oder rohe Enzympräparate verwendet werden.

Als oberflächenaktive Mittel können in den Waschmitteln die verschiedensten Verbindungen enthalten sein, z. B. anionaktive Mittel vom Typ der fettsauren Salze, Sulfate oder Sulfonate, z. B. Seife von natürlicher Fettsäure (NS), Alkylsulfate (DAE), Olefinsulfate, n-«-OIefinsulfonate (AOS), Tetrapropylbenzolsulfonate (ABS) und n-Alkylbenzolsulfonate (LAS), und nichtionogene oberflächenaktive Mittel vom Äther- oder Estertyp, z.B. Polyoxyäthylenalkyläther, Polyoxyäthylenalkylphenoläther, Alkylester von mehrwertigen Al-

b5 kcholen, Polyoxyäthylenalkylester und Zuckerester.

Als weitere Bestandteile der Wasch- und Reinigungsmittel kommen in Frage: Gerüststoffe, z. B. Tripolyphosphat, Sulfate. Carbonate, Borate und Carb-

oxymethylcellulose, Fluoreszenzfarbstoffe, Duftstoffe, Bleichmittel, ζ. B. Perborate, Chelatbildner, ζ. Β.

N(CH₂COONa),,

Hautschutzmittel, z. B. Dimethyllaurylaminoxyd, und Desinfektionsmittel, z. B. tertiäre Amine.

Die Alkaliprotease wird mit den anderen Bestandteilen des Produkts gemischt, das pulverförmig, körnig oder flüssig sein kann. Wenn das erhaltene Gemisch flüssig ist, kann es nach üblichen Verfahren, z. B. durch Zerstäubungstrocknung, zu einem Pulver oder körnigen Produkt getrocknet werden.

Da es keine internationale Einheit für die Aktivität dieser Enzymart gibt, ist es schwierig, den Anteil des Enzyms in Wasch- und Reinigungsmitteln allgemein vorzuschreiben.

Für die Zwecke der Erfindung wird die Aktivität der Alkaliprotease nach der folgenden modifizierten Kunitz-Methode bestimmt (J. Gen. Physiol. 30, 291, 1947): 1,0ml einer 2%igen wäßrigen Kaseinlösung (Hammars t e i n) und 0,5 ml eines 0,1 molaren Glycin-NaOH-Puffers, pH 11,0, werden mit 0,5 ml einer Enzymlösung gemischt. 2,0 ml des erhaltenen Gemisches werden 20 Minuten bei 37° C bebrütet, worauf die Reaktion durch Zusatz von 3,0 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure abgebrochen wird. Das Gemisch wird weitere 30 Minuten bei 37^CC gehalten, wodurch das nicht abgebaute Kasein vollständig ausgefällt wird. Das ausgefällte Kasein wird abfiltriert, worauf die optische Dichte des Filtrats bei 275 Γημ bestimmt wird. Hieraus wird die Menge des abgebauten Kaseins als Tyrosinmenge berechnet. Eine Einheit der Proteaseaktivität (PU) wird definiert als die Enzymmenge, die die 1,0 μg Tyrosin entsprechende Kaseinmenge pro Minute unter den Versuchsbedingungen löste. Die spezifische Aktivität einer Enzymprobe ist in PU/mg ausgedrückt

Der Anteil der Alkaliprotease, der Wasch- und Reinigungsmitteln zuzusetzen ist, variiert mit der Art der Produkte. Bei einem Waschmittel für Stoffe und Wäsche kann die bevorzugte Menge im allgemeinen Bereich von 5 bis 10 000 Einheiten/g Waschmittel, insbesondere im Bereich von 10 bis 5000 Einheiten/g liegen.

Ein in der vorstehend beschriebenen Weise hergestelltes Wasch- und Reinigungsmittel, das Alkaliprotease enthält hat eine überaus starke Reinigungswirkung bei eiweißhaltigen Flecken, die auf Schweiß, Blut, Soße und Milch, die mit üblichen Waschmitteln schwierig zu entfernen sind, zurückzuführen sind. Das Waschmittel kann sowohl für die Vorwäsche als auch für die Hauptwäsche verwendet werden.

