DE3834550A1

DE3834550A1 - Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE3834550A1
Application number: DE3834550A
Authority: DE
Inventors: Hansjoerg Dr Rettenmaier; Andreas Dr Kreimeyer; Johannes Dr Perner; Paul Diessel
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1988-10-11
Filing date: 1988-10-11
Publication date: 1990-04-19
Also published as: WO1990004022A1; US5143840A; ES2018734A6; AU4344789A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues proteolytisches Enzym, dessen Herstellung sowie dessen Verwendung als Waschmittelzusatz.

Proteolytisch wirkende Enzyme mit hoher proteolytischer Aktivität im alkalischen Bereich sind bereits bekannt, vgl. US-PS 36 74 643, US-PS 44 80 037 und NL-OS 72 07 050. Diese Enzyme eignen sich jedoch nicht besonders gut für Waschmittel, die bei relativ niedrigen Temperaturen verwendet werden sollen.

Gegenstand der Erfindung ist ein proteolytisches Enzym, welches aus Bacillus spec. DSM 4828 gewonnen werden kann, die Aminosäurezusammensetzung Asx 12,1%, Thr 4,8%, Ser 7,9%, Glu 6,9%, Pro 5,2%, Gly 12,9%, Ala 12,0%, Cys 0,3%, Val 7,9%, Met 3,2%, Ile 4,2%, Leu 6,5%, Tyr 4,9%, Phe 1,4%, His 3,6%, Lys 1,9% und Arg 4,0% und die aminoterminale Aminosäuresequenz Gln-Thr-Val-Pro-Cys-Gly-Ile-Pro-Tyr-Ile-Tyr- Ser-Asp-Val-Val-His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val besitzt, dessen Molekulargewicht etwa 27 000 beträgt und dessen isoelektrischer Punkt bei pH 8,5 liegt.

Die Aminosäurezusammensetzung wurde nach Totalhydrolyse des Proteins gemäß der Methode von Moore und Stein ermittelt. Zur Molekulargewichtsbestimmung wurde die SDS-Gelelektrophorese herangezogen.

Das neue Enzym läßt sich herstellen, indem man den Mikroorganismus Bacillus spec. DSM 4828 in einem Nährmedium züchtet und das Enzym aus der Kulturbrühe isoliert.

Die Wahl des Nährmediums zur Züchtung des Mikroorganismus ist nicht kritisch. Geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Spurenelementen und Vitaminen enthalten. Als Stickstoffquellen können anorganische oder organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind: Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt und Kartoffelprotein. Als Kohlenstoffquellen können Zucker, wie Glucose, Saccharose, mit α-Amylase hydrolysierte Stärke, Polyole wie Glycerin oder auch organische Säuren wie Essigsäure oder Citronensäure verwendet werden.

Beispiele für organische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen und anderen Metallen. Als Anionen der Salze sind besonders Phosphat- und Carbonationen zu nennen. Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 32 bis 40°C. Der pH-Wert des Mediums wird bei 7 bis 10,5, vorzugsweise bei 8 bis 10 gehalten. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 30 bis 50 h ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produkts im Medium an.

Das Enzym wird aus der Kulturbrühe in üblicher Weise abgetrennt. Die Brühe wird zentrifugiert oder filtriert, um die Mikroorganismen und unlösliches Material abzutrennen. Zur Herstellung fester Enzympräparationen wird das Enzym beispielsweise durch Zugabe wassermischbarer organischer Lösungsmittel oder anorganischer Salze aus Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat zum Filtrat ausgefällt. Nach dem Ausfällen wird das Enzym durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Anschließend wird der erhaltene Filterrückstand getrocknet.

Die Züchtung von Bacillus spec. DSM 4828 gelingt unter aeroben Bedingungen.

Das neue Enzym eignet sich sehr gut zur Herstellung von Waschmitteln, die bei 20 bis 40°C verwendet werden. Darüber hinaus besitzt es eine sehr gute Stabilität z. B. in Gegenwart von Bleichmitteln, grenzflächenaktiven Stoffen und Chelatbildnern.

