JPH06506597A

JPH06506597A - アルカリ性プロテアーゼ３７３３、その産生およびコンタクトレンズの洗浄への使用

Info

Publication number: JPH06506597A
Application number: JP4509708A
Authority: JP
Inventors: バーニッツ，ジョイ　ティー; フィスク，マイケル　ジェイ; ミドル　ブルック　スーザン，エム; スティール，ダレル　バーニー
Original assignee: ジェネンコア　インターナショナル　インコーポレーテッド
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 1994-07-28
Also published as: EP0578767A1; WO1992017579A1; CA2105559A1; EP0578767A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アルカリ性プロテアーゼ３７３３、その産生本発明は、変性リゾチームを溶解できる活性を有する、新しいアルカリ性プロテアーゼまたはエラスターゼ酵素「プロテアーゼ３７３３」、その産生方法、およびコンタクトレンズの洗浄にプロテアーゼ３７３３を使用する方法に関する。

従来技術健康と快適さのために、ソフトコンタクトレンズの使用者は、そのレンズを洗浄し消毒しなければならない。洗浄剤でレンズを洗浄するだけでなく、レンズの表面からのタンパク質付着物を除去することも必要である。付着したタンパク質を除去するのに現在使用されている方法は、室温でプロテアーゼ（サブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）のような）溶液中へのレンズの浸漬、熱消毒装置中のプロテアーゼへの浸漬、または化学消毒剤への浸漬を含む。

レンズ表面のタンパク質の変性は、特に熱消毒が用いられる場合に、レンズの洗浄において問題を引き起こす。しンズに付着した主なタンパク質は、使用者の護管により分泌されるリゾチームである。従来のプロテアーゼを使用してレンズからりゾチームを除去することは、特にリゾチームが熱消毒により変性されている場合に、困難である。

本発明は、コンタクトレンズから変性リゾチームを除去する際の、従来のプロテアーゼの相対的無効力を克服する新しいアルカリ性プロテアーゼにある。

発明の概要「プロテアーゼ３７３３Ｊと称し、エラスターゼとも呼ばれる新しいアルカリ性プロテアーゼの発酵および分離について記載する。新たに分離したＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ。

菌株ＩＡＭ　０１１１０５の発酵により酵素を産生した。

プロテアーゼ３７３３の構造特性と生化学特性について記載し、他のプロテアーゼと比較した。この酵素は、変性リゾチームを加水分解する際に並外れた活性を有する。変性リゾチームは、コンタクトレンズに悪影響を及ぼす主要な不純物である。新しい酵素はまた、不溶性繊維状タンパク質エラスチン上で非常に活性である。コンタクトレンズの洗浄へのプロテアーゼの使用を記載する。

図面の簡単な説明Ｍｌａ図は、アゾカゼインの加水分解におけるプロテアーゼ３７３３の活性へのｐＨの影響を示す。

第１ｂ図は、４℃と２３℃でのプロテアーゼの安定性へのｐＨの影響を示す。

ｍｌＣ図は、アゾカゼインの加水分解におけるプロテアーゼ３７３３の活性への温度の影響を示す。

第１ｄ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性へのｐＨ８とｐＨｌ０での４０℃の影響を示す。

第１ｅ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性へのｐＨ８とｐＨ１（ｌでの５０℃ の影響を示す。

第２ａ図は、プロテアーゼ３７３３の活性へのキレート剤ＥＤＴＡおよびセリンプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦの影響を示す。

第２ｂ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性へのｐＨ１０と４０℃でのＥＤＴＡの影響を示す。

第２ｃ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性へのｐＨ１Ｏと５０℃での２価陽イオンの影響を示す。

第３図は、プロテアーゼ３７３３、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンａｐｒＥ、およびサブチリシンＢＰＮ’　による変性リゾチームの比較による加水分解を示す。

第４図は、ＢＭＨの有無でのプロテアーゼ３７３３とサブチリシンカールスバーグによる変性人乳リゾチームの比較による加水分解を示す。

第５図は、ＢＭＥの有無でのプロテアーゼ３７３３とサブチリシンカールスバーグによる変性人乳リゾチームの比較による加水分解を示す。

実　施　例菌株の分離織物の仕上げ老廃物の処理に用いた活性化汚泥装置のエアレーション流域から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、ＩＡＭ０１１１０５を分離した。老廃物の温度は２０ ℃であり、ｐＨは１０．４であった。少量（０，１ｍ１）の老廃物スラリーを、０．０５Ｍの３−シクロへキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ　、ＭＯ，セントルイス、シグマケミカル）でｐＨ１０，５に緩衝した５、０　ｍ　ｌの４ｇ／リットルの普通ブイヨン（ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ）（ミシガン州、デトロイト、ディフコ）に添加した。この培地を３０℃で１０日間インキュベーションした。次いでこのブイヨンを、上述した組成物に１．５％のノープルアガーと１０％のスキムミルクを加えた固体培地上で線上接種し、３０℃で３日間インキュベーションした。スキムミルクカゼインの加水分解を示す単体コロニーとして、菌株ＩＡＭ　０１１１０５を分離した。