Bei der Vorwäsche wird das schmutzige Waschgut gewöhnlich einige Stunden bei Raumtemperatur in einer Lauge eingeweicht, während die Hauptwäsche vorzugsweise etwa 1 Stunde bei erhöhten Temperaturen zwischen 40 und 60° C durchgeführt wird.

In den Beispielen sind die Prozentsätze auf Basis von Gewicht/Volumen berechnet Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

500 Raumteile eines flüssigen Mediums aus 5% entfettetem Sojabohnenmehl, 5% Glucose und 2% Natriumdihydrogenphosphat werden nach Einstellung auf pH 7 in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hat sterilisiert und zur Herstellung einer Impfkultur mit Fusarium sp.

S-19-5 (IFO 8884) geimpft und 5 Tage bei 28°C unter Belüftung und Bewegung bebrütet.

Die Impfkultur wird in einen Fermenter (Fassungsvermögen 50 000 Raumteile) geimpft, der 30 000 Raumteile des gleichen flüssigen Mediums enthält. Die Kultivierung wird 144 Stunden bei 25° C bei einer Luftzufuhr von 45 000 Raumteilen/Minute und bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 UpM durchgeführt. Während der Kultivierung wird die Schaumbildung unterdrückt, indem von Zeit zu Zeit eine geeignete Menge Sojabohnenöl zugesetzt wird.

Die Änderung des pH-Wertes und der Proteaseaktivität im Verlauf der Kultivierung ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Kultivierungs	pH-Wert der	Enzymaktivität	67
dauer	Kultur		141
Stunden		(PU/ml)	1430
O	7,30		2250
18	6,40	2270
30	6,30	2520
42	6,12	2520
54	6,35	2750
66	6,72	2540
78	7,30
90	7,09
122	7,50
144	7,50
	Beispiel 2

Eine Kultur, die nach 144 Stunden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden ist, wird auf etwa 5° C gekühlt und dann mit einem Filterhilfsstoff durch eine Filterpresse geleitet, wodurch das Macel entfernt wird. Zu den erhaltenen 20 000 Raumteilen Filtrat wird ungesättigtes Ammoniumsulfat gegeben und die ausgesalzte Fällung wird mit dem Filterhilfsstoff abfiltriert Die erhaltene Ammoniumsulfatfällung, die den Filter hilfsstoff enthält, wird in 6000 Raumteilen kaltes Wassei gelöst. Die unlöslichen Bestandteile werden durch Filtration entfernt Zum Filtrat wird 0,6gesättigte: Ammoniumsulfat gegeben, wodurch das Enzym erneui ausgefällt wird. Das Enzym wird durch Zentrifugierer abgetrennt in 1000 Raumteilen kalten Wassers gelöst gegen kaltes Wasser mit einer Fischhautmembran A Tage dialysiert und lyophilisiert, wobei ein rohes Enzyrr erhalten wird. Auf die vorstehend beschriebene Weise sind 30 Gew.-Teile rohes Enzympulver von bräunlichei Farbe gebildet worden. Diese Probe hat eine spezifische Aktivität von etwa 980 PU/mg.