Beispiel 1 Isolierung des Mikroorganismus

Der Mikroorganismus, welcher die alkalische Protease produziert, wurde gemäß einer Methode zur Selektion alkalophiler Bacilli aus einer Erdprobe isoliert (K. Horikoshi, T. Akiba/Alcalophilic Microorgnaisms/Japan Scientific Societies Press Tokyo). Der Bakterienstamm DSM 4828 wächst auf Medien, welche entweder 0,1 M Carbonatpuffer pH 9 bis 10 oder eine etwa 2molare Lösung von NaCl enthalten.

Die taxonomischen Untersuchungen des Stammes DSM 4828 wurden gemäß The Prokaryotes/Kapitel 135/Springer Verlag durchgeführt. Als Grundmedium für physiologische Tests diente NB-Medium. Feste Nährböden werden durch Zusatz von 1,8% Agar erhalten. Der Agar wurde direkt vor dem Sterilisieren zugegeben, sterile Carbonatlösung bis zur Endkonzentration von 1% (W/V) wurde jedoch erst vor dem Gießen des Agars in Petrischalen zugesetzt.

Der Mikroorganismus DSM 4828 ist aerob und sporenbildend. Er ist der Gattung Bacillus zuzurechnen und besitzt folgende Eigenschaften:

Zellmorphologie: Vegetative Zellen haben einen Durchmesser von 0,5 bis 0,8 µm bei einer Länge von 3 bis 4 µm,
Sporangien: erscheinen manchmal etwa verdickt,
Sporen: 0,3 bis 0,5 µm sowie 0,8 bis 1 µm; oval; subterminal bis zentral,
Kein Wachstum bei 50°C,
Kein Wachstum bei 4°C,
Wachstumsoptimum bei 35 bis 37°C,
Gram-Färbung: positiv in allen Wachstumsphasen,
Anaerobes Wachstum: Kein Wachstum in Anaerobieragar,
Katalase: positiv,
Acetoinbildung: negativ,
Reduktion von Nitrat zu Nitrit: negativ,
Hydrolyse von Stärke: negativ,
Hydrolyse von Casein: positiv.

Beispiel 2 Züchtung des Mikroorganismus Bacillus DSM 4828

Es wurde folgendes Medium verwendet:


g/l
Maltose
75
Kartoffelprotein	50
Maisquellenwasser	25
K₂HPO₄	1
MgSO₄7 H₂O	0,2
CaCl₂	0,02

Die Bestandteile des Mediums wurden in 90% des Endvolumens gelöst. Anschließend wurde mit verdünnter Natronlauge der pH-Wert der Lösung auf 8,5 eingestellt und 1 h bei einer Temperatur von 120°C sterilisiert. Nach erfolgter Sterilisation wurde der pH-Wert des Mediums mit 15%iger Natriumcarbonatlösung auf pH 9,5 eingestellt. Die Impfkultur wurde durch Impfen von 400 ml NB-Medium pH 8,5, zu dem nach 20 min Sterilisieren bei 120°C 2,0 ml 15%ige Natriumcarbonatlösung zugegeben wurde, mit dem Mikroorganismus Bacillus Spec. DSM 4828 erhalten.

Die Impfkultur wurde 24 h bei 37°C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.

Das Medium wurde bei 37°C und einem pH-Wert von 9,5 mit 5 Volumenteilen der Impfkultur pro 100 Volumenteile Medium beimpft. Die Hauptzüchtung wurde bei 37°C in 10-l-Rührfermentern mit 8 l Inhalt durchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit des eingebauten Blattrührers betrug 500 Umdrehungen pro min, die Belüftungsrate lag bei einem Volumen Luft pro min und Volumen Fermentationsbrühe. Der pH-Wert des Nährbodens wurde während der Fermentation nicht nachreguliert und sank im Verlauf der Vermentation auf pH 8,5. Nach 48 h wurde zentrifugiert und in der zentrifugierten Lösung eine enzymatische Aktivität von 5000 ADU/ml gemessen (ADU=alkalische Delft-Units.

