JP4681283B2 - 新規な高アルカリプロテアーゼ及びその利用 - Google Patents
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Description
(1)作用:
酸化型インスリンB鎖に作用して、その29箇所のペプチド結合のうち、少なくとも20箇所のペプチド結合を切断し、最大26箇所のペプチド結合を切断する。
(2)基質特異性:
天然タンパク質であるカゼイン、エラスチン、ケラチン、及びヘモグロビンを分解する。また、合成基質であるN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドを分解して、p-ニトロアニリンを生成する。
(3)作用pH及び最適pH:
作用pH範囲は5〜13であり、安定pH範囲は5〜11(50℃、10分間処理)であり、最適pHは12.6付近である。
(4)最適温度及び熱安定性:
最適温度が70℃であり、65℃までは加熱(pH10、10分間)による活性の低下がなく安定である。Ca2+イオンの存在によっても最適温度及び熱安定性は変化しない。
(5) 界面活性剤の影響:
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸エステル及びポリオキシエチレンアルキルアルコール(商品名:ソフタノール70H)によって活性が阻害されない。
(6)分子量:
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、31,000〜32,000である。
また、本発明は、配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の1個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、新規なアルカリプロテアーゼ前駆体を提供するものである。
(a)配列番号3に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号3に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(e)配列番号1に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
(f)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるポリヌクレオチドを提供するものである。
タンパク質を分解する。酸化型インシュリンB鎖を基質とした場合、N末端側のPhe−Val結合と、C末端側のThr−Pro−Lysの結合を除く、すべてのペプチド結合を切断するという特異な性質を有する。酸化型インシュリンB鎖の切断については、初期にLeu−Tyr結合を切断し、最終的にN末端側のPhe−Val結合と、C末端側のThr−Pro−Lysの結合を除く残りの少なくとも20箇所以上、最大26箇所のペプチド結合を切断する。
従来公知のプロテアーゼでは、酸化型インシュリンB鎖のペプチド結合の一部を切断することは知られていたが、上記のように多数の箇所を切断するものは今までに全く知られていなかったものである。
天然タンパク質であるカゼイン、エラスチン、ケラチンを分解し、更に血液成分であるヘモグロビンに対して高活性を有する。カゼインの分解活性を100%とした場合に、ヘモグロビンは約73%、ケラチンは約22%、エラスチンは約13%である。
作用pH範囲は5〜13であり、安定pH範囲は5〜11(50℃、10分間処理)であり、最適pHは12.6付近である。pHが12を超えても酵素活性の低下する傾向は見られない。
最適作用温度が70℃であり、65℃までは加熱(pH10、10分間)による酵素活性の低下がなく安定である。Ca2+イオンの有無に拘らず最適温度、耐熱性は変わらない。従来の公知の種々のプロテアーゼでは、Ca2+イオンが存在下では、一般的に最適温度が10〜20℃上昇する、また耐熱性も向上することが知られているが、本発明酵素ではこのような現象が全く見られず、従来のものと異なった特異な性質を有する。
Li+、K+、Na+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cu2+、Co2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+,Fe3+,Sn2+、Mn2+、Pb2+,Zn2+には1mMの濃度で阻害されない。Hg2+のみに1mMの濃度で阻害される。
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SAS)、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム(ES)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム(AOS)、アルカンスルホン酸ナトリウム(AS)、α−スルホ脂肪酸エステル(α−SFE)及びポリオキシエチレンアルキルアルコール(商品名:ソフタノール70H)によって活性は阻害されない。
キレート剤であるEDTA(エチレンジアミン四酢酸)が100mMという高濃度においても阻害されない。p−クロロマーキュリー安息香酸(1mM)、尿素(0.5M)、SDS(1mM)、トリトンX−100(1%)が存在しても殆んど阻害されない。セリンプロテアーゼ阻害剤であるPMSF(フェニルメタンスルフォニルフルオライド)(1mM)およびキモスタチン(30ppm)により阻害される。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、31,000〜32,000である。