菌株ＩＡＭ　０１１１０５はグラム陽性菌である。その菌はｐＨ７，５で０．５ −１．０　ｕｍｘ５．０−８．０　ｕｍの直杆状体として成長する。この菌はｐＨ９，０で、はぼ（１，５ｕｍｘ５．０から１５ｕｍより大きい、長く薄い杆状体として成長する。どの培地にも、芽胞形成は観察されなかった。ｐＨ７゜５のトリブチツク大豆アガー上のコロニーは、クリーム色で、不透明で、円形で、金縁が凸状である。ｐＨ９，０のトリブチツク大豆アガー上のコロニーは、クリーム色で、不透明で、不規則で、縁が凸凹の平伏である。

ミニチックディスクシステム（ＭＤ、コキースビル、ベクトンディキンソン）を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ。

ＩＡＭ　０１１１０５の生化学的特性を測定した。結果を表１に表す。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、ＩＡＭ　０１１１０５は、メリーランド州、ロックビル、アメリカ型培地コレクションに第５５１４２号として預けられている。

これらのデータにより、菌株ＩＡＭ　０１１１０５はＢａｃｉｌｌｕｓ属の以前に記載されていない細菌種であることが示されている。

酵素産生および精製本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目の細菌の培養、および培地からのプロテアーゼの採取と精製に関する。

０．０５ＭのＣＡＰＳでｐＨ９，０に緩衝した３０ｇ／ｌのトリブチツク大豆ブイヨン（ｔｒｙｐｔｉｃ　ｓｏｙ　ｂｒ。

ｔ　ｈ　）　ヲ５００　ｍ　ｌ　含有するフエルンバッハフラスコに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、ＩＡＭ　０１１１０５の１．０　ｍ　ｌ冷凍株を接種した。この培地を３０℃で２０Ｏｒｐｍで一晩振動せしめた。同種の培地を１０１含有する１４１のケマップフ７−メンターを接種せしめるのに、これを用いた。１分当たり８リツトルの気流を生じさせ、１３００ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で４８時間に亘り細胞を成長せしめた。ソーパルＲＣ−５Ｂ遠心分離機中での遠心分離により培養ブイヨンから細胞を分離した。

酵素の精製浄化した培地を、ＭＡ、ビバーリー、グレース＆カンパニー、Ｗ、　Ｒ，部門、アミコンから得た、ｉｏ、ｏｏｏダルトンで遮断するＹＭ−１０限外濾過膜で濃縮した。Ｏ，ＯＬＭの酢酸ナトリウムと１．０　ｍＭのＣａＣ１でｐＨ５，５に平衡にされた１００　ｍ　ｌのセファデックスＧ−２５カラムに、３０ｍ　ｌの濃縮物を通過せしめた。セファデックスは、ＮＪ、ピスキャタウエイ、ファーマシアにより所有されているゲル分離培地の商標である。脱塩材料を、同種の緩衝液で平衡にしたファーマシアＦＰＬＣモノスＨＲＩＯ／１０カラムに施した。上述した緩衝液中の９０ｍ　ｌの線状０−０．２Ｍ　Ｎａｃｌ勾配を用いて、カラムからプロテアーゼ３７３３を溶出せしめた。

産生じたプロテアーゼ３７３３の標品は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、およびＮ末端塩基配列決定法により、均質であることが分かった。精製したプロテアーゼを、カラム溶出緩衝液と５０％プロピレングリコール中の１．０ｍｇ／ｍｌ溶液として４℃で貯蔵した。

バイオ−ラドタンパク質アッセイキット（ＮＹ、ロックビルセンター、パイオーラド）を用いて、タンパク質濃縮を測定した。

プロテアーゼ３７３３の生化学的特性第１ａ−ｅ図はプロテアーゼ３７３３のいくつかの生化学的特性を示すものである。別記しない限りは、全てのデータは以下の条件下で決定した。全ての研究は、上述したように調製し、表示したように貯蔵したプロテアーゼ３７３３に関して行なった。基質としてアゾカゼイン（ＭＯ。