Beispiel 3 Anreicherung der Protease aus DSM 4828

Der gemäß Beispiel 2 erhaltene klare Überstand wurde nacheinander mit 1,1 g CaCl₂ pro kg und 200 g (NH₄)₂SO₄ pro kg Brühe versetzt. Das ausgefällte Enzym wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Nach Trocknung wurden pro kg zentrifugierter Brühe 55 g Protease in Pulverform erhalten. Die enzymatische Aktivität der gewonnenen Protease wurde nach dem vorstehend genannten Verfahren zu 50 ADU/mg bestimmt.

Beispiel 4 Reinigung der Protease

100 ml zellfreie Fermentationsbrühe aus Beispiel 2 wurden in einer Druckfiltrationskammer über eine Membran mit 10 000 Dalton Ausschlußgrenze auf 10 ml eingeengt. Es wurde zweimal mit 5 mM Tris/Maleinsäure-Puffer pH 6,0 auf das Anfangsvolumen aufgefüllt. Trübungen, die dabei im Retentat auftraten, wurden durch Zentrifugation bei 40 000 g abgetrennt. Das so vorbereitete Enzymkonzentrat wurde auf eine Chromatographiesäule gebracht, welche 200 ml CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia/Schweden) enthielt. Das Ionentauschergel war vorher sorgfältig gegen 5 mM Tris/Maleinsäurepuffer pH 6,0 äquilibriert worden. Die Enzymlösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 bis 15 ml pro h auf das Gel aufgetragen. Danach wurde solange mit dem oben erwähnten Puffer gespült, bis die Extinktion bei 280 nm, gemessen gegen Elutionspuffer, im Eluat unter 0,05 gefallen war. Bei pH 6,0 bindet die Protease an das Gelmaterial. Mit Hilfe eines linearen NaCl-Gradienten im Konzentrationsbereich von 0 bis 0,5 M wurde sie eluiert. Das Gesamtvolumen des Salzgradienten betrug 0,5 l, die Fließgeschwindigkeit lag bei 30 ml pro h. Das Eluat wurde in Fraktionen zu 7 ml aufgefangen. Die Protease wurde bei einer Konzentration von 0,3 M NaCl eluiert. Proteolytische Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, mit Hilfe einer Druckfiltrationskammer entsalzt und auf wenige ml eingeengt. Das so gewonnene Enzymmaterial zeigte in der SDS-Gelelektrophorese eine Reinheit von 90 bis 95% und konnte direkt zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung und zur Bestimmung der aminoterminalen Aminosäuresequenz eingesetzt werden.

Beispiel 5 Charakterisierung des Enzyms

Zur Bestimmung relativer Enzymaktivitäten (Aktivität über Temperatur bzw. pH-Wert, Stabilität in Gegenwart von waschaktiven Substanzen) wurde Azocasein als Substrat verwendet. Klare Enzymlösungen wurden mit 20 mM Borat/HCl-Puffer entsprechend verdünnt (pH 8,5). 0,1 ml dieser Enzymlösung wurden mit demselben, auf 25°C vorgewärmten Puffer auf 1,5 ml aufgefüllt. Die Enzymreaktion wurde gestartet durch Zugabe von 1 ml 1%iger Azocaseinlösung, welche ebenfalls auf 25°C vorgewärmt war. Der Reaktionsansatz wurde 10 min bei 25°C inkubiert, worauf die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 0,3 M Trichloressigsäurelösung abgestoppt wurde. Ausgefälltes Protein wurde durch Zentrifugation pelletiert und 1 ml des klaren Überstandes wurde unter Rühren mit 0,25 ml 5 M NaOH versetzt. Die Aktivität wurde bestimmt durch Messen der Extinktion bei 420 nm gegen einen Kontrollansatz. Der Kontrollansatz diente dazu, Hintergrundadsorption zu eliminieren und wurde folgendermaßen angesetzt: Vor Zugabe des Substrates Azocasein wurde 1 ml 0,3 M Trichloressigsäure zum Ansatz (0,1 ml Enzymlösung + 1,4 ml Borat/ HCl-Puffer pH 8,5) gegeben. Nach Zugabe von Azocasein wurde 10 min bei 25°C inkubiert, danach wurde zentrifugiert und 1 ml Überstand wurde mit 0,25 ml 5 M NaOH versetzt. Die gemessene Extinktionsdifferenz zwischen Enzymansatz und Kontrollansatz bei 420 nm wurde direkt als Maß für die Enzymaktivität verwendet.