トランスバーレンシス SAGM1の菌学的性質:
A.形態学的性質
(a)細胞の形: 直線あるいはカーブ状桿菌
(b)細胞の大きさ: (0.4〜0.7μm)×(3〜6μm)
(c)運動性: なし
(d)胞子: 有(直径0.8〜1.0μm)
(e)グラム染色性: 陽性
B.各種培地での生育状態
(a)複合基質標準寒天培地での生育状態:円形、低凸状、全縁なめらかなコロニーを形成する。コロニーの表面は無光沢でクリーム色である。
(b)複合基質標準液体培養: 混濁する
(c)独立栄養培地: 生育しない
C.生理的性質
(a)硝酸塩の還元 陰性
(b)チオ硫酸の還元 陽性
(c)元素状硫黄の還元 陽性
(d)硫化水素の生成 陽性
(e)フマル酸の還元 陽性
(f)発酵による水素の生成 陽性
(g)分子状水素による発酵阻害 陽性
(h)デンプンの利用 陰性
(i)単糖及びオリゴ糖の利用 陰性
(j)有機酸の利用 陽性
(k)低級アルコールの利用 陽性
(l)カゼインの利用 陽性
(m)生育の温度範囲 20〜50℃で生育可能
(n)生育のpH範囲 pH8.5〜12.4で生育良好
(o)好気培養 好気的条件で生育不能
培養温度は20〜50℃、特に40℃が好ましく、pHは8.5〜12.4、特に10.0〜11.0が好ましく、この条件下において通常1〜3日間で培養が完了する。
本発明酵素は、配列番号3で示される成熟酵素を構成するアミノ酸配列、当該配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、好ましくは配列番号3で示される成熟酵素を構成するアミノ酸配列またはこの配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであるから、本発明の高アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、これに対応したヌクレオチド配列である。
また、本発明酵素の前駆体は、配列番号2で示されるアミノ酸配列、当該配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列であるから、本発明の高アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む遺伝子は、これに対応したヌクレオチド配列である。
(a)配列番号3に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号3に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(e)配列番号1に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
(f)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるポリヌクレオチドである。
次に、実施例によって本発明を更に詳しく説明する。実施例中で特に注記しないものは「%」表示は質量%である。
理化学研究所微生物系統保存施設(JCM)から入手した寄託番号JCM10712号のアルカリフィルス トランスバーレンシスを、高井らの報告(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51, 1245-1256, 2001)に記載された方法に準じ、下記の表1及び表2に示した培地(pH10.5)を用いて1.5気圧の窒素ガス封入下、40℃で24時間培養し、プロテアーゼ活性の高い時点で、培養液を遠心(10,000×g、20分)した。
得られた培養上清を透析膜を用いて4℃の水道水に対して一晩透析処理を行った。透析内液を1Mのリン酸緩衝液を添加してpH7に調整した後、10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAE-Toyopearl(東ソー社製)にアプライし、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収した。更に活性画分を同緩衝液で平衡化したCM-Toyopearl(東ソー社製)にアプライし、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収した。この活性画分をSDS−電気泳動法で解析し、ほぼ均一なタンパク質としてプロテアーゼが得られていることを確認した。尚、タンパク質濃度の測定は牛血清アルブミン(バイオラッド社製)を標準タンパク質としてLowry等の方法(J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1981)に従い行った。
上記(ii)で得られた、精製されたアルカリプロテアーゼ(以下「アルカリプロテアーゼALTP」という)をPVDF膜(バイオラッド社製)にブロッティングし、アミノ酸シークエンサー(476A型、アプライドバイオシステムズ製)にてアミノ末端からのアミノ酸配列を決定した。その結果、ここで取得したアルカリプロテアーゼALTPのアミノ末端からのアミノ酸配列はAla-Gln-Ser-Thr-Pro-Trp-Gly-Val-Thr-Argであった。また、精製酵素をトリプシンによって部分消化し、得られたペプチド断片中の一つの断片のアミノ末端からのアミノ酸配列は、Met-Ala-Ala-Pro-His-Val-Ala-Gly-Valと決定された。
遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