Beispiel 3

30 Gew.-Teile des auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellten rohen Enzyinpulvers werden ir 3000 Raumteilen kalten Wassers gelöst Die unlöslicher Stoffe in der Enzymlösung werden mit dem Fflterhüfs-

<v stoff abfilrriert, wobei eine klare Lösung erhalten wird Zum klaren Filtrat wird ungesättigtes Ammoniumsulfai gegeben, wobei das Enzym ausgefällt wird Die Fällung wird in 1500 Raumteilen kalten Wassers gelöst, mii Kohle entfärbt, 4 Tage bei 4 bis 5°C gegen kaltes Wasser dialysiert und lyophilisiert wobei als Produkt 44 Gew.-Teile eines teilweise gereinigten Enzympulven

erhalten werden, das eine spezifische Aktivität von Tabelle 1

1580 PU/mg hat.

Eine Lösung von 4,5 Gew.-Teilen des En/.ympulvers in 450 Riiunitcilen eines 0,0¹ molaren Tris-HCI-Pulvers, der einen pH-Wert von 9,0 hat, werden 3 Tage gegen > einen 0,001 molaren Tris-HCI-Puffer, der einen pH-Wert von 9,0 hat, dialysiert, durch eine Säule von Diethylaminoethylcellulose gegeben, die vorher mit dem Tris-HCI-Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Etwa 675 Raumteile der κι enzymreichen Fraktion werden aufgefangen, 3 Tage gegen kaltes Wasser dialysiert und zu einem Pulver lyophilisiert. Als Produkt werden 0,35 Teile gereinigtes Enzym in Pulverform mit einer spezifischen Aktivität von 5400 PU/mg erhalten. ι ·->

Eine Lösung vors 0,35 Gew.-Teilen des gereinigten Enzympulvers in 335 Raumteilen eines 0,01 molaren Tris-HCI-Puffers mit pH 8,0 wird an einer vorher nr! dem Tris-HCI-Puffer gewaschenen Säule aus vernetztem Dextrangel Chromatographien. Hierbei werden 62 2» Raumteile der aktiven Fraktion aufgefangen, 3 Tage gegen kaltes Wasser dialysiert und lyophilisiert, wobei 0,15 Gew.-Teile eines hochreinen Enzympulvers erhalten werden. Diese Probe hat eine spezifische Aktivität von 6500 PU/mg und die folgenden enzymologischen r> Eigenschaften:

1) Farbe und Form: weißes Pulver.

2) Typische Elementaranalyse (%): C 46,72, H 6,59, N 15,03. ,(,

3) SedimentationskonstanteCS20»-):etwa3,19χ 10"¹³.

4) Molekulargewicht (nach der Archibald-Methode): 2,65 χ 10" (±5%).

5) Ultraviolettabsorptionsspektrum (s. Fig. 1): maximale Absorption bei 275-280πιμ; E_28(IIJ°_M° , r, 1 cm = 7,0.

6) Infrarotspektrum (s. Fig.2): starke Absorptionsbanden bei 3,38,6,05,6,55,6,88,7,15,8,12 und 9,30 μ.

7) Isoelektrischer Punkt (durch Papierelektrophorese): etwa pH 11.

8) Löslichkeit: löslich in Wasser und wäßrigen Mineralsalzlösungen, die eine Ionenstärke von 0,01 bis 0,1 μ haben. Unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton und Äthyläther.

9) pH-Aktivität (s. Fig.3): optimaler pH-Wert etwa 11.

10) Temperaturaktivität (s. F i g. 4): optimale Temperatur etwa 50⁰C.

11) pH-Stabilität wie in Fig.5, sämtliche Meßpunkte dieser Figur wurden durch 1 stündige Bebrütung bei 37°C erhalten.

12) Temperaturbeständigkeit wie in Fig.6 dargestellt, sämtliche Meßpunkte dieser Figur wurden durch Bebrütung über 10 Minuten bei pH 5 erhalten.