Als zweite Bestimmungsmethode proteolytischer Aktivität wurde die sogenannte Delft-Methode verwendet.

Diese Methode ist in der GB-PS 13 53 317 beschrieben und wurde folgendermaßen modifiziert: 0,4% Na₅P₃O₁₀ wurde nicht wie angegeben auf pH 8,5, sondern auf pH 10 eingestellt. Die so ermittelten Enzymeinheiten sind definitionsgemäß alkalische Delft-Units (ADU).

a) Beziehung Temperatur/Aktivität:

Das Temperaturoptimum der Protease wurde mit der Azocaseinmethode bestimmt, wobei neben 20 mM Borat/HCl-Puffer (pH 8,5) auch 20 mM Borat/NaOH-Puffer (pH 10) verwendet wurde. Die verdünnte Enzymlösung enthielt 1000 ADU/ml. Die Protease aus DSM 4828 zeigte bei pH 8,5 und bei pH 10 optimale Aktivität bei 60°C.

Tabelle I

b) Beziehung pH-Wert/Aktivität:

Um das pH/Aktivitätsprofil der Protease zu ermitteln, wurde die Azocaseinmethode folgendermaßen modifiziert: Anstelle von Borat/HCl-Puffer wurde der aus den folgenden Komponenten bestehende Puffer eingesetzt: (Tris(hydroxy)methylaminomethan, Maleinsäure, Essigsäure und Glycin jeweils 40 mM. Dieser Puffer wurde auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Der pH-Wert der einzelnen Reaktionsansätze wurde mit Hilfe eines pH-Meters kontrolliert.

pH-Wert
relative Aktivität (%)
7
32,1
8	66,5
9	82,5
10	88,1
10,5	90,6
11	94,0
12	100

c) Stabilität in Gegenwart von Chelatbildnern, Bleichmitteln und grenzflächenaktiven Substanzen

Das Enzym wurde in einer Konzentration von 1000 ADU/ml in 20 mM Borat/NaOH-Puffer pH 10,0 inkubiert. Die Inkubationstemperatur betrug 50°C, die Inkubationszeit 30 min. Die Enzymaktivitäten zu Beginn der Inkubation und nach 30 min wurden mit Hilfe des Azocaseintests gemessen. Die waschaktiven Substanzen wurden in den angegebenen Konzentrationen eingesetzt. Die angegebenen relativen Aktivitäten beziehen sich auf einen Kontrollansatz in 20 mM Borat/NaOH-Puffer ohne Zusätze.

Waschaktive Komponente (Konzentration in g/l)
relative Aktivität (%)
Natriumperborat (1 g/l)
89,8
Tripolyphosphat (2 g/l)	84,8
Lineares Alkylbenzolsulfonat (®Lutensit A-LBN 50/BASF) (1,2 g/l)	92,9
Fettalkoholpolyglycolether (®Lutensol A07/BASF) (0,25 g/l)	97,7
Seife (0,25 g/l)	99,3

d) Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt

Die Protease besitzt ein Molekulargewicht von 27 000, bestimmt mit Hilfe der SDS-Gelelektrophorese. Mit Hilfe der Methode der isoelektrischen Fokussierung läßt sich für dieses Enzym ein isoelektrischer Punkt von pH 8,5 ermitteln.

e) Aminosäurezusammensetzung aminoterminale Aminosäuresequenz

Mol-%
Asx
12,1
Thr	4,8
Ser	7,9
Glu	6,9
Pro	5,2
Gly	12,9
Ala	12,0
Cys	0,3
Val	7,9
Met	3,2
Ile	4,2
Leu	6,5
Tyr	4,9
Phe	1,4
His	3,6
Lys	1,9
Arg	4,0

Gln-Thr-Val-Pro-Cys-Gly-Ile-Pro-Tyr-Ile-Tyr-Ser-Arg-
Val-Val-His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val

