JP4054577B2 - アルカリプロテアーゼ生産菌 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は工業的に利用価値の高いアルカリプロテアーゼを生産する新規バチルス属細菌に関する。
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、30年以上も前から衣料用洗剤に配合されてきたタンパク質を分解する酵素であり、衣類に付着したタンパク質系の汚れ、襟袖の汚れ、食べこぼし汚れ、血液汚れ等に洗浄助剤として効果を発揮してきた。中でもアルカリプロテアーゼは、衣料用洗剤を始めとして、洗顔剤、浴用剤、義歯洗浄剤、コンタクトレンズ洗浄剤等のトイレタリー分野、低アレルゲン化ラテックス製造等の化学品分野、烏賊の皮むき用、食肉軟化用等の食品分野、消化助剤や消炎剤といった医薬品分野等で利用されている。
【0002】
衣料等の汚れはタンパク質だけでなく、皮脂汚れや微粉塵等複数の成分が含まれていることから、洗剤用プロテアーゼとしてはタンパク質複合汚れに対して高い洗浄力を示す洗剤用アルカリプロテアーゼの取得が望まれており、斯かる観点から、本発明者らは高濃度の脂肪酸存在下でもプロテアーゼ活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の汚れを含む複合汚れに対して優れた洗浄力を示すバチルス属細菌の生産する分子量約43,000のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した(WO99/18218号公報)。
【0003】
この分子量約43kDaのアルカリプロテアーゼは、他のバチルス属細菌からもいくつか見出されており、いずれも従来からのズブチリシンタイプのセリンプロテアーゼに比べて非常に高い酸化剤耐性を有しており、酸化剤耐性アルカリプロテアーゼとして新しいズブチリシンサブファミリーを形成するものと提唱されている(Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-319, 2000)。
【0004】
このように、数種のバチルス属細菌が新しいタイプのアルカリプロテアーゼを生産することが明らかになってきたが、これら以外の新しいバチルス属細菌によっても同様な酵素が生産される可能性は大きい。従って、酸化剤耐性アルカリプロテアーゼを生産するバチルス属の新規な細菌を探索し、酵素生産に係わる応用の可能性を広げることが求められている。一方、写真工業や食品工業においては、ゼラチンを良好に分解できるプロテアーゼがフィルムの処理、食品加工等の分野で求められている。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、日本各地の土壌サンプル中から、タンパク質複合モデル汚染布に対し極めて高い洗浄力を示すアルカリプロテアーゼ生産菌を選抜し、菌株並びに産生酵素の諸性質について研究を行ったところ、特定の16SリボゾーマルDNA(以下、「16SrDNA」という)を有するバチルス属細菌が、優れた酸化剤耐性を有すると共にゼラチンに対する高い分解活性を示し、工業的に有用なアルカリプロテアーゼを生産し得ることを見出した。
【0006】
すなわち本発明は、バチルス属に属し、配列番号1で示される塩基配列又はこれと98%以上の相同性を有する塩基配列からなる16SリボゾーマルDNAを有するアルカリプロテアーゼ生産菌を提供するものである。
【0007】
また本発明は、バチルス エスピー KSM−9865(FERM−P18566号)として寄託されたアルカリプロテアーゼ生産菌を提供するものである。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、バチルス属に属し、配列番号1で示される塩基配列又はこれと98%以上の相同性を有する塩基配列からなる16SrDNAを有するものである。
配列番号1で示される塩基配列からなる16SrDNAを有する好適な菌株としては、例えばバチルス エスピー KSM−9865株及びこれと遺伝学的に同種の菌株が挙げられる。
また、配列番号1で示される塩基配列と98%以上の相同性を有する塩基配列からなる16SrDNAを有する菌株としては、例えば配列番号1で示される塩基配列からなる16SrDNAとGENENTYX−MACプログラム(ソフトウェア開発,Ver36)を用いたマキシマムマッチング法による相同性検索をを行った場合に98%以上の相同性を示す16SrDNAを有するものが挙げられ、例えばバチルス エスピー KSM−9865株と遺伝学的に同種の菌株及びこれと近縁の菌株であって、KSM−9865株が産生するアルカリプロテアーゼと同一若しくは類似の性質を有するプロテアーゼを産生する菌株が挙げられる。
