DE3834550A1 - Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung - Google Patents
Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues proteolytisches Enzym, dessen
Herstellung sowie dessen Verwendung als Waschmittelzusatz.
Proteolytisch wirkende Enzyme mit hoher proteolytischer Aktivität im alkalischen
Bereich sind bereits bekannt, vgl. US-PS 36 74 643,
US-PS 44 80 037 und NL-OS 72 07 050. Diese Enzyme eignen sich jedoch nicht
besonders gut für Waschmittel, die bei relativ niedrigen Temperaturen
verwendet werden sollen.
Gegenstand der Erfindung ist ein proteolytisches Enzym, welches aus
Bacillus spec. DSM 4828 gewonnen werden kann, die Aminosäurezusammensetzung
Asx 12,1%, Thr 4,8%, Ser 7,9%, Glu 6,9%, Pro 5,2%, Gly
12,9%, Ala 12,0%, Cys 0,3%, Val 7,9%, Met 3,2%, Ile 4,2%, Leu 6,5%,
Tyr 4,9%, Phe 1,4%, His 3,6%, Lys 1,9% und Arg 4,0% und die aminoterminale
Aminosäuresequenz Gln-Thr-Val-Pro-Cys-Gly-Ile-Pro-Tyr-Ile-Tyr-
Ser-Asp-Val-Val-His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val besitzt, dessen
Molekulargewicht etwa 27 000 beträgt und dessen isoelektrischer Punkt bei
pH 8,5 liegt.
Die Aminosäurezusammensetzung wurde nach Totalhydrolyse des Proteins gemäß
der Methode von Moore und Stein ermittelt. Zur Molekulargewichtsbestimmung
wurde die SDS-Gelelektrophorese herangezogen.
Das neue Enzym läßt sich herstellen, indem man den Mikroorganismus
Bacillus spec. DSM 4828 in einem Nährmedium züchtet und das Enzym aus der
Kulturbrühe isoliert.
Die Wahl des Nährmediums zur Züchtung des Mikroorganismus ist nicht kritisch.
Geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen,
anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Spurenelementen
und Vitaminen enthalten. Als Stickstoffquellen können anorganische
oder organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese
Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind: Ammoniumsalze,
Nitrate, Maisquellwasser, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt und
Kartoffelprotein. Als Kohlenstoffquellen können Zucker, wie Glucose,
Saccharose, mit α-Amylase hydrolysierte Stärke, Polyole wie Glycerin oder
auch organische Säuren wie Essigsäure oder Citronensäure verwendet werden.
Beispiele für organische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium,
Mangan, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen und anderen Metallen. Als Anionen der
Salze sind besonders Phosphat- und Carbonationen zu nennen. Das Mischungsverhältnis
der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab
und wird im Einzelfall festgelegt. Die Züchtungsbedingungen werden so
festgelegt, daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte
Züchtungstemperaturen liegen bei 32 bis 40°C. Der pH-Wert des Mediums wird
bei 7 bis 10,5, vorzugsweise bei 8 bis 10 gehalten. Im allgemeinen ist
eine Inkubationsdauer von 30 bis 50 h ausreichend. Innerhalb dieser Zeit
reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produkts im Medium an.
Das Enzym wird aus der Kulturbrühe in üblicher Weise abgetrennt. Die Brühe
wird zentrifugiert oder filtriert, um die Mikroorganismen und unlösliches
Material abzutrennen. Zur Herstellung fester Enzympräparationen wird das
Enzym beispielsweise durch Zugabe wassermischbarer organischer Lösungsmittel
oder anorganischer Salze aus Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat zum
Filtrat ausgefällt. Nach dem Ausfällen wird das Enzym durch Filtrieren
oder Zentrifugieren abgetrennt. Anschließend wird der erhaltene Filterrückstand
getrocknet.
Die Züchtung von Bacillus spec. DSM 4828 gelingt unter aeroben
Bedingungen.
Das neue Enzym eignet sich sehr gut zur Herstellung von Waschmitteln, die
bei 20 bis 40°C verwendet werden. Darüber hinaus besitzt es eine sehr gute
Stabilität z. B. in Gegenwart von Bleichmitteln, grenzflächenaktiven
Stoffen und Chelatbildnern.
