JP3664803B2 - 低温アルカリプロテアーゼｔ１６、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な低温アルカリプロテアーゼ、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種起源のプロテアーゼは、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去、消化助剤、消炎剤の成分等、多分野で盛んに利用されている。
【０００３】
その中で、最も大量に工業生産され、市場規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアーゼであり、アルカラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社製）、プロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）等が知られている。しかしながら、これらの酵素は最適温度が高温側にあるため、水道水の温度などの低温領域で衣料を洗浄する場合、その酵素特性が充分に発揮されているとはいいがたい。また、上述のプロテアーゼの応用分野のほとんどは、体温、室温、低温条件下であるため、高温至適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用いる高温処理工程は、省エネルギーの観点からも好ましいとはいえない。
【０００４】
一方、低温至適プロテアーゼは、皮なめし、パンの小麦蛋白の加工、あるいは反応系に熱をかけられないようなケース、すなわちチーズの熟成、肉の軟化等の食品の改質にも有効である。
【０００５】
プロテアーゼの洗剤等の商品への配合や工業的プロセス等での利用を考えた場合、室温から低温領域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵素の機能を充分発揮させる上で、必須の条件である。これまでに、寒冷地土壌、寒冷環境に棲息する生物、海水、冷蔵中のミルク等から分離された、プロテアーゼ生産菌が生産するプロテアーゼは必ずしも低温酵素ばかりではないが、数多くの報告例がある。
【０００６】
すなわち、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）No.５４８株（Agric. Biol. Chem.,３６巻，１１８５頁，１９７０年）、エシェリヒア フロインディ（Escherichia freundii）の一菌株（Eur. J. Biochem.,４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモナス マルトフィラ（Xanthomonas maltophila）０４７／０８株（FEMS Microbiol. Lett.,７９巻，２５７頁，１９９１）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｔ１６株（Appl. Environ. Microbiol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナス フルオレセンスＡＦＴ３６株（Biochim. Biophys. Acta,７１７巻，３７６頁，１９８２年）、シュードモナス エスピー１４５−２株（Microbios.,３６巻，７頁，１９８２年）、アエロモナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）９０１６／０２株（J. Appl. Bacteriol.,５３巻，２８９頁，１９８３年）、シュードモナス パウシモビリス（Pseudomonas paucinomobilis）０４９／０３株，１７８／１３株，１８９／０６株とバチルス エスピー（Bacillus sp.）１７２／１５株（J. Basic Microbiol.,３１巻，３７７頁，１９９１年）、ビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＡ１株（Antonie van Leeuwenhoek,４４巻，１５７頁，１９７８年）、シュードモナス フルオレセンスＮＣＤＯ２０８５株（J. Dairy Res.,５３巻，４５７頁，１９８６年）、シュードモナス フルオレセンスＯＭ２２８株とセラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）ＯＭ１１９２株（J. Dairy Res.,５３巻，９７頁，１９８６年）、シュードモナス フルオレセンスＧＲ８３株（Lebensm.-Wiss. u.-Technol.,２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペシロミセス マルクァンディ（Paecilomyces marquandii（ＷＯ８８／０３９４８）、キサントモナス エスピー（Xanthomonas sp.）Ｓ−１株（特開平５−２１１８６８号公報）等の低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼを生産する。
【０００７】
低温細菌が生産するプロテアーゼに関しては、Fairbainらが要領よく総説にまとめている（J. Dairy Res.,５３巻，１３９頁，１９８６年）。これらのプロテアーゼの一部には、低温領域に至適温度を有している酵素も存在しているので前述の用途に使えることが期待できる。
【０００８】