Beispiel 5 Waschwirkung

Zur Untersuchung der Waschwirkung der Protease aus DSM 4828 wurde als Testgewebe EMPA 116 (verschmutzt mit Blut, Milch und chinesischer Tinte) von der Eidgenössischen Materialprüfung- und Versuchsanstalt für Industrie, Bauwesen und Gewebe, St. Gallen, Schweiz verwendet. Zur Waschuntersuchung wurden Stücke von 5×5 cm aus einem visuell homogenen Teil des Gewebes ausgeschnitten. Zur Bereitung der Waschlauge wurden 8 g eines handelsüblichen Waschmittels ohne Enzym pro l synthetisches Leitungswasser eingesetzt. Das synthetische Wasser mit einer Härte von 15°d (deutscher Härtegrad) wurde auf folgende Weise hergestellt: 10 ml einer Lösung von 0,656% MgCl₂ in destilliertem Wasser wurden mit 10 ml einer Lösung von 2% CaCl₂ in destilliertem Wasser in einem 1000 ml Meßkolben versetzt und kräftig vermischt. Die erhaltene Lösung wurde anschließend unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 2,1% NaHCO₃ vermischt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. 100 ml Waschlauge wurden jeweils in einen 250 ml Schikaneerlenmeyerkolben gegeben. Das Enzym wurde anschließend in einer Menge von 2500 DE/g Waschmittel in mehreren Ansätzen zugegeben.

Die Erlenmeyerkolben wurden in einem Schüttelwasserbad bei den in Tabelle IV angegebenen Temperaturen gehalten, in dem sie unter Schütteln aufgewärmt wurden. Anschließend wurde jeweils eine Kleidungstückprobe in den Erlenmeyerkolben zugegeben. die genau 20 min bei der jeweiligen Temperatur geschüttelt wurden. Nach dem Waschen wurde die Waschlauge dekantiert. Es wurden 150 ml synthetisches Leitungswasser zu den Erlenmeyerkolben zugegeben. Die Kolben wurden mit Gummistopfen verschlossen und genau 1 min kräftig geschüttelt. Die Kleidungsstückproben wurden in einem Becherglas gesammelt, in dem sie langsam mit fließendem Wasser gespült wurden. Nach Zugabe der letzten Kleidungsstückprobe wurde das Spülen noch etwa 10 min fortgesetzt. Anschließend ließ man die Kleidungsstückproben, die in einem weißen, sauberen Handtuch zusammengefaltet waren, an der Luft im Dunkeln trocknen. Nach dem Trocknen wurde die Remission in einem Remissionsmeßgerät beidseitig bestimmt, wobei MgO als Referenzsubstanz verwendet wurde.

Die Waschuntersuchungen wurden gemäß der vorstehenden Beschreibung bei einem pH-Wert von 10,5 durchgeführt. In Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle IV

Claims

1. Proteolytisches Enzym, welches aus Bacillus spec. DSM 4828 gewonnen werden kann, die Aminosäurezusammensetzung Asx 12,1%, Thr 4,8%, Ser 7,9%, Glu 6,9%, Pro 5,2%, Gly 12,9%, Ala 12,0%, Cys 0,3%, Val 7,9%, Met 3,2%, Ile 4,2%, Leu 6,5%, Tyr 4,9%, Phe 1,4%, His 3,6%, Lys 1,9% und Arg 4,0% und die aminoterminale Aminosäuresequenz Gln-Thr-Val-Pro-Cys-Gly-Ile-Pro-Tyr-Ile-Tyr-Ser-Asp-Val-Val- His-Arg-Gln-Gly-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Val besitzt, dessen Molekulargewicht etwa 27 000 beträgt und dessen isoelektrischer Punkt bei pH 8,5 liegt.

2. Verfahren zur Herstellung des proteolytischen Enzyms gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Bacillus spec. DSM 4828 in einem Nährmedium züchtet und das Enzym aus der Kulturbrühe isoliert.

3. Verwendung des Enzyms gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung von Waschmitteln.

4. Bacillus spec. DSM 4828.