セントルイス、シグマケミカル社）を用いて、酵素的活性を測定した。ＨＣＩでｐＨ８，０に調整した１、０　ｍＭのＣａＣ１を加えた０、０５Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液（ＭＯ、セントルイス、シグマケミカル社）中で、０６５％のアゾカゼインを調製した。１００ｕ１の適切な酵素希釈物を９００　ｕ　ｌの０．５％のアゾカゼインに添加し、３０℃でＩＯ分間インキニベーションした。３００μｌの１０％のトリクロロ酢酸を添加して、この反応を停止させた。反応混合物を、エッペンドルフマイクロフユージ中で１２．０００　ｒ　ｐ　ｍで２分間に亘り遠心分離した。８００　ｕ　１の上澄み液を、３００　ｕ　ｌの０．５Ｎ　ＮａＯＨを含有する新しい管に回収した。この混合物を撹拌し、４２０ｎｍで吸収を読み取った。活性の１単位は、１分間に１．０の吸収変化を与えるのに必要な酵素の量である。

第１ａ−ｅ図において、活性軸は、１００の相対活性である、最高値と各点との比較により掲載した相対活性％を示す。

第１ａ図は、４−１２にｐＨ値を変化せしめることにより見られたアゾカゼイン上のプロテアーゼ３７３３の活性の影響を示す。第１ａ図のデータは、アゾカゼインに対するプロテアーゼ３７３３活性が少なくともｐＨ１１の最適ｐＨを有したことを示す。

第１ｂ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性へのｐＨの影響を示す。１ｍｇ／ｍｌの濃度の酵素を、４℃（点線）または２３℃（実線）で４−１２のｐＨ値で２０時間に亘りインキュベーションし、活性を測定した。第１ｂ図のデータは、プロテアーゼ３７３３は、４℃ではｐＨ５−９で２０時間に亘り安定であり、２３ ℃ではｐＨ７−９で２０時間に亘り安定であったことを示す。

第１ｃ図は、プロテアーゼ３７３３の活性への温度の影響を示す。酵素的活性を１０’−７０℃に亘り測定した。第１Ｃ図のデータは、５０℃が最適温度であることを示す。

第１ｄ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性への４０℃の影響を示す。１ｍｇ／ｍｌの濃度での酵素を、ｐＨ８（点線）またはｐＨＬＯ（実線）で４０℃にて１２０分間までインキュベーションし、酵素的活性を測定した。第１ｄ図のデータは、プロテアーゼ３７３３はｐＨ８またはｐ　Ｈ１０テ４０’Ｃにおいて安定であることを示す。

第１ｅ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性への５０℃の影響を示す。酵素を、ｐＨ８（実線）またはｐＨ１０（点線）で５０℃にて１２０分間までインキュベーションし、酵素的活性を測定した。第１ｄ図は、プロテアーゼ３７３３は、ｐＨ８とｐＨ１０の両方で、５０℃で１５分後に５０％の活性を損失することを示す。

第２ａ−ｃ図は、プロテアーゼ３７３３の活性への様々な添加剤の影響を示す。

別記しない限り、条件は第１ａ−ｅ図と同様であった。

第２ａ図は、プロテアーゼ３７３３の活性への（１）フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）および（２）エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）の影響を示す。第２ａ図のデータは、１．０　ｍＭでのＰＭＳＦがプロテアーゼの活性を阻害したが、一方５．０　ｍＭでのＥＤＴＡは酵素活性には影響しなかったことを示す。

第２ｂ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性へのＥＤＴＡの影響を示す。酵素を、２．０　ｍＭの濃度のＥＤＴＡの存在下と不在下でｐＨ１０で４０℃にて１２０分間までインキュベーションし、活性を測定した。ばつ印はＥＤＴＡの存在する点を示し、三角形はＥＤＴＡの欠如した対照点を示した。

第２ｂ図のデータは、ＥＤＴＡがプロテアーゼ３７３３の安定性を著しく減少したことを示す。

第２ｃ図は、プロテアーゼ３７３３の安定性への２価陽イオンの影響を示す。様々な陽イオンの塩化物塩を加え、１２０分間に亘りｐＨ１０で５０℃に保持した酵素溶液のアリコートを分離した。表示した間隔で、各アリコートから試料を採取し、酵素活性を測定した。全ての実験塩を５．０　ｍＭの最終濃度であった。

第２ｃ図の実験点は以下のとおりである二三角形、対照；ばつ印、Ｂａ＋＋；四角、Ｃａ＋＋；黒画角、ＣＯ＊＋；四角のばつ印、Ｍｎ”；ハイフンのばつ印、Ｚ　ｎ　”　：およびダイヤモンド、Ｍｇ＋＋。第２Ｃ図のデータは、Ｃａ”およびわずかであるがＭｇ−が熱安定性を増大せしめたことを示す。ｔＪ　２　ａ　−ｅ図のデータは、Ｂａｃｉ１１ｕｓアルカリ性プロテアーゼに典型的なものである。