最近、Asgeissonらは、スケソウダラのエラスターゼについて（Biochim. Biophys. Acta,１１６４巻，９１頁，１９９３年）、Fellerらは、好冷細菌であるバチルス ＴＡ４１株の産生するプロテアーゼ（J. Biol. Chem.,２６９巻，１７４５３頁，１９９４年）と好冷細菌であるアルテロモナス ハロプランクティス（Alteromonas haloplanctis）Ａ２３株が産生するα−アミラーゼについて（J. Biol. Chem.,２６７巻，５２１７頁，１９９２年）、それぞれの触媒化学的性質から、これらの酵素が低温条件に適応している可能性を示唆した。また、Jackmanら（Appl. Environ. Microbiol.,４６巻，６頁，１９８３年）あるいはPatelら（Appl. Environ. Microbiol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）によると、好冷細菌であるシュードモナス フルオレセンスが生産するプロテアーゼは、中温細菌由来のプロテアーゼと比較して、活性化エネルギーが低い。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来、種々の低温プロテアーゼが知られているが、更に洗浄剤等に利用する上で、高性能の低温プロテアーゼの開発が望まれている。従って本発明は、低温条件下においても高い活性を保持し、かつ反応の最適pHがアルカリ側にある新規な低温アルカリプロテアーゼを提供すること、並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当該微生物を用いた低温アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは低温アルカリプロテアーゼを自然界から探索した結果、土壌サンプルから至適温度を２８〜３２℃に有し、低温条件下（例えば０℃以下）でも充分に作用するアルカリプロテアーゼを生産するスフィンゴモナス属細菌を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の酵素学的性質を有する低温アルカリプロテアーゼＴ１６、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤を提供するものである。
【００１２】
１）作用温度及び最適温度
少なくとも０〜６０℃で作用し、最適温度は２８〜３２℃である。１０℃で最適温度における活性の２０〜３０％、０℃で最適温度における活性の１０〜２０％の活性を保持する。
Ｃａ2+が存在すると最適温度は３８〜４２℃に移行する。
【００１３】
２）温度安定性
pH１０．０、１５分間の処理条件で約４８〜５２℃まで安定であり、Ｃａ2+が存在すると約６０℃まで安定である。
【００１４】
３）作用pH及び最適pH
少なくともpH５〜１２で作用し、最適pHは約９である。pH１２においても最大活性値の６０〜７０％の活性を保持する。
【００１５】
４）pH安定性
２０℃、１５分間の処理条件でpH５〜１２の範囲で安定である。
【００１６】
５）分子量
セファクリルＳ−２００を用いたゲルクロマトグラフィーによる推定分子量は、２６，０００±１，０００である。
【００１７】
６）基質特異性
カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンとケラチンに対しても作用する。
合成基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa、Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNa、Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNa、Z-Gly-Gly-Phe-pNa、Suc-Ala-Ala-Ala-pNa、Suc-Ala-Pro-Ala-pNa及びSuc-Ala-Ala-Phe-pNaに対して作用し、ｐ−ニトロアニリンを遊離する（Sucはスクシニル基を、Gltはグルタリル基を、Zはカルボベンゾイル基を、pNaはｐ−ニトロアニリノ基を示す）。
【００１８】
７）金属イオンの影響
Ｈｇ2+によって阻害される。
【００１９】
８）阻害剤
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及びキモスタチンによって阻害される。
【００２０】
９）界面活性剤の影響
ソジュウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）、ソジュウムα−オレフィンスルホン酸（ＡＯＳ）、ソジュウムアルカンスルホン酸（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、ソジュウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム（ＥＳ）等に対して極めて安定である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６は、例えばスフィンゴモナス エスピー（Sphingomonas sp.）ＫＳＭ−Ｔ１６を培養し、その培養物から採取することにより製造される。
【００２２】
本発明のスフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６の分類同定に用いた培地を以下に示す（重量％で示す）。
【００２３】
【００２４】
スフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６の分類学的性質を以下に示す。
【００２５】
（ａ）顕微鏡的観察結果
０．９〜１．０μm ×１．８〜４．４μm の桿菌であり、極鞭毛を有し、運動性がある。胞子の形成は認められない。
【００２６】
（ｂ）グラム染色性
陰性。
【００２７】
（ｃ）各種培地における生育状態
１．肉汁寒天平板培養（培地１）
生育状態は良い。集落の形状は円形、表面は円滑で光沢がある。集落の色調は、黄白色で半透明である。
２．肉汁寒天斜面培養（培地１）
生育する。
３．肉汁液体培養（培地２）
生育は良好で、菌膜の形成は認められない。
４．肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）