【0009】
以下、本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌の性質について、バチルス エスピー KSM−9865を例に挙げて説明する。
尚、本発明アルカリプロテアーゼ生産菌の性質を検討するに当たり、比較として、類似の酸化剤耐性アルカリプロテアーゼを生産する公知のバチルス属細菌:バチルス エスピー KSM−KP43(FERM BP−6532)(WO99/18218号公報)、バチルス エスピー KSM−KP9860(FERM BP−6534)(WO99/18218号公報)、バチルス エスピー KSM−KP1790(FERM BP−6533)(WO99/18218号公報)、バチルス No.D−6(FERM P−1592)(特公昭56−4236号公報)、バチルス エスピー Y(FERM BP−1029)(特公平3−997号公報)、バチルス SD521(FERM P−11162)(特開平1−330069号公報)、バチルス エスピー NCIB12288、バチルス エスピー NCIB12289、バチルス エスピー NCIB12512及びバチルス エスピー NCIB12513(WO88/01293号公報)を選択した。
【0010】
(2)菌学的性質
(A)形態学的性質
(a)形及び大きさ:桿菌(0.5〜0.7×1.3〜3.5μm)
(b)胞子の有無、形、位置、大きさ:胞子嚢は膨潤、楕円形、中央(0.7〜0.85×1.3〜1.7μm)
(c)多形性:無し
(d)運動性:有り
(e)グラム染色:陽性
【0011】
(B)生理学的性質
(a)カタラーゼ:陽性
(b)オキシダーゼ:陽性
(c)VP反応:陽性
(d)硝酸塩の還元:陽性
(e)脱窒反応:陰性
(f)澱粉加水分解:陽性
(g)プルラン加水分解:陽性
(h)カゼイン加水分解:陽性
(i)ゼラチン加水分解:陽性
(j)馬尿酸加水分解:陰性
(k)Tween40加水分解:陽性
(l)Tween60加水分解:陽性
(m)Tween80加水分解:陽性
(n)クエン酸の利用:陽性
(o)プロピオン酸の利用:陰性
(p)チロシン分解:陽性
(q)フェニルアラニンの脱アミノ反応:陰性
(r)レシチナ―ゼ反応:陰性
(s)インドールの生成:陰性
(t)ジヒドロキシアセトンの生成:陽性
(u)生育pH範囲:pH7.4〜10.7 (pH8.5〜8.8が最適)
(v)生育温度範囲:12.7℃〜40℃ (36℃付近が最適)
(w)塩化ナトリウム耐性:7%塩化ナトリウムまで生育
(x)糖類の利用性:
▲1▼以下の糖を唯一の炭素源として利用できる:
グルコース、マンノース、マルトース、イノシトール、シュークロース,フラクトース、マン二トール、ズルシトール、ソルビトール、ラフィノース、ガラクトース、ゲンチオビオース、リボース、ツラノース、サリシン、メレチトース、N―アセチルグルコサミン。
▲2▼以下の糖類を利用できない:
ラクトース、グリセロール、エリスリトール、アラビノース、メリビオース、ラムノース、キシロース、キシリトール、アラビトール、タガトース、リキソース。
【0012】
以上の試験に用いた培地は、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol.2 (Sneath, P.H.A.ら、Williams & Wilkins, Baltimore, 1986)又はNielsenらの方法(Microbiology, 141, 1745-1761,1995)に従った。
【0013】
(2)遺伝学的性質
(a)16SrDNAの解析
Shimaらの方法(FEMS Microbiol. Lett. 119, 119-122,1994)に従い、PCR法によって16SrDNAのダイレクトシークエンスを行い、塩基配列を明らかにした(配列番号1)。そして、ClustalWプログラムを用いて系統樹を作成したことろ、本発明のKSM−9865株は、Bacillus psychrodurans DSM11713及びBacillus psychrotolerans DSM11706に近い位置に分類されるが異なる菌株であることが示された(図1)。尚、B. psychrodurans DSM11713及びB.psychrotolerans DSM11706の16SrDNAと本発明KSM−9865株のそれとの相同性は、それぞれ97.7%及び97.5%であった。