Der Mikroorganismus, welcher die alkalische Protease produziert, wurde
gemäß einer Methode zur Selektion alkalophiler Bacilli aus einer Erdprobe
isoliert (K. Horikoshi, T. Akiba/Alcalophilic Microorgnaisms/Japan
Scientific Societies Press Tokyo). Der Bakterienstamm DSM 4828 wächst auf
Medien, welche entweder 0,1 M Carbonatpuffer pH 9 bis 10 oder eine etwa
2molare Lösung von NaCl enthalten.
Die taxonomischen Untersuchungen des Stammes DSM 4828 wurden gemäß The
Prokaryotes/Kapitel 135/Springer Verlag durchgeführt. Als Grundmedium für
physiologische Tests diente NB-Medium. Feste Nährböden werden durch Zusatz
von 1,8% Agar erhalten. Der Agar wurde direkt vor dem Sterilisieren
zugegeben, sterile Carbonatlösung bis zur Endkonzentration von 1% (W/V)
wurde jedoch erst vor dem Gießen des Agars in Petrischalen zugesetzt.
Der Mikroorganismus DSM 4828 ist aerob und sporenbildend. Er ist der
Gattung Bacillus zuzurechnen und besitzt folgende Eigenschaften:
Zellmorphologie: Vegetative Zellen haben einen Durchmesser von 0,5 bis
0,8 µm bei einer Länge von 3 bis 4 µm,
Sporangien: erscheinen manchmal etwa verdickt,
Sporen: 0,3 bis 0,5 µm sowie 0,8 bis 1 µm; oval; subterminal bis zentral,
Kein Wachstum bei 50°C,
Kein Wachstum bei 4°C,
Wachstumsoptimum bei 35 bis 37°C,
Gram-Färbung: positiv in allen Wachstumsphasen,
Anaerobes Wachstum: Kein Wachstum in Anaerobieragar,
Katalase: positiv,
Acetoinbildung: negativ,
Reduktion von Nitrat zu Nitrit: negativ,
Hydrolyse von Stärke: negativ,
Hydrolyse von Casein: positiv.
Sporangien: erscheinen manchmal etwa verdickt,
Sporen: 0,3 bis 0,5 µm sowie 0,8 bis 1 µm; oval; subterminal bis zentral,
Kein Wachstum bei 50°C,
Kein Wachstum bei 4°C,
Wachstumsoptimum bei 35 bis 37°C,
Gram-Färbung: positiv in allen Wachstumsphasen,
Anaerobes Wachstum: Kein Wachstum in Anaerobieragar,
Katalase: positiv,
Acetoinbildung: negativ,
Reduktion von Nitrat zu Nitrit: negativ,
Hydrolyse von Stärke: negativ,
Hydrolyse von Casein: positiv.
Es wurde folgendes Medium verwendet:
g/l | |
Maltose | |
75 | |
Kartoffelprotein | 50 |
Maisquellenwasser | 25 |
K₂HPO₄ | 1 |
MgSO₄7 H₂O | 0,2 |
CaCl₂ | 0,02 |
Die Bestandteile des Mediums wurden in 90% des Endvolumens gelöst. Anschließend
wurde mit verdünnter Natronlauge der pH-Wert der Lösung auf 8,5
eingestellt und 1 h bei einer Temperatur von 120°C sterilisiert. Nach erfolgter
Sterilisation wurde der pH-Wert des Mediums mit 15%iger Natriumcarbonatlösung
auf pH 9,5 eingestellt. Die Impfkultur wurde durch Impfen
von 400 ml NB-Medium pH 8,5, zu dem nach 20 min Sterilisieren bei 120°C
2,0 ml 15%ige Natriumcarbonatlösung zugegeben wurde, mit dem Mikroorganismus
Bacillus Spec. DSM 4828 erhalten.
Die Impfkultur wurde 24 h bei 37°C auf einer Schüttelvorrichtung
inkubiert.
Das Medium wurde bei 37°C und einem pH-Wert von 9,5 mit 5 Volumenteilen
der Impfkultur pro 100 Volumenteile Medium beimpft. Die Hauptzüchtung
wurde bei 37°C in 10-l-Rührfermentern mit 8 l Inhalt durchgeführt. Die
Rührgeschwindigkeit des eingebauten Blattrührers betrug 500 Umdrehungen
pro min, die Belüftungsrate lag bei einem Volumen Luft pro min und Volumen
Fermentationsbrühe. Der pH-Wert des Nährbodens wurde während der
Fermentation nicht nachreguliert und sank im Verlauf der Vermentation auf
pH 8,5. Nach 48 h wurde zentrifugiert und in der zentrifugierten Lösung
eine enzymatische Aktivität von 5000 ADU/ml gemessen (ADU=alkalische
Delft-Units.