ゼラチンの液化が認められる。
５．リトマスミルク培地（培地４）
酸生成は認められない。
【００２８】
（ｄ）生理学的性質
１．硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）
いずれも陰性。
２．ＶＰテスト（培地６）
陰性。
３．インドールの生成（培地７）
陰性。
４．硫化水素の生成（培地８）
陰性。
５．澱粉の加水分解（培地９）
陰性。
６．クエン酸の利用（培地１０、１１）
陽性。
７．無機窒素源の利用（培地１２）
アンモニウム塩及び硝酸塩を利用しない。
８．色素の生成（培地１３、１４）
陰性。
９．ウレアーゼ（培地１５）
陰性。
10．オキシダーゼ（培地１６）
陽性。
11．カタラーゼ（培地１６）
陽性。
12．生育のpH範囲（培地１８）
生育のpH範囲は５〜１１である。
生育の至適pH範囲は８〜９にある。
13．生育の温度範囲（培地１、１９）
生育の温度範囲は５〜３５℃であり、最も生育が旺盛な温度は２０〜３０℃の間にある。
14．酸素に対する態度（培地２０）
通性嫌気性。
15．Ｏ−Ｆテスト（培地２１）
酸化型。
16．糖の利用性
Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース等を利用することができる。
17．食塩含有培地における生育（培地１中）
食塩濃度３％では生育するが、５％では生育できない。
18．カゼインの分解（培地２２）
陽性。
【００２９】
以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology）第８版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、スフィンゴモナス属の一種と判断された。そこで、本菌株をスフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６と命名し、ＦＥＲＭ Ｐ−１５４５７として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００３０】
上記の菌株を用いて、本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。
【００３１】
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、その例としては、炭素源として例えばグルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、マルトース、廃糖蜜や資化うしる有機酸、例えばクエン酸等が挙げられる。また窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミール、綿実油粕、カルチベータ、ゼスト等の有機窒素源が有効である。また、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
【００３２】
培養温度は、５〜３５℃、特に１５〜３０℃前後が好ましく、培養初発pHは５〜１１、特にpH８〜９が好ましい。この条件下において通常１〜３日間で培養は完了する。
【００３３】
かくして得られた培養液の中から目的の酵素である低温アルカリプロテアーゼＴ１６を採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行えば良い。即ち、培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。
【００３４】
本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６の酵素学的諸性質について以下に説明する。
【００３５】
〔酵素活性測定法〕
カゼイン１％を含む５０mMの各種緩衝液１mlを０．１mlの酵素溶液と混合し、２５℃、１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）２mlを加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem.,１９３巻，２６５頁，１９５１年）によって測定した。上記反応条件下において、１分間に１mmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００３６】
合成基質の加水分解反応を行う場合は、５５．５mM炭酸緩衝液（pH１０．０、０．９ml）に５０mMの各種合成基質溶液（ジメチルスルホキシドに溶解）０．０５mlを混合し、２５℃で５分間保温した後、０．０５mlの酵素液を加え２５℃で５分間反応させた。反応停止液（５％クエン酸）２mlを加えた後、分光光度計を用いて直ちに４２０nmにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１単位（Ｕ）は上記反応条件において１分間に１μmol のｐ−ニトロアニリンを遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００３７】
〔酵素学的性質〕
（１）基質特異性
５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に各種蛋白基質を０．１％又は１％になるように加えた後、酵素を適当量添加して２５℃で１５分間反応を行った。カゼインを基質とした場合の分解活性を１００として、それぞれの基質に対する分解活性を表１に示した。この結果から明らかなように、本酵素はカゼイン、ヘモグロビン及びケラチンに対して良好な分解活性を示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ｐ−ニトロアニリンが結合した合成オリゴペプチド基質を用いて、これらの分解活性を調べた結果を表２に示した。供試したＮ−スクシニル化したAla-Ala-Pro-Phe、Ala-Ala-Pro-Val、Ala-Ala-Ala、Ala-Pro-Ala及びAla-Ala-Phe、Ｎ−グルタリル化したAla-Ala-Pro-Leu、Ｎ−カルボベンゾイル化したGly-Gly-Phe等の合成基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離が認められた。