Beispiel 4

Der Einfluß mehrerer oberflächenaktiver Mittel auf die Alkaliprotease wird wie folgt untersucht: Fünf verschiedene Waschmittel, die die in Tabelle 1 angegebene Zusammensetzung haben, werden hergestellt Hierbei werden als waschaktive Substanzen das Natriumsalz von n-Ci₅-Ci₈-Naturfettsäure (NS), Natrium-n-Qralkylsulfat (DAS), Natrium-n-a-Cis-Qe-Olefinsulfonat (AOS), Natriumtetrapropylbenzolsulfonat (ABS) und Natrium-n-Ciralkylbenzolsulfonat verwendet Die erhaltenen Waschmittel werden als NS-, DAS-, AOC-, ABS- und LAS-Waschmittel bezeichnet

Waschaktive Substanz 25%

Natriumtriphosphat 40%

Natriumsulfat 29%

Natriumsilicat 5%

Carboxymethylcellulose 1%

Je 5 mg der Waschmittel werden in 2 ml einer Enzymlösung gelöst, die durch Auflösen von 2 mg des gemäß Beispiel 2 erhaltenen rohen Enzympulvers in 100 ml 0,05molaren Tris-HCI-Puffer (pH 11,0) erhalten worden ist. Die Enzymaktivität der erhaltenen Lösung wird nach der oben beschriebenen Methode ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt. Sie zeigen, daß keines dieser Waschmitte! die Enzymaktivität hemmt.

Enzymhaltige Waschmittel werden durch Mischen von 0,5 g des gemäß Beispiel 2 hergestellten rohen Enzympulvers mit je 100 g der oben beschriebenen verschiedenen Waschmittel hergestellt.

Tabelle

Waschmittel	Proteaseaktivität Relative Aktivität*)	100
	(PU/ml)	102
_	19,6	98
NS	20,0	99
DAS	19,2	98
AOS	19,4	101
ABS	19,2	(PU/ml mit Waschmittel) *) Relative Aktivität- ,„ 100.
LAS	19,8

(PU/ml ohne Waschmittel)

Die Reinigungswirkung dieser enzymhaltigen Waschmittel wird mit der Waschwirkung der entsprechenden enzymfreien Waschmittel unter den in Tabelle 3 genannten Waschbedingungen ermittelt.

Tabelle 3

Schmutziger Stoff
(5 cm χ 10 cm)

hergestellt nach der Metho de Japen Oil and Fat Chemicel Association unter Verwendung eines 1 :1-Gemisches von Luftreinigerstaub und Kasein an Stelle von Ruß 600 ml

55

Lauge Waschmittelkonzentration 0,2%
Waschtemperatur 40⁰C

Waschdauer 30 Minuten

Spüldauer 10 Minuten

Die Reinigungswirkung wird durch eine Gruppe von Prüfern bewertet Fünf Stücke des verschmutzten Stoffs werden für den Test mit jedem Waschmittel verwendet bo Nach dem Waschen, Spülen und Trocknen bei dem beschriebenen Waschtest werden die gewaschenen Stoffe durch fünf Prüfer beurteilt, wobei die folgenden Bewertungsziffern verwendet werden:

+2: Die Sauberkeit des mit einem enzymhaltigen Waschmittel gewaschenen Stoffs ist eindeutig besser als die Sauberkeit des mit dem entsprechenden enzymfreien Waschmittel gewaschenen Stoffs.

+ 1: Die Sauberkeit des mit einem cnzymhaltigen Waschmittel gewaschenen Stoffs ist etwas besser als die Sauberkeit des mit dem entsprechenden enzymfreien Waschmittel gewaschenen Stoffs.
Kein wesentlicher Unterschied wird in der

Sauberkeit zwischen den beiden verglichenen Stoffen festgestellt

Die Ergebnisse der Bewertung sind in Tabelle 4 angegeben, wo die Reinigungswirkung der enzymhalligen Waschmittel mit der Reinigungswirkung der entsprechenden enzymfreien Waschmittel verglichen ist.