アゾカゼイン、Ｎ−サクシニルーアラーアラーブローフェｐ−ニトロアニリド（ＡＡＡ−ｐｎａ）　、およびエラスチンコンゴレッドを含むいくつかの基質について、プロテアーゼ３７３３の特異的活性を試験した。それらの基質はすべて、ＭＯ，セントルイス、シグマケミカル社から得た。

特異的活性を、サブチリシンカールスバーグとサブチリシンａｐｒＨに得られた活性と比較した。

基質としてのＡＡＰＦ−ｐｎａおよびＡＡＡ−ｐｎａに関する酵素アッセイを以下のように行なった。ジメチルスルホキシド中で１９０　ｍＭのＡＡＰＦ−ｐｎａまたはＡＡＡ−ｐｎａを調製した。反応混合物は、９８０　ｕ　ｌの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　＋ｔ、ｏ　ｍＭのＣａＣ１，１Ｏｕ１のＡＡＰＦ−ｐｎａまたはＡＡＡ−ｐｎａのいずれか、および１Ｏｕｌの適切な酵素希釈物を含有した。ｐ−ニトロアニリンの放出により、４１０ｎｍでの吸収の増大は、２５℃で連続的に続いた。活性の１単位は、１分間に１．０の吸収変化を与えるのに必要な酵素の量である。

エラスチンコンゴレッドに関する酵素アッセイを以下のように行なった。１３Ｘ１００ｍｍの試験管中に１０ｍ　ｇのエラスチンコンゴレッド（Ｍｏ　、セントルイス、シグマケミカル社）を秤量した。９００　ｕ　ｌの５０ｍＭ　トリス− ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　＋ｔ、ｏ　ｍＭのＣａＣ１を添加し、続いて１００ｕ１の適切な酵素希釈物を添加した。管にふたを被せ、振動させなから３７’Ｃで３０分間に亘りインキュベーションした。

１．０　ｍ　ｌの０．７　Ｍ　ＫＰ　０４　（ｐＨ５，５）を添加して反応を停止させ、その管を３０００　ｒ　ｐ　ｍで１０分間に亘り遠心分離して、上澄み液の吸収を４９５ｎｍで読み取った。活性の１単位は、１分間に１．０の吸収変化を与えるのに必要な酵素の量である。

表２は、サブチリシンカールスバーグおよびサブチリシンａｐ　ｒＥの活性と比較した表示した基質上のプロテアーゼ３７３３の特異的活性を示す。特異的活性を単位／ｍｇの酵素として表現した。表２のデータは、試験したいくつかの基質上でのプロテアーゼ３７３３の特異的活性が、サブチリシンカールスバーグの活性と、サブチリシンａｐｒＥの活性とは著しく異なることを示す。プロテアーゼ３７３３の特異的活性は、アゾカゼイン上のサブチリシンの活性と似ている。プロテアーゼ３７３３の特異的活性は、ＡＡＰＦ−ｐｎａ上のサブチリシンａｐｒＨの活性より高く、サブチリシンカールスバーグの活性よりずいぶん低かった。

プロテアーゼ３７３３の特異的活性は、ＡＡＡ−ｐｎａ上のいずれのサブチリシンの活性よりもずいぶん高かった。

プロテアーゼ３７３３の特異的活性は、エラスチンコンゴレッド上のいずれのサブチリシンの活性よりもずいぶん高かった。このことは、プロテアーゼ３７３３が、サブチリシンカールスバーグまたはサブチリシンａｐｒＨのいずれとも異なる別個の酵素であることを示す。

プロテアーゼ３７３３の組成プロテアーゼ３７３３、サブチリシンカールスバーグ、およびエラスターゼＹａ −Ｂのアミノ酸組成を表３に比較した。エラスターゼＹａ−Ｂは、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉ。

ｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、１９８Ｇ、８３３．４３９−４４７頁に記載したようなりａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｙａ−Ｂから分離したアルカリ性エラスターゼである。

酵素を加水分解して、産生じた成分のアミノ酸を分析した。表３は、各酵素の加水分解から生じたアミノ酸残基の数を示す。プロテアーゼ、サブチリシンカールスバーグ、およびエラスターゼＹａ−Ｂのアミノ酸組成は、互いに著しく異なり、これらは異なる酵素であることを示す。