【００４０】
【表２】
【００４１】
（２）作用温度及び最適温度
基質として０．９１％のカゼインを含む５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反応を行った。図１から明らかなように、本酵素の最適温度は２８〜３２℃であった。カルシウム（CaCl2として２mM）が存在すると、最適温度は約３８〜４２℃に移行し、カルシウム非存在下の最適温度に比べ、約１．５倍の活性促進が認められた。また本酵素は１０℃でも最適温度の活性の約２０〜３０％の活性を示し、０℃（氷水中）でも最適温度の活性の約１０〜２０％の活性を示し、低温条件下でも充分作用することがわかる。
【００４２】
（３）温度安定性
５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素を加え、各温度で１５分間加熱した後氷冷した。カゼインを基質として、２５℃で残存活性を求め、その結果を図２に示した。本酵素はＣａ2+非存在下で４８〜５２℃まで、２mM Ｃａ2+存在下で６０℃においても全く失活しなかった。一般に最適温度以上の高い温度に低温酵素をさらすと失活することが知られているが、本酵素の場合、最適温度以上で極めて安定な性質を示す特徴を有することがわかる。
【００４３】
（４）作用pH及び最適pH
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（５０mM）中に最終濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、２５℃で１５分間反応を行い、各pHでの活性を測定した。図３から明らかなように、本プロテアーゼの最適pHは９近傍に認められる。また、その作用pHは、少なくともpH５〜１２と幅広い。pH１２においても最大活性値の６０〜７０％の活性を保持する。
【００４４】
（５）pH安定性
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（２５mM，各pH）中に本酵素を加え、２０℃で１５分間放置し、カゼインを基質として残存活性を２５℃で測定した。図４に示したように、本酵素はpH５〜１２の広い範囲で安定であった。
【００４５】
（６）分子量
本酵素の分子量をセファクリルＳ−２００を用いたゲルクロマトグラフィーにより測定した。分子量マーカーには、低分子量用マーカーキット（バイオラッド社製）のアルブミン（分子量：６６，０００）、オブアルブミン（分子量：４３，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：２９，０００）、キモトリプシノーゲン（分子量：２５，０００）、リボヌクレアーゼ（分子量：１３，７００）及びチトクロームｃ（分子量：１２，４００）を用いた。図５から明らかなように、本プロテアーゼの見かけの推定分子量は２６，０００±１，０００である。
【００４６】
（７）金属イオンの影響
各種金属塩が１mMになるように添加した２０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素溶液を添加し、２０℃で２０分間放置した。その後、５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）で適当希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無添加系で同様に処理した酵素活性を１００％として処理群の残存活性を求めた。本酵素活性は、Ｈｇ2+によってのみ阻害された（表３）。
【００４７】
【表３】
【００４８】
（８）阻害剤の影響
１０mMリン酸緩衝液（pH７．０；２mM CaCl2含有）に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本酵素を添加し、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。表４から明らかなように、キレート剤であるＥＤＴＡとＥＧＴＡ及びセリン酵素阻害剤であるＰＭＳＦ及びキモスタチンによって阻害されることより、本酵素は金属依存性セリンプロテアーゼであると考えられる。
【００４９】
【表４】
【００５０】
（９）界面活性剤の影響
本酵素を、０．２％の界面活性剤を含有する５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０；２mM CaCl2含有）に加えて、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。表５から明らかなように、本酵素はＳＤＳ、ＡＯＳ、ＳＡＳ、α−ＳＦＥ、ＡＥ、ＬＡＳ、ＥＳ（それぞれ０．２％濃度）等の界面活性剤と長時間接触させてもほとんど失活せず、強力な界面活性剤耐性を有していることがわかる。
【００５１】
【表５】
【００５２】
このように、本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６は、過去の報告に無い新規酵素である。最近、南極の海水から分離されたバチルス属の一種が熱に不安定なズブチリシン型の酵素を生産することが報告されているが（Davailら、J. Biol. Chem.,２６９巻，１７４４８頁（１９９４年））最適温度が４０℃近傍にあり、その他の性質を較べても明らかに本発明の酵素とは異なっている。
【００５３】
本発明の洗浄剤組成物中への上記低温アルカリプロテアーゼＴ１６の配合量は、低温アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１kg当たり０．１〜５０００Ｕ、特に１〜５００Ｕが好ましい。