【0014】
(b)DNA−DNAハイブリダイゼーション
類似のアルカリプロテアーゼを産生すると予想される公知のバチルス属細菌(バチルス エスピー KSM−KP43(FERM BP−6532)、バチルス エスピー NCIB12288、バチルス エスピー NCIB12289、バチルス エスピー NCIB12512、バチルス エスピー NCIB12513)とのDNA−DNAハイブリダイゼーションを、フォトビオチンラベルDNAプローブを用い、Ezakiらの方法(Int. J. Syst. Bacteriol. 39, 224-229, 1989)により行ったところ、本発明のKSM−9865株はこれらのバチルス属細菌と最大で32〜42%(バチルス エスピー NCIB12512)、最低で0%(バチルス エスピー NCIB12289)というリアソシエーション率を示した。
以上より、本発明のKSM−9865株は、上記バチルス属細菌とは異なる菌株である。
【0015】
更に、酸化剤耐性アルカリプロテアーゼ生産菌であるバチルス エスピー KSM−KP1790、バチルス エスピー KSM−KP9860(WO99/18218号公報)、バチルス エスピー Y、バチルス エスピー D−6、バチルス エスピー SD521と比較すると、バチルス エスピー KSM−KP1790は、胞子嚢の膨潤が認められないこと、硝酸塩を還元しないこと、pH6.2で生育可能なこと、VPテスト陰性、クエン酸を利用しないこと等多くの点で本発明のKSM−9865とは異なり、バチルス エスピー KSM−KP9860は、硝酸塩を還元しないこと、pH6.2で生育可能なこと、VPテスト陰性、クエン酸を利用しないことより、やはり本発明KSM−9865とは異なる性質を有している。
一方、バチルス エスピー Y、バチルス エスピー D−6、バチルス エスピー SD521については16SrDNAの解析結果から、Bacillus cohniiに近縁であることが示されている。
【0016】
以上のことから、本発明のKSM−9865株は、公知の酸化剤耐性を有する新しいタイプのアルカリプロテアーゼ生産菌とは異なることは明白であり、また他のバチルス属細菌の中にも本発明のKSM−9865株は存在しないことから、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス エスピーKSM−9865として寄託した(受託番号:FERM P−18566号)。
【0017】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、適当な液体培地を用いて好気的に培養することにより菌体外にアルカリプロテアーゼを生産させることができる。
培地中には資化しうる炭素源、窒素源、更にビタミン類、金属塩類等の微量栄養源を適当に組合せ、培地のpHは8〜10の間に調整し、培養温度は25〜40℃、2〜5日間振盪培養を行えば良い。
使用する炭素源、窒素源は特に限定されないが、炭素源としてはグルコース、マルトース、フラクトース、シュークロース、可溶性澱粉等、窒素源としては魚肉エキス、各種アミノ酸、酵母エキス、肉エキス、ポリペプトン、コーンスティープリカー、ソイビーンミール、アジプロン、無機窒素化合物等が挙げられる。また、その他のリン酸、Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Na+、K+等の無機塩、ビオチン、パントテン酸、ピリドキサール、チアミン等のビタミン類を添加することもできる。
【0018】
かくして得られた培養液からアルカリプロテアーゼを得るには目的に応じて精製、結晶化、あるいは造粒化すればよい。
また、アルカリプロテアーゼの生産量を高めるために本発明菌株を変異育種することで得られる高生産変異株も使用することができる。
【0019】
さらに、本発明菌株の遺伝子から目的とするアルカリプロテアーゼ遺伝子をクローン化することもできる。得られた遺伝子を用いたアルカリプロテアーゼの生産方法は、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるプラスミドベクターに連結させる、あるいは当該変異遺伝子を安定に維持できる染色体DNA上に導入させる等の方法でアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を安定に増幅し、さらに当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、アルカリプロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満たす宿主菌としては例えば本発明のバチルス エスピー KSM−9865をはじめとするバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられる。