上記(iii)にて得られたアルカリプロテアーゼALTPのアミノ末端からのアミノ酸配列をもとに、配列番号4に示すプライマー1(5’-GCNCARWSNACNCCNTGGGG-3’、ここでそれぞれNはA、T、GまたはCを;RはAまたはGを;WはTまたはAを;SはGまたはCを示す。)を合成した。一方、原核生物由来セリンプロテアーゼファミリーに属する酵素群のアミノ酸配列を比較した結果、これらの酵素に共通して存在するアミノ酸配列として、Gly-His-Gly-Thr-His-Val-Ala-Glyが見い出され、本保存性の高いアミノ酸配列から推定された配列番号5に示すプライマー2(5'-CCNGCNACRTGNGTNCCRTG-3')を合成した。斎藤と三浦の方法(Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963)に準じ、アルカリフィルス トランスバーレンシスより染色体DNAを調製した。この染色体を鋳型として、上記のプライマー1と2およびLA Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いてPCR増幅を行なった。PCRの反応条件は、94℃で1分間変性後、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間を1サイクルとしてこれを30サイクル行なった。その結果、約0.2kbのDNA断片が増幅され、Big Dye Teminator Cycle Sequencingキット(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて本増幅DNA断片の配列を決定した。決定された塩基配列をもとに合成したプライマーとLA PCRインビトロ遺伝子クローニングキット(タカラバイオ社製)を用いて、さらに上流および下流域の遺伝子配列を決定した。その結果、配列番号1に示す1131塩基対から成るセリンプロテアーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列並びに配列番号2に示す376個のアミノ酸から成るアミノ酸配列が決定された。更に、配列番号3に示す本発明高アルカリプロテアーゼの成熟酵素のアミノ酸配列を決定した。決定された配列から精製酵素のアミノ末端アミノ酸配列および精製酵素をトリプシンによって部分消化して得られたペプチド断片のアミノ末端アミノ酸配列が確認された。
前記(iv)にて決定したアルカリプロテアーゼALTPをコードする遺伝子をもとに、配列表の配列番号6に示すプライマー3(5’−CATTTTTACACCAATATTTACATTTTAATTCCAAG−3’)、及び配列番号7に示すプライマー4(5’−ATTTCCAGCTATTTATCTCCTTCTATATATTG−3’)を用いて、アルカリフィルス トランスバーレンシスの染色体DNAを鋳型としてPCR増幅を行った。PCRの反応条件は、94℃で1分間の熱変性後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間を1サイクルとし30サイクル行なった。得られたPCR増幅断片をT4 DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて末端を平滑化し、さらにT4 ポリヌクレオチドキナーゼ(タカラバイオ社製)によって末端をリン酸化した。このDNA断片をSmaIにて消化したベクターpHY300PLK(ヤクルト本社製)に結合し、組換えプラスミドを作製した。これを用いてB.subtilis ISW1214株を形質転換した。得られた形質転換株を3%(w/v)ポリペプトンS、0.5%魚肉エキス、0.1%酵母エキス、0.1%リン酸1カリウム、0.02%硫酸マグネシウム、別途滅菌した3%マルトースとテトラサイクリン(15μg/ml)から成る培地にて、30℃、72時間好気的に振盪培養を行った。その結果、培養液1リットル当たり0.1〜2単位(PU)の本発明酵素であるアルカリプロテアーゼALTPを得た。
(a)カゼイン法
1%(w/v)カゼイン(ハマーシュタイン:メルク社製)を含む50mmol/L各種緩衝液1mLを40℃で5分間保温した後、0.1mLの酵素溶液を添加し15乃至20分間反応を行った。その後、トリクロロ酢酸溶液(TCA溶液:0.11mol/Lトリクロロ酢酸、0.22mol/L酢酸ナトリウム、0.33mol/L酢酸)2mLを添加して反応を停止し、室温で10分間放置し、酸変性タンパク質を濾過(No.2濾紙、ワットマン社製)した。濾液0.5mLにアルカリ性銅試薬[1%(w/v)酒石酸カリウム・ナトリウム:1%(w/v)硫酸銅:2%(w/v)炭酸ナトリウム/0.1 mol/L水酸化ナトリウム=1:1:100]2.5mLを添加し、30℃、10分間恒温した後、希釈フェノール試薬[フェノール試薬(関東化学社製)を脱イオン水で2倍希釈したもの]0.25mLを加え、30℃、30分間恒温した。分光光度計を用いて660nmにおける吸光度を測定し、酸可溶性タンパク質分解物の生成量を求めた。なお、上記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えた系をブランクとした。
ここで、酵素1単位(PU)は、上記の反応条件において1分間に1μmolのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とした。