【００５４】
また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【００５５】
（１）界面活性剤
平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のオレフィンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルカンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０のα−スルホ脂肪酸メチルあるいはエステル塩、平均炭素数８〜２０の高級脂肪酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩等のアニオン性界面活性剤；平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、１〜２０モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付加物等の非イオン性界面活性剤；その他ベタイン型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性界面活性剤等の界面活性剤を単独で又は組合わせて用いることができる。
【００５６】
これらの界面活性剤は、洗浄剤組成物中５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物については２０〜５５％配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成物が漂白剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００５７】
（２）二価金属イオン捕捉剤
トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩等を任意に用いることができる。
【００５８】
この二価金属イオン捕捉剤は、０〜５０％、好ましくは５〜４０％配合される。また、リンを含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがより好ましい。
【００５９】
（３）アルカリ剤及び無機塩
ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミン等を任意に用いることができる。これらは０〜８０％配合される。
【００６０】
（４）再汚染防止剤
ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース等を任意に用いることができる。再汚染防止剤は０〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００６１】
（５）酵素
セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、低温アルカリプロテアーゼＴ１６以外のプロテアーゼ等の酵素を任意に用いることができる。低温アルカリプロテアーゼＴ１６はセルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ等の酵素と併用すれば洗浄力をいっそう向上させることができる。
【００６２】
（６）水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還元剤
有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、またグリシングルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及び牛血清アルブミン、カゼイン等の蛋白質、更には蛋白質の加水分解、肉エキス、魚肉エキス等が挙げられる。
【００６３】
還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土壌金属塩等、ロンガリットＣ等が挙げられる。
【００６４】
（７）漂白剤
過炭酸塩、過硼酸塩、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸化水素等、漂白作用を有するものであればよい。
【００６５】
（８）蛍光染料
通常洗浄剤に用いられる蛍光染料。
【００６６】
（９）可溶化剤
液体洗剤の場合には次のような可溶化剤を用いることができる。
エタノール等の低級アルコール、ベンゼン、スルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコール等のポリオール類など。
【００６７】
（10）その他
上記以外に、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合することができる。
【００６８】
本発明の洗浄剤組成物の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。
【００６９】
また、本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６は、パンの小麦蛋白の加工、食肉の軟化、チーズの熟成等の食品加工や、皮なめしなどにも利用することができる。
【００７０】
本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を食品加工に用いるには、低温アルカリプロテアーゼＴ１６をそのまま、又は粉末状もしくは粒状の食品加工用酵素製剤として、使用することができる。かかる食品加工用酵素製剤には、低温アルカリプロテアーゼＴ１６のほか、澱粉類、蛋白質類、糖類、調味料、エステル類等を配合することができる。
【００７１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７２】
実施例１