プロテアーゼ、サブチリシンカールスバーグ、およびエラスターゼＹａ−ＢのＮ末端配列を決定し、それぞれ配列認識番号１、配列認識番号２および配列認識番号３として「配列一覧表」のセクションに示す。表４は、これらの酵素のＮ末端配列を示す。表４の星は、プロテアーゼ３７３３と相同なアミノ酸を示す。プロテアーゼ３７３３は、これらの酵素のＮ末端配列において、サブチリシンカールスバーグとは５０％の相同性を、エラスターゼＹａ−Ｂとは３４％の相同性を示す。これは、３つの酵素が別個の異なるタンパク質であることを示す。

プロテアーゼ３７３３と他のプロテアーゼの特性表５は、いくつかのプロテアーゼ３７３３の生化学的特性をサブチリシンカールスバーグとエラスターゼＹａ− Ｂの特性と比較したものである。別記しない限り、これらの特性は、第１ａ−ｅ図のように測定した。エラスターゼＹａ−Ｂのデータは、上述した出版物から得た。

表５のデータは、最適ｐＨは各酵素で同様であり、全てがセリンプロテアーゼであったことを示す。プロテアーゼ３７３３は、エラスターゼＹａ−Ｂとサブチリシンカールスバーグよりずいぶん低いｐＩを有し、プロテアーゼ３７３３は一般的にセリンプロテアーゼより低いｐＩを有した。

プロテアーゼ３７３３はサブチリシンカールスバーグ抗体とのある程度の交差反応性を示したが、一方エラスターゼＹａ−Ｂはまったく示さなかった。エラスチン／カゼイン分解（ｄｅｇｒａｄｉｎｇ）活性の比率は、エラスターゼＹａ−Ｂに関して最も高く、プロテアーゼ３７３３に関する比率は、サブチリシンカールスバーグに関する比率の約９倍であった。加えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓからのエラスターゼは、９．０の最適ｐＨと２５，０００の分子量を有することが分かった。Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓエラスターゼは、カナディアンジャーナルオブマイクロバイオロジー、１９８８．３４．８５５−８５９頁に記載しているようなり。

５ｕｂｔｉｌｉｓから分離したエラスターゼである。

変性リゾチームの加水分解リゾチーム加水分解アッセイを以下のように行なった。

ニワトリ卵白リゾチーム（ＭＯ，セントルイス、シグマケミカル社）の１．ｏｍｇ／ｍｌ溶液を、５０ｍ　Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中で調製し、この溶液の１．０　ｍ　ｌを１３Ｘ１００ｍｍ試験管中に分割した。この管に蓋を被せ、洪水浴中に５分間配し、リゾチームの変性を行なった。この管を冷却した後、１００　ｕ　１の適切な酵素希釈物を加え、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。３０（ｌ　ｕ　１の１０％トリクロロ酢酸を添加して反応を停止させ、続いて３０００　ｒ　ｐ　ｍで１０分間に亘り遠心分離した。

上澄み液中の溶性アミノ酸の吸収を３８０ｎｍで読み取った。人乳リゾチーム（ＭＯ，セントルイス、シグマケミカル社）を用いたアッセイを、これと同様なプロトコルを用いて行なった。目的に合わせて、インキュベーション温度またはインキュベーション時間の変化を示した。

第３図は、変性卵白リゾチーム上のプロテアーゼ３７３３、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンａｐｒＥ。

およびサブチリシンＢＰＮ’　の酵素的活性を説明している。

上述した条件下で変性卵白リゾチームとともに２５ｕｇの精製酵素をインキュベーションすることにより活性を測定した。データは、プロテアーゼ３７３３は、他のタンパク質分解酵素よりも、変性卵白リゾチームの加水分解において５−６倍活性であることを示す。

第４図は、変性卵白リゾチーム上のプロテアーゼ３７３３とサブチリシンカールスバーグの酵素的活性へのベーターメルカプトエタノール（ＢＭＥ）の影響を示す。このデータは、プロテアーゼ３７３３とサブチリシンカールスバーグの両者に関して０．４％のＢＭＥを添加することにより、リゾチームの加水分解が２倍に増大したことを示す。これはおそらく、タンパク質分解により感受性のあるタンパク質を産生ずるリゾチームにおけるジスルフィド結合の還元によるものであろう。ＢＭＥを添加していないプロテアーゼ３７３３が、ＢＭＥを添加したことによりサブチリシンカールスバーグの活性が高められた場合でさえ、サブチリシンカールスバーグよりも２．５倍活性であったという点で、プロテアーゼ３７３３は明らかにサブチリシンカールスバーグより優れていた。