Der gemäß Beispiel 2 erhaltene klare Überstand wurde nacheinander mit
1,1 g CaCl₂ pro kg und 200 g (NH₄)₂SO₄ pro kg Brühe versetzt. Das
ausgefällte Enzym wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Nach Trocknung
wurden pro kg zentrifugierter Brühe 55 g Protease in Pulverform erhalten.
Die enzymatische Aktivität der gewonnenen Protease wurde nach dem
vorstehend genannten Verfahren zu 50 ADU/mg bestimmt.
100 ml zellfreie Fermentationsbrühe aus Beispiel 2 wurden in einer Druckfiltrationskammer
über eine Membran mit 10 000 Dalton Ausschlußgrenze auf
10 ml eingeengt. Es wurde zweimal mit 5 mM Tris/Maleinsäure-Puffer pH 6,0
auf das Anfangsvolumen aufgefüllt. Trübungen, die dabei im Retentat auftraten,
wurden durch Zentrifugation bei 40 000 g abgetrennt. Das so vorbereitete
Enzymkonzentrat wurde auf eine Chromatographiesäule gebracht,
welche 200 ml CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia/Schweden) enthielt. Das
Ionentauschergel war vorher sorgfältig gegen 5 mM Tris/Maleinsäurepuffer
pH 6,0 äquilibriert worden. Die Enzymlösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit
von 10 bis 15 ml pro h auf das Gel aufgetragen. Danach wurde solange
mit dem oben erwähnten Puffer gespült, bis die Extinktion bei
280 nm, gemessen gegen Elutionspuffer, im Eluat unter 0,05 gefallen war.
Bei pH 6,0 bindet die Protease an das Gelmaterial. Mit Hilfe eines
linearen NaCl-Gradienten im Konzentrationsbereich von 0 bis 0,5 M wurde
sie eluiert. Das Gesamtvolumen des Salzgradienten betrug 0,5 l, die Fließgeschwindigkeit
lag bei 30 ml pro h. Das Eluat wurde in Fraktionen zu 7 ml
aufgefangen. Die Protease wurde bei einer Konzentration von 0,3 M NaCl
eluiert. Proteolytische Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt,
mit Hilfe einer Druckfiltrationskammer entsalzt und auf wenige ml eingeengt.
Das so gewonnene Enzymmaterial zeigte in der SDS-Gelelektrophorese
eine Reinheit von 90 bis 95% und konnte direkt zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung
und zur Bestimmung der aminoterminalen Aminosäuresequenz
eingesetzt werden.
Zur Bestimmung relativer Enzymaktivitäten (Aktivität über Temperatur bzw.
pH-Wert, Stabilität in Gegenwart von waschaktiven Substanzen) wurde Azocasein
als Substrat verwendet. Klare Enzymlösungen wurden mit 20 mM Borat/HCl-Puffer
entsprechend verdünnt (pH 8,5). 0,1 ml dieser Enzymlösung
wurden mit demselben, auf 25°C vorgewärmten Puffer auf 1,5 ml aufgefüllt.
Die Enzymreaktion wurde gestartet durch Zugabe von 1 ml 1%iger Azocaseinlösung,
welche ebenfalls auf 25°C vorgewärmt war. Der Reaktionsansatz
wurde 10 min bei 25°C inkubiert, worauf die Reaktion durch Zugabe von 1 ml
0,3 M Trichloressigsäurelösung abgestoppt wurde. Ausgefälltes Protein wurde
durch Zentrifugation pelletiert und 1 ml des klaren Überstandes wurde
unter Rühren mit 0,25 ml 5 M NaOH versetzt. Die Aktivität wurde bestimmt
durch Messen der Extinktion bei 420 nm gegen einen Kontrollansatz. Der
Kontrollansatz diente dazu, Hintergrundadsorption zu eliminieren und wurde
folgendermaßen angesetzt: Vor Zugabe des Substrates Azocasein wurde 1 ml
0,3 M Trichloressigsäure zum Ansatz (0,1 ml Enzymlösung + 1,4 ml Borat/
HCl-Puffer pH 8,5) gegeben. Nach Zugabe von Azocasein wurde 10 min bei
25°C inkubiert, danach wurde zentrifugiert und 1 ml Überstand wurde mit
0,25 ml 5 M NaOH versetzt. Die gemessene Extinktionsdifferenz zwischen
Enzymansatz und Kontrollansatz bei 420 nm wurde direkt als Maß für die
Enzymaktivität verwendet.