0.9mLの100mmol/Lホウ酸緩衝液(pH=10.0、2mmol/L塩化カルシウム含有)に50mmol/Lの合成基質溶液(オリゴペプチドのp−ニトロアニリド誘導体をジメチルスルホキサイドに溶解したもの)0.05mLを混合し、30℃で5分間保温した後、0.05mLの酵素溶液を加え、30℃、10分間反応を行った。5%(w/v)クエン酸溶液2mLを添加して反応を停止させ、分光光度計を用いて420nmにおける吸光度を測定して、遊離したp−ニトロアニリン量を定量した。
ここで、酵素1単位(U)は、上記の反応条件において1分間に1μmolのp−ニトロアニリンを遊離させるのに必要な酵素量とした。
アルカリプロテアーゼALTPの性質
上記(v)で得られた本発明酵素であるアルカリプロテアーゼALTPの性質は以下の通りであった。
(a)最適pHおよびpH安定性
基質として1%(w/v)カゼインを含むpH3.5〜12.6の種々の緩衝液中で、本発明酵素を40℃、15分間反応させ、それぞれのpHにおける酵素活性を測定した。その結果を最高活性を100%とした相対活性として図1Aに示す。本発明のアルカリプロテアーゼALTPは、50mmol/Lの塩化カリウム/水酸化ナトリウム緩衝液中で、pH12.6において最も高い活性を示した。
尚、使用した各種緩衝液及びそのpH範囲は次のとおりである。
酢酸緩衝液(□):pH3.5〜6.0、リン酸緩衝液(■):pH6.5〜8.1、炭酸緩衝液(○):pH9.0〜11.0、リン酸/水酸化ナトリウム緩衝液(●):pH11.0〜12.2、塩化カリウム/水酸化ナトリウム緩衝液(▲):pH11.5〜12.6。
基質として0.5%(w/v)カゼインを含む50mmol/Lのホウ酸緩衝液(pH10.0)1mL中に、本発明酵素溶液0.1mLを添加し、30〜85℃の各温度で15分間反応させてカゼイン法により活性測定を行った。50℃における塩化カルシウム非存在下での活性値を100%として、各温度における相対活性を図2Aに示す。「●」は塩化カルシウム非存在下、「○」は塩化カルシウムが存在下での相対活性を示す。本発明のアルカリプロテアーゼALTPは、その最適反応温度を70℃に有することが判った。また、塩化カルシウム非存在下及び塩化カルシウム存在下での活性曲線はほとんど重なっており、塩化カルシウム(5mmol/L)の添加によっても、その最適反応温度は殆ど影響を受けないことがわかった。
50mmol/Lのホウ酸緩衝液(pH10.0)中に、本発明酵素を添加して30〜75℃の各温度で10分間加熱処理を行ない、カゼイン法により残存活性を求めた。加熱前の活性を100%として加熱処理後の残存活性を図2Bに示す。本発明のアルカリプロテアーゼALTPは、65℃までは加熱による活性の低下がなく安定で優れた活性を有することが判った。また、塩化カルシウム(5mmol/L)の添加による耐熱性の向上は認められなかった。
次の表3に示す各濃度の金属塩を含む20mmol/Lホウ酸緩衝液(pH10.0)中に本発明のアルカリプロテアーゼALTPの溶液を添加し、30℃、20分間の処理を行った。その後、カゼイン法により残存活性の測定を行った。その結果を、金属塩を添加しない場合を100%とした相対値として表3に示す。
本発明のアルカリプロテアーゼALTPに対する界面活性剤の影響を調べた。即ち、0.1mol/Lトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)中に本発明の酵素溶液を加え、表4に示す種々の界面活性剤を添加して、40℃、4時間の処理を行い、その後、2mmol/L塩化カルシウムを含む50 mmol/Lホウ酸緩衝液(pH10.5)で適宜希釈しカゼイン法により残存活性を測定した。残存活性は、酵素を各試料に添加した直後の活性値(処理時間0分)を100%とし相対値で表した。その結果を表4に示す。
本発明のアルカリプロテアーゼALTPの分子量を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分子量マーカーには、低分子量用マーカーキット(ファルマシア社製)である、ホスホリラーゼb(分子量:94,000)、牛血清アルブミン(分子量:67,000)、卵白アルブミン(分子量:43,000)、カルボニックアンヒドラーゼ(分子量:30,000)、大豆トリプシンインヒビター(分子量:20,100)、α−ラクトアルブミン(分子量:14,400)を用いた。図4から、本発明酵素標品は、その分子量が約31,000〜32,000であると推定された。
20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7)に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本発明酵素を添加し、30℃で20分間恒温した。その後50mmol/Lホウ酸緩衝液(pH10)で適当に希釈を行い、残存活性を測定した。その結果を表5に示す。本発明のアルカリプロテアーゼALTPは、セリンプロテアーゼの阻害剤であるPMSF、およびキモスタチンにより完全に阻害されるが、キレート剤であるEDTAが存在してもほとんど阻害を受けないことがわかった。
合成オリゴペプチド基質として、表6に示すもの又は下記のものを用いて、本発明のアルカリプロテアーゼALTPの各種合成基質に対する反応性を調べた。
0.9mLの100mmol/Lホウ酸緩衝液(pH=10.0、2mmol/L塩化カルシウム含有)に50mmol/Lの表6に示す合成基質溶液0.05mLを混合し、30℃で5分間恒温した後、0.05mLの酵素溶液を加え、30℃、10分間反応を行った。5%(w/v)クエン酸溶液2mLを添加して反応を停止させ、分光光度計を用いて420nmにおける吸光度を測定して、遊離したp-ニトロアニリン量を定量した。