第５図は、０．４％のＢＭＥを添加した場合としない場合の変性人乳リゾチーム上のプロテアーゼ３７３３とサブチリシンカールスバーグの活性を示す。ＢＭＥを添加しない場合には、プロテアーゼ３７３３はサブチリシンカールスバーグよりも４−５倍高い人乳リゾチームの活性を示した。

基質としてニワトリ卵白リゾチームを用いた場合では、ＢＭＨの添加により、両方の酵素に関して酵素的活性が２倍に増大した。しかしながら、ＢＭＥを添加していないプロテアーゼ３７３３は、ＢＭＥで増大したサブチリシンカールスバーグよりも、変性人乳リゾチームで１．５−２倍活性であった。

コンタクトレンズのプロテアーゼ３７３３処理タンパク質汚染コンタクトレンズは、プロテアーゼ３７３３を含有するクレンジング製剤中でのインキュベーションにより洗浄する。適切な製剤は、１ｍｇ／ｍｌでプロテアーゼ３７３３を有するｐＨ８，０の０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液の殺菌水溶液である。汚染したコンタクトレンズを製剤中に浸漬し、室温で３０分間保持した。レンズを使用前に殺菌生理的塩類溶液でよく濯いだ。この製剤と方法を用いて、コンタクトレンズからタンパク質汚染物を効果的に除去する。

汚染コンタクトレンズの洗浄に関する任意の配合において、０．４％のＢＭＥも製剤中に含有してもよい。

適切なりレンジング製剤はまた、ヘキサン、クロロヘキサン、エタノール、メタノール、およびジメチルスルホキシドのような非水性溶媒中で配合してもよい。

そのような溶液を緩衝して、高水準の酵素的活性を確保する。使用方法は、水性溶液に関する。

本発明は好ましい実施態様を特定の参照として詳細に記載したが、本発明の意図および範囲内において様々な変更や応用が行なうことができ、添付した請求の範囲に記載したこと以外では限定されるものではないことが理解されよ表　１移動度　十以下から産生じた酸嫌気性デキストロース　− 好気性デキストロース　＋マンノース　＋ガラクトース　＋フェニルアラニン　デアミナーゼ　− オルニチン　デカルボキシラーゼ　− リシン　デカルボキシラーゼ　− アルギニン　デカルホキラーゼ　− ベータ　ガラクトシダーゼ　− 硝酸塩還元　− 脱窒　− ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ　− クエン酸塩（唯一の炭素供給源として）−ウレアーゼ　一硫化水素　− インドール　− 二スクリン分解　− エラスチン分解　十表　２アゾカゼイン　１４．４　１６．７　１６．２ＡＡＰＰ−ｐｎａ　３９３　４２８６　３７０ＡＡＡ−ｐｎａ　２２．８１０．０　１．８エラスチンコンドレフＦ　２．８　Ｇ、４　０．２＾ｓｘ　３５　２８　２８Ｇｌｘ　１８　１１　１４Ｓｅｒ　２２　３２　２８ａｔｙ　４０　３５　３７Ｈｉｓ　９　５　８Ａｒｇ　１０　４　７Ｔｈｒ　１３　１９　１７Ａｌａ　３６　４１　３３Ｐｒｏ　１３　Ｒ８Ｔｙｒ　１３　１３　４Ｖａｔ　２３　３１　２１Ｍｅｔ　８　５　３Ｃｙｓ　０　０　Ｑｌ　ｌｅ　１３　１０　１０合計　２８４　２７３　２３９表　４残留物番号　号プチリンンカールスバーグ　プロテアーゼ３７３３　エラスターゼＹａ−ＢＩ　ＡｌａＧｌｎ　本　Ｇｌｎ　ＧｌｙＴｈｒ　＊　Ｔｈｒ　ＸａａＶａｌ　＊　Ｖａｔ　Ｘａａ５　Ｐｒｏ　本　Ｐｒｏ　本　Ｐｒ。

Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　＊　ＴｒｐＧｌｙ　＊　Ｇｌｙ　＊　Ｇｌｙｌｌｅ　＊　Ｉｌｅ　＊　ｌ１ｅＰｒｏ　＊　Ｐｒｏ　Ａｓｎ１０　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇｌｉｅ　＊　ｌｌｅ　ＶａｔＬｙｓ　Ｔｙｒ　ＧｌｎＡｌａ　Ｓｅｒ　ＡｌａＡｓｐ　＊　Ａｓｐ　Ｐｒ。