Als zweite Bestimmungsmethode proteolytischer Aktivität wurde die sogenannte
Delft-Methode verwendet.
Diese Methode ist in der GB-PS 13 53 317 beschrieben und wurde folgendermaßen
modifiziert: 0,4% Na₅P₃O₁₀ wurde nicht wie angegeben auf pH 8,5,
sondern auf pH 10 eingestellt. Die so ermittelten Enzymeinheiten sind
definitionsgemäß alkalische Delft-Units (ADU).
Das Temperaturoptimum der Protease wurde mit der Azocaseinmethode bestimmt,
wobei neben 20 mM Borat/HCl-Puffer (pH 8,5) auch 20 mM Borat/NaOH-Puffer
(pH 10) verwendet wurde. Die verdünnte Enzymlösung
enthielt 1000 ADU/ml. Die Protease aus DSM 4828 zeigte bei pH 8,5 und
bei pH 10 optimale Aktivität bei 60°C.
Um das pH/Aktivitätsprofil der Protease zu ermitteln, wurde die Azocaseinmethode
folgendermaßen modifiziert: Anstelle von Borat/HCl-Puffer
wurde der aus den folgenden Komponenten bestehende Puffer
eingesetzt: (Tris(hydroxy)methylaminomethan, Maleinsäure, Essigsäure
und Glycin jeweils 40 mM. Dieser Puffer wurde auf den gewünschten
pH-Wert eingestellt. Der pH-Wert der einzelnen Reaktionsansätze wurde
mit Hilfe eines pH-Meters kontrolliert.
pH-Wert | |
relative Aktivität (%) | |
7 | |
32,1 | |
8 | 66,5 |
9 | 82,5 |
10 | 88,1 |
10,5 | 90,6 |
11 | 94,0 |
12 | 100 |
Das Enzym wurde in einer Konzentration von 1000 ADU/ml in 20 mM Borat/NaOH-Puffer
pH 10,0 inkubiert. Die Inkubationstemperatur betrug 50°C,
die Inkubationszeit 30 min. Die Enzymaktivitäten zu Beginn der Inkubation
und nach 30 min wurden mit Hilfe des Azocaseintests gemessen. Die
waschaktiven Substanzen wurden in den angegebenen Konzentrationen eingesetzt.
Die angegebenen relativen Aktivitäten beziehen sich auf einen
Kontrollansatz in 20 mM Borat/NaOH-Puffer ohne Zusätze.
Waschaktive Komponente (Konzentration in g/l) | |
relative Aktivität (%) | |
Natriumperborat (1 g/l) | |
89,8 | |
Tripolyphosphat (2 g/l) | 84,8 |
Lineares Alkylbenzolsulfonat (®Lutensit A-LBN 50/BASF) (1,2 g/l) | 92,9 |
Fettalkoholpolyglycolether (®Lutensol A07/BASF) (0,25 g/l) | 97,7 |
Seife (0,25 g/l) | 99,3 |
Die Protease besitzt ein Molekulargewicht von 27 000, bestimmt mit
Hilfe der SDS-Gelelektrophorese. Mit Hilfe der Methode der
isoelektrischen Fokussierung läßt sich für dieses Enzym ein
isoelektrischer Punkt von pH 8,5 ermitteln.