Tabelle 4

Waschmittel

Bewertungsz.HTer

Gesamtpunktzahl

I)

NS	+ 2	+ 2	+ 2	+ 2	+ 2	+ 10
DAS	+ 2	+ 1	+ 2	1-2	+ 2	+ 9
AOS	+ 1	+ 1	+ 1	+ 2	+	l·- 6
ABS	+ 2	+ 2	+ 1	+ 2	+ 2	l·- 9
LAS	+ 2	+ 1	+	+ 2	+ 2	+ 8

Beispiel 6

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise werden mehrere Mikroorganismen der Gattung Fusarium und der Gattung Gibberella 6 Tage kultiviert. Die Kulturen werden dann zentrifugiert. Die obenstehenden Flüssigkeiten werden als Enzymlösungen verwendet. Zu je 2000 Raumteilen der Enzymlösungen werden 5 Gew.-Teile des in Beispiel 4 genannten LAS-Waschmittels gegeben, worauf die Proteaseaktivität der erhaltenen Lösung nach der oben beschriebenen Bestimmungsmethode ermittelt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt. Sie zeigen, daß das LAS-Waschmittel die Aktivität der Enzyme, die durch die Alkaliprotease bildenden Mikroorganismen erzeugt worden ist, in keiner Weise beeinträchtigt.

10

Tabelle 5 Mikroorganismus Knzymaktivilal (1'lJ/ml)

mit Waschmittel

ohne Waschmittel

I usariiim oxysporum 200,8 199,2

(IR) 5942)

lusarium oxysporum 550,5 553,8

Γ. lini

(IR) 5880)

l'usarium oxysporum 315,8 307,2

f. niveum

(IR) 4·: 71)

lusarium solani 230,2 235,0

(HX) 5232)

(iibberella fujikuroi 73,2 75,6

(IFO 5268)

Gibberella saubinetti 530,2 523,4

(IFO 6608)

Beispiel 7

Ein flüssiges Waschmittel für den Gebrauch in der Küche wird wie folgt hergestellt: In 55 Raumteilen heißen Wassers von 60 —65°C werden 18 Gew.-Teile Natriumtetrapropylbenzolfulfonat, 12 Gew.-Teile Natrium-n-Cij-alkylphenoläthersulfat, 5 Gew.-Teile Lauryldiäthanolamid und 10 Gew.-Teile Natriumxylolsulfonat gelöst. Nach der Abkühlung werden der Lösung 0,5 Gew.-Teile des gemäß Beispiel 2 hergestellten rohen En/ynipulvcrs und eine geringe Menge eines Duftstoffs zugesetzt, wodurch ein flüssiges Waschmittel für den Gebrauch in der Küche erhalten wird.

Beispiel 8

Haarwaschmittel: In 64 Gew.-Teilen heißen Wassers von 60 bis 65⁰C werden 5 Gew.-Teile acetyliertes Lanolin, 6 Gew.-Teile Alkylolamin und 25 Gew.-Teile Alkylalkoholsulfat gelöst. Nach der Abkühlung werden der Lösung 0,2 Gew.-Teile des gemäß Beispiel 2 hergestellten rohen Enzympulvers und eine geringe Menge eines Duftstoffs zugesetzt.

Hicr/u 4 Hliitt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1.Alkaliproteasen, dadurch gekennzeichnet, daß sie über den pH-Bereich zwischen 8,0 und 12,0 wirksam sind, daß ihre optimale Temperatur für die Enzymaktivität zwischen etwa 20 und 6O⁰C liegt und daß sie durch Züchten von einem der Stämme
Fusarium oxysporam IFO 5942,
Fusarium oxysporam f. batatas IFO 4468, Fusarium oxysporam f. gladioli IFO 5894,
Fusarium oxysporam f. lim IFO 5880,
Fusarium oxysporam f. neveum IFO 4471,
Fusarium oxysporam f. lini vasinfectum
IFO 4472, Fusarium solani IFO 5232,
Fusarium sp. S-19-5IFO 8884,
Gibberella fujikuroi IFO 5268 und
Gibberella saubinetii IFO 6508

in einem flüssigen oder festen Nährmedium und durch Isolierung und Reinigung aus den Nährmedia gewonnen worden sind.

2. Waschmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens eine waschaktive Substanz und eine Alkaliprotease gemäß Anspruch 1 enthält