【0020】
次に、バチルス エスピー KSM−9865が産生するアルカリプロテアーゼ(K−9865)の性質を示す。
(1)分子量
12.5%アクリルアミドゲルを用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(分子量マーカーとしてファルマシアのLow molecular weight marker を使用)により求めた精製酵素の分子量は、約43,000である。
【0021】
(2)基質特異性
各種タンパク質基質に対する分解活性は、高アルカリ至適のズブチリシンであるK−16プロテアーゼ(Appl.Microbiol.Technol. 43、473-481、1995)と比較した場合、卵黄やゼラチンに対する分解活性が高く、特にゼラチンに対しては下表1に示すようにカゼインに対する活性値の10倍近い分解活性を有する。
【0022】
【表1】
【0023】
また合成基質であるBAEE(Nα-benzoyl-L-arginine-ethylester)、BTEE(N-benzoyl-L-trosine-ethylester)、ATEE(N-acetyl-L-tyrosine-ethylester)及びTAME(Nα-p-tosyl-L-arginine-methylester)に対する分解活性(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8)中(基質濃度0.5mM))は、BTEEのみに作用し、256nmにおける吸光度の増加を認める。
【0024】
(3)酸化剤耐性
50mM過酸化水素水を含む100mMホウ酸緩衝液(pH10.5)2mL中にK−9865を添加し、30℃で30分間放置し、充分量のカタラーゼ(ベーリンガーマンハイム)を加えて余剰の過酸化水素を除いた後の残存プロテアーゼ活性を合成基質法にて測定した場合、過酸化水素水による処理前の活性を100%とすると、90%以上の残存活性を有する(同条件で処理したK−16プロテアーゼの残存活性が5%以下である)。
【0025】
(4)最適反応pH
カゼインを基質として各pHの緩衝液中で酵素反応を行った場合、pH4−13の間で作用し、最適反応pHは11付近(ホウ酸緩衝液)であり、pH7−12においてもpH11での活性値の80%以上の活性を示す。
【0026】
(5)最適反応温度
カゼインを基質として50mMホウ酸緩衝液(pH10.5)中、各温度で酵素反応を行った場合、最適反応温度は60℃付近であり、5mMカルシウムを添加した場合、最適温度は70℃にシフトする。
【0027】
(6)等電点
等電点は、等電点電気泳動法(mini IEF Cell modelIII:バイオラッド)により求めた。すなわち、2%アンフォライン(ファルマライト、pH8−10.5:ファルマシア)を含む5%アクリルアミドゲルを用い、等電点マーカーキット(バイオラッド)の標準タンパク質の移動度から測定した等電点は、約pH9.5である。
【0028】
以上のとおり、本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌が産生するアルカリプロテアーゼは、公知の類似菌株から生産されるプロテアーゼと比較して、優れた酸化剤耐性を有し且つ高いゼラチン分解能を有する。
【実施例】
実施例1 KSM−9865株の分離
土壌サンプル(0.2g)を10mLの生理食塩水に懸濁し、80℃で10分間恒温した後、表2に示した組成の液体培地(10mL)を分注した大型試験管へ接種し、20℃にて3〜5日間振盪培養を行った。同培地を用いて2回植え継ぎを行った後、適当に希釈した培養液を表2に示した組成の寒天平板培地に塗抹した。20℃で5〜7日間培養したところ、プロテアーゼ生産菌の周辺はスキムミルクの分解によって生じる溶解斑が認められ、これらのプロテアーゼ生産菌を選抜した。得られた菌株は表3に示す組成の液体培地へ接種し、30℃で24時間振盪培養を行った。一部の培養上清を採り、過酸化水素水(pH10.5)中、30℃、30分間放置した後の活性が対照に比べ50%以上残存しているプロテアーゼを選抜した。中でも残存活性の高かったプロテアーゼ生産菌としてKSM−9865株を選抜した。尚、活性測定法は以下に述べる2通りの方法を用いた。培養活性はカゼイン法でまた酸化剤耐性を調べる場合には合成基質法を採択した。