N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド(AAPF)に対する活性が最も高く、これを100%としてその他の各合成基質に対する相対活性を表6に示す。
(i)初期切断サイトの確認
0.1mol/Lのトリス塩酸緩衝液(pH8.0)100μLに0.1mgのインスリンB鎖を加えた溶液に、3ngのアルカリプロテアーゼALTPを加え、30℃で1〜5分間反応させた。反応開始から、1分後、2分後、および5分後にそれぞれ5μLを分取し、50μLの2%(v/v)アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸溶液(pH2.2)を加えて反応を停止した。これらの反応液について、液体クロマトグラフ/タンデム質量分析装置(LC/MS/MS)で解析した。本発明のアルカリプロテアーゼALTPで消化した断片ペプチドの混合物をキャピラリーHPLCで分離濃縮し、イオン化した後、MS及びMS/MSスペクトルを得た。ペプチドのMS/MSデータをTurbo Sequestサーチして、消化された酸化型インスリンB鎖の断片を同定し、切断サイトを決定した。MS/MSデータにて検索のため信頼性の高い同定結果が得られた。
前記(i)と同一の条件で、アルカリプロテアーゼALTPの濃度を300ngにして、30℃で24時間反応させた。反応停止後、同様の方法によってアルカリプロテアーゼALTPで消化された酸化型インスリンB鎖の断片を同定し、切断サイトを決定した。
番号2がズブチリシンSendaiを、番号3がM−プロテアーゼを、番号4がズブチリシン Carlsbergを、番号5がズブチリシン BPN'を示す。
更に具体的には、重軽質洗剤、自動食器用洗剤、洗浄剤、トイレ芳香剤、風呂水清浄、配管清浄、オリゴペプチド製造、食肉軟化、皮革なめし、アレルゲン除去、消化剤、環境浄化などタンパク質を分解する全ての産業に利用することができる。
Claims (7)
- アルカリフィルス
トランスバーレンシス(Alkaliphillus transvaalensis)由来の、次の理化学的性質を有する新規なアルカリプロテアーゼ。
(1)作用:
酸化型インスリンB鎖に作用して、その29箇所のペプチド結合のうち、少なくとも20箇所のペプチド結合を切断し、最大26箇所のペプチド結合を切断する。
(2)基質特異性:
天然タンパク質であるカゼイン、エラスチン、ケラチン及びヘモグロビンを分解する。合成基質であるN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドを分解して、p-ニトロアニリンを生成する。
(3)作用pH及び最適pH:
作用pH範囲は5〜13であり、安定pH範囲は5〜11(50℃、10分間処理)であり、最適pHは12.6付近である。
(4)最適温度及び熱安定性:
最適温度は70℃であり、65℃までは加熱(pH10、10分間)による活性の低下がなく安定である。Ca2+イオンの存在によっても最適温度及び熱安定性は変化しない。
(5)
界面活性剤の影響:
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸エステル及びポリオキシエチレンアルキルアルコールによって活性が阻害されない。
(6)分子量:
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、31,000〜32,000である。 - 配列表の配列番号3で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の1個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項1記載の新規なアルカリプロテアーゼ。
- 配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の1個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなる、新規なアルカリプロテアーゼ前駆体。
- 請求項1または2に記載の新規な前記の新規アルカリプロテアーゼまたは請求項3に記載のその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、下記(a)〜(f)からなる群、
(a)配列表の配列番号3に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列表の配列番号3に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(e)配列表の配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
(f)配列表の配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるポリヌクレオチド。 - 請求項4に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
- アルカリフィルス
トランスバーレンシス(Alkaliphillus transvaalensis)、又は請求項6に記載の形質転換された微生物を培養し、その培養液よりアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とする、請求項1に記載の理化学的性質又は請求項2に記載のアミノ酸配列からなる新規なアルカリプロテアーゼの製造方法。
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