１５　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　１ｉｅＶａｔ　＊　Ｖａｌ　ＡｌａＧｌｎ　Ｘａａ　ＧｉｎＡｌａ　Ｘａａ　５ｅｒＧｌｎ　＊　Ｇｉｎ　Ａｒｇ２Ｏｃｒｙ　本　Ｇｌｙ　＊　ＧｌｙＰｈｅ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＬｙｓ　Ｐｈｅ　ＡｌａＧｌｙ　＊　Ｇｌｙ　本　ｃ＋ｙＡｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ２５　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　＊　ＧＩｙＶａｌ　本　Ｖａｌ　本　ＶａｔＬｙｓ　＊　Ｌｙｓ　ＡｒｇＶａｌ　＊　Ｖａｔ　本　ＶａｔＡｌａ　零Ａｌａ　本Ａｌａ最適ｐＨ１１，０１１，７１０，０最適温度’０　５０　８０　８０分子量　２７，０００　２５．０００　２８．０００ｐＩ　４．９　１０．６　９．４セリノブロチアーゼ　＋　十　＋Ｎ末端　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ量ブチリンンカールスバーグ抗体との交差反応性　十　−＋＋エラスチン／セガインの活性比　０．１８　０．５１１　０．０２配列一覧表（１）一般情報：（ｉ）発明者：フィスケ、マイケル、ジエイ。

ミドルプルツク、スーザン、エム。

その産生およびコンタクトレンズの洗浄への使用（ｉｉｉ）配列の数二３（ｉＶ）通信住所（＾）受信人：ジエネンコア　インターナショナルインコーホレイテッド（Ｂ）通り：キンポルウェイ１８０（Ｃ）市：サウス　サンフランシスコ（Ｄ）州：カルフォルニア（Ｅ）国、アメリカ合衆国（Ｆ）　Ｚ　Ｉ　Ｐ　：　９４０８０（Ｖ）コンピュータ読取可能フオーム：（Ａ）媒体の型：ディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＭＢ　ＰＳ／２（Ｃ）操作システム：ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア：マルチメイト（ｖｊｉｉ）代理人／エージェント情報（Ａ）名前：バッセ、ジェームズ　Ｇ。

（Ｂ）登録番号：　２９，９６Ｇ（１ｘ）電気通信情報（Ａ）電話：　（４１５）７４２−７５００（Ｂ）ファックス：　（４１５）５８３−８２６９（２）配列認識番号１の情報：（１）配列特性：（Ａ）長さ＝２８アミノ酸残基（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｃ）鎖の状態：１本鎖（Ｄ）トポロジー、線状（１１）分子種類：タンパク質（１１１）仮説：無（ｉｖ）アンチセンス：無（ｖ）断片種類二Ｎ末端断片（ｖｉ）原型供給源：（Ａ）微生物：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ。

（Ｂ）固体／分離株：　ＩＡＭ　０１１１０５．ＡＴＣＣ５５１４２（Ｃ）細胞種類、単細胞細菌（Ｄ）発達段階：生長細胞（ｖｉｉ）中間体供給源８分離して培養した細菌：分離して配列した酵素（ｌｘ）特質（Ａ）名前／鍵：アルカリ性プロテアーゼ。

プロテアーゼ３７３３のＮ末端配列（Ｃ）同定方法：生化学アッセイ（Ｄ）他の情報：変性リゾチームおよびエラスチン上で特に活性である、コンタクトレンズの洗浄に有用なアルカリ性プロテアーゼとして活性（ｘｉ）配列の記載：配列認識番号１：Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＩ５１０Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ（３）配列認識番号２の情報。

（１）配列特性：（Ａ）長さ＝２９アミノ酸残基（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｃ）鎖の状態、１本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（１１）分子種類：タンパク質（ｉｉｉ）仮説：無（１ｖ）アンチセンス：無（Ｖ）断片種類：Ｎ末端断片（ｖｉ）原型供給源：（Ａ）微生物：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ（Ｂ）固体／分離株：バー、カールスバーグ（Ｃ）細胞種類：単細胞微生物（ｖｉｉ）中間体供給源：市販の配列された酵素（ＩＸ）特質（Ａ）名前／鍵：アルカリ性プロテアーゼ。

サブチリシン　カールスバーグのＮ末端配列（Ｃ）同定方法：生化学アッセイ（Ｄ）他の情報：アルカリ性プロテアーゼとして活性（ｘｉ）配列の記載：配列認識番号２：Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ＡｌａＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａ１Ｌｙｓ　Ｖａ！　Ａｌａ（４）配列認識番号３の情報：（１）配列特性（Ａ）長さ＝２８アミノ酸残基（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｃ）鎖の状態：１本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（１１）分子種類：タンパク質（１１１）仮説：無（１ｖ）アンチセンス：無（Ｖ）断片種類二Ｎ末端断片（ｖｌ）原型供給源：（Ａ）微生物：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ。