【0029】
[プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法]
カゼイン1%(hanmerstein、メルク社製)を含む50mMホウ酸緩衝液(pH10)1.0mLを30℃で5分間保温した後、0.1mLの酵素溶液を加え、15分間反応を行った。反応停止液(0.11Mトリクロロ酢酸−0.22M酢酸ナトリウム−0.33M酢酸)を2.0mL加え、室温で10分間放置したのち、濾過(No.1濾紙、アドバンテック東洋)を行い、濾液中の酸可溶タンパク質をLowryらの方法(J.Biol. Chem.、193、265-275、1981)により次のように定量した。0.5 mLの濾液にアルカリ性銅溶液[1%酒石酸ナトリウムカリウム:1%硫酸銅:1%炭酸ナトリウム=1:1:100]を2.5mL添加し、30℃にて10分間放置後、希釈フェノール液(フェノール試薬(関東化学)を脱イオン水で2倍希釈)0.25mLを添加して30分間恒温したのち、660nmにおける吸光度を測定した。酵素1単位は、上記反応にて1分間に1mmolのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【0030】
[プロテアーゼ活性測定法−合成基質法]
合成基質(Ala−Ala−Pro−Leu−p−nitroanilide、ペプチド研究所)2.5mMを含む50mMホウ酸緩衝液(pH10)に酵素溶液を加え(全量0.5mL)、30℃中で10分間反応を行った。2mLの5%クエン酸を添加し反応を停止した後、420nmにおける吸光度を測定した。酵素1単位は、上記反応にて1分間に1μmolのp−nitroanilineを生成する酵素量とした。
【0031】
【表2】
【0032】
【表3】
【0033】
実施例2 アルカリプロテアーゼ(K−9865)の精製
実施例1で得られたKSM−9865株をポリペプトンS、マルトースを主成分とする液体培地に接種し、30℃で60時間振盪培養した。遠心分離により得られた培養上清液(3L)に90%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離により得られた沈殿物を少量の2mM塩化カルシウムを含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5:緩衝液A)に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行なった。透析内液(200mL)を予め緩衝液Aにて平衡化しておいたDEAE トヨパールカラム(2.5×14cm:東ソー)に添着させ、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収した(400mL)。次にこの活性画分を限外濾過(YM3メンブレン:アミコン)により30mLまで濃縮し、緩衝液Aにて平衡化しておいたSP−トヨパール550W(1.5×8cm:東ソー)に添着させ、0−50mMの塩化ナトリウムを含む緩衝液Aを用いた直線濃度勾配法により吸着したタンパク質を溶出した。プロテアーゼ活性を示す画分は非吸着画分にやや遅れて溶出された。この画分についてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、均一なプロテアーゼが得られていることを確認した(比活性150U/mg、活性収率15%)。タンパク質濃度の測定は牛血清アルブミン(バイオラッド)を標準タンパク質として用いてLowryらの方法に準じて行った。
【0034】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌によれば、優れた酸化剤耐性を有し且つゼラチン分解能の高い、洗剤用、写真工業、食品加工用のアルカリプロテアーゼが工業的に生産できる。
【0035】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、バチルス エスピー KSM−9865の16SrDNA配列に基づく系統樹を示す。
Claims (1)
- バチルス エスピー KSM−9865(FERM−P18566号)として寄託されたアルカリプロテアーゼ生産菌。
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