e) Aminosäurezusammensetzung aminoterminale Aminosäuresequenz | |
Mol-% | |
Asx | |
12,1 | |
Thr | 4,8 |
Ser | 7,9 |
Glu | 6,9 |
Pro | 5,2 |
Gly | 12,9 |
Ala | 12,0 |
Cys | 0,3 |
Val | 7,9 |
Met | 3,2 |
Ile | 4,2 |
Leu | 6,5 |
Tyr | 4,9 |
Phe | 1,4 |
His | 3,6 |
Lys | 1,9 |
Arg | 4,0 |
Gln-Thr-Val-Pro-Cys-Gly-Ile-Pro-Tyr-Ile-Tyr-Ser-Arg-
Val-Val-His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val
Val-Val-His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val
Zur Untersuchung der Waschwirkung der Protease aus DSM 4828 wurde als
Testgewebe EMPA 116 (verschmutzt mit Blut, Milch und chinesischer Tinte)
von der Eidgenössischen Materialprüfung- und Versuchsanstalt für
Industrie, Bauwesen und Gewebe, St. Gallen, Schweiz verwendet. Zur
Waschuntersuchung wurden Stücke von 5×5 cm aus einem visuell homogenen
Teil des Gewebes ausgeschnitten. Zur Bereitung der Waschlauge wurden 8 g
eines handelsüblichen Waschmittels ohne Enzym pro l synthetisches
Leitungswasser eingesetzt. Das synthetische Wasser mit einer Härte von
15°d (deutscher Härtegrad) wurde auf folgende Weise hergestellt: 10 ml
einer Lösung von 0,656% MgCl₂ in destilliertem Wasser wurden mit 10 ml
einer Lösung von 2% CaCl₂ in destilliertem Wasser in einem 1000 ml
Meßkolben versetzt und kräftig vermischt. Die erhaltene Lösung wurde
anschließend unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 2,1% NaHCO₃
vermischt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. 100 ml
Waschlauge wurden jeweils in einen 250 ml Schikaneerlenmeyerkolben
gegeben. Das Enzym wurde anschließend in einer Menge von 2500 DE/g
Waschmittel in mehreren Ansätzen zugegeben.
Die Erlenmeyerkolben wurden in einem Schüttelwasserbad bei den in
Tabelle IV angegebenen Temperaturen gehalten, in dem sie unter Schütteln
aufgewärmt wurden. Anschließend wurde jeweils eine Kleidungstückprobe in
den Erlenmeyerkolben zugegeben. die genau 20 min bei der jeweiligen Temperatur
geschüttelt wurden. Nach dem Waschen wurde die Waschlauge dekantiert.
Es wurden 150 ml synthetisches Leitungswasser zu den Erlenmeyerkolben
zugegeben. Die Kolben wurden mit Gummistopfen verschlossen und
genau 1 min kräftig geschüttelt. Die Kleidungsstückproben wurden in einem
Becherglas gesammelt, in dem sie langsam mit fließendem Wasser gespült
wurden. Nach Zugabe der letzten Kleidungsstückprobe wurde das Spülen noch
etwa 10 min fortgesetzt. Anschließend ließ man die Kleidungsstückproben,
die in einem weißen, sauberen Handtuch zusammengefaltet waren, an der Luft
im Dunkeln trocknen. Nach dem Trocknen wurde die Remission in einem
Remissionsmeßgerät beidseitig bestimmt, wobei MgO als Referenzsubstanz
verwendet wurde.
Die Waschuntersuchungen wurden gemäß der vorstehenden Beschreibung bei
einem pH-Wert von 10,5 durchgeführt. In Tabelle IV sind die Ergebnisse
zusammengefaßt.
Claims (4)
1. Proteolytisches Enzym, welches aus Bacillus spec. DSM 4828 gewonnen
werden kann, die Aminosäurezusammensetzung Asx 12,1%, Thr 4,8%, Ser
7,9%, Glu 6,9%, Pro 5,2%, Gly 12,9%, Ala 12,0%, Cys 0,3%, Val
7,9%, Met 3,2%, Ile 4,2%, Leu 6,5%, Tyr 4,9%, Phe 1,4%, His
3,6%, Lys 1,9% und Arg 4,0% und die aminoterminale Aminosäuresequenz
Gln-Thr-Val-Pro-Cys-Gly-Ile-Pro-Tyr-Ile-Tyr-Ser-Asp-Val-Val-
His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val besitzt, dessen Molekulargewicht
etwa 27 000 beträgt und dessen isoelektrischer Punkt bei pH 8,5
liegt.
2. Verfahren zur Herstellung des proteolytischen Enzyms gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Bacillus spec.
DSM 4828 in einem Nährmedium züchtet und das Enzym aus der Kulturbrühe
isoliert.
3. Verwendung des Enzyms gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung von
Waschmitteln.
4. Bacillus spec. DSM 4828.
Priority Applications (5)
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---|---|---|---|
DE3834550A DE3834550A1 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3834550A DE3834550A1 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3834550A1 true DE3834550A1 (de) | 1990-04-19 |
Family
ID=6364840
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE3834550A Withdrawn DE3834550A1 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung |
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Country | Link |
---|---|
US (1) | US5143840A (de) |
AU (1) | AU4344789A (de) |
DE (1) | DE3834550A1 (de) |
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