（Ｂ）個体／分離株：Ｙａ−Ｂ（Ｄ）発達段階：生長細胞（Ｇ）細胞種類：単細胞細菌（ｖｌ１）中間体供給源：培地から分離し配列した酵素（１ｘ）特質（Ａ）名前／鍵：アルカリ性プロテアーゼ、エラスターゼＹａ−ＢのＮ末端配列（Ｃ）同定方法：生化学アッセイ（Ｄ）他の情報：アルカリプロテアーゼとして活性（Ｘ）出版物情報（Ｃ）雑誌：バイオキム　パイオフィス　アクタ（Ｄ）巻二８３３（Ｆ）頁：　４３９−４４７（Ｇ）年：　１９ｇＢ（ｘｌ）配列の記載：配列認議番号３二Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｐｒ。

Ｌ　５　１Ｇｌｉｅ＾ｌａ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＡｒｇＶａｔ　ＡｌａＦｉｇ、　ｌｄ　Ｆｉｇ−１ｅ」ζｊ〒づ　ペＦｉｇ・　５国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯ２Ｃ１３１００８８０７−２Ｋ（７２）発明者　ミドル　プルツク　スーザン、エムアメリカ合衆国　ニューヨーク州　１４６１２０チエスター　ウッド　ラン　１６７Ｉ（７２）発明者　スティール、ダレル　バーニーアメリカ合衆国　アラバマ州　３６８３０　オーパーン　イースト　ユニヴアーシティードライヴ　８１５

Claims

【特許請求の範囲】

１．セリンプロテアーゼとして、変性リゾチームを分解する活性により特徴付けられるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．アルカリ性プロテアーゼ「プロテアーゼ３７３３」酵素であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて約２７，０００ダルトンの分子量と、表３に示したアミノ酸組成と、配列認識番号１に示したＮ末端配列と、アゾカゼインに関して少なくともｐＨ１１の最適ｐＨと、約５０℃の最適温度と、約４．９のｐＩと、約０．１８のエラスチン／カゼインの活性比率を有することを特徴とする酵素。
２．微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．菌株ＩＡＭ　０１１１０５の培養物であって、該培養物が、炭素、窒素、および無機基質の同化可能供給源を含有する水性栄養素培地中で発酵により回収可能な量でアルカリ性プロテアーゼ酵素「プロテアーゼ３７３３」を産生できることを特徴とする培養物。
３．微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．菌株ＩＡＭ０１１１０５の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物が、炭素、窒素、および無機基質の同化可能供給源を含有する水性栄養素培地中で発酵により回収可能な量でアルカリ性プロテアーゼ酵素「プロテアーゼ３７３３」を産生できることを特徴とする培養物。
４．請求の範囲第１項記載の新しいアルカリ性プロテアーゼ「プロテアーゼ３７３３」を産生する方法であって、培地でＢａｃｉｌｌｕｓ属に属するプロテアーゼ３７３３産生細菌を培養し、前記培地からプロテアーゼ３７３３を採取する各工程からなることを特徴とする方法。
５．前記プロテアーゼ３７３３産生細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＩＡＭ　０１１１０５菌株であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
６．前記培地が、ＣＡＰＳ緩衝液によりｐＨ９．０に緩衝されたトリプシンのダイズ肉汁であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
７．培養が約３０℃で好気的に行なわれることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
８．タンパク質汚染コンタクトレンズの洗浄方法であって、前記コンタクトレンズをアルカリ性プロテアーゼ３７３３の溶液に浸漬することからなる方法。
９．前記アルカリ性プロテアーゼ３７３３の溶液が水溶液であることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
１０．アルカリ性ｐＨの緩衝液中のアルカリ性プロテアーゼ３７３３からなるコンタクトレンズのクレンジング製剤。
１１．前記ｐＨが約７．０から約１３．０であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のクレンジング製剤。
１２．前記緩衝液がホウ酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のクレンジング製剤。
１３．前記ｐＨが約８．０であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のクレンジング製剤。
１４．前記アルカリ性プロテアーゼ３７３３の活性を増大せしめるのに適切な濃度でベーターメルカプトエタノールを含有することを特徴とする請求の範囲第１０項記載のクレンジング製剤。
１５．前記ベーターメルカプトエタノールが約０．４％の濃度であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のクレンジング製剤。
１６．前記アルカリ性プロテアーゼ３７３３の溶液が非水性溶媒であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のクレンジング製剤。
１７．前記非水性溶媒が、ヘキサン、シクロヘキサン、エタノール、メタノール、およびジメチルスルホキシドからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のクレンジング製剤。