土壌サンプル約１ｇを生理食塩水（１０ml）に懸濁し、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産判定プレートに塗抹し、２０℃で５〜７日間培養した。生育した集落の周囲に卵黄の分解によって生じた凹みを指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。得られた分離株の中から、低温プロテアーゼ生産性を調べ、スフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６を選抜した。
【００７３】
【００７４】
実施例２
実施例１で得られたスフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６株を下に示した液体培地で好気的に２０℃、２日間培養した。培養後、遠心分離（１２，０００×ｇ，２０分間）して得られた上清液を１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５；２mM CaCl2含有）で５℃、一昼夜透析した。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼイン基質として２０℃で測定したところ（５０mM炭酸緩衝液中，pH１０．０）、３〜４Ｕ／ｌ培養液に相当するプロテアーゼの生産が認められた。
【００７５】
【００７６】
実施例３
スフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６株を実施例２の液体培地に接種し、２０℃で４０時間培養した。培養後、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５；２mM CaCl2含有）に対し５℃で一昼夜透析した。この透析内液を凍結乾燥し、乾燥終了後、少量のイオン交換水で溶解し、同平衡緩衝液（pH７．５；２mM CaCl2含有）に対し５℃で一昼夜透析し濃縮液とした。この濃縮液を平衡化したセファクリルＳ−２００スーパーファイン（ファルマシア社製）のカラムでゲルクロマトグラフィーを行った。この結果、約２〜３倍まで精製された（回収率約９０％）。
【００７７】
実施例４ 洗浄試験
本発明の洗浄剤組成物を用い、以下の洗浄試験を行った。
（１）洗剤
表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製して用いた。
【００７８】
【表６】
【００７９】
（２）汚染布
ｉ）人工汚染布
スイス国立産業資材試験研究機関作製の市販人工汚染布ＥＭＰＡ１１６（血液／ミルク／カーボン汚れ）を実験に供した。
ii）天然襟布汚染布
木綿金布（＃２０２３布）をワイシャツの襟に縫い付け、青年男子に３日間着用させる。着用後２５℃、６５％ＲＨに１ケ月放置後、汚れの程度を三段階に分け、このうち最も汚れのひどいもののうち、中心点に対して汚れが対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁し、実験に供した。
【００８０】
（３）洗浄条件及び方法
ｉ）人工汚染布の洗浄
ＥＭＰＡ１１６を８×８cm程に裁断後、表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を０．０８３３％になるように４°ＤＨの水にて調整後、２０℃で１時間浸漬を行った。浸漬終了後、ターゴットメーター（上島製作所社製）を使用し、１リットル、２０℃、１００rpm、１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、色彩色差計ＣＲ−３００（ミノルタ社製）で明度を測定し、酵素未添加の洗浄系による明度を１００とした場合の比率を洗浄力指数として表した。
【００８１】
ii）天然汚染布のターゴットメーターによる洗浄
天然襟布汚染布を１１×１３cm程に裁断後、表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗浄剤を０．０８３３％になるように４°ＤＨの水にて調整後、２０℃、１時間浸漬を行った。浸漬終了後ターゴットメーター（上島製作所社製）を使用し、１リットル、２０℃、１００rpm、１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の襟布（１５組）を見比べ、汚れ落ちの程度を３名の熟練した判定者によりそれぞれ肉眼で判定を行った。判定方法は、汚れがほぼ完全に落ちている場合を５点、汚れがほとんど落ちていない場合を１点とし、１５枚の襟布の合計評価点を求め、酵素未添加の洗浄系による評価点を１００とした場合の比率を洗浄液指数として表した。
【００８２】
ii）天然汚染布の洗濯機による洗浄
９×３０cm程の天然汚染布を対称の位置で半裁し、９×１５cmの一対の汚染布の一方を基準洗剤である酵素無添加洗剤で洗浄し、片方を比較洗剤である本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗剤でそれぞれ洗浄した。
まず、天然汚染布片１５枚を５０×５０cmの綿布に縫い付け、６リットルの表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤０．４１７％の洗剤溶液に、この汚染布と綿製肌着を合わせて１kg入れ、２０℃で１時間浸漬後、東芝社製製洗濯機（銀河）に移し、全量を３０リットルとした後、強反転で１０分間洗浄した。濯ぎ、乾燥後、基準洗剤で洗った半裁布と本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗剤で洗った半裁布とを肉眼判定による一対比較で評価した。汚れの程度を表す１０段階にランクづけした標準汚れを基準にし、洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗剤の洗浄力を１００としたときの本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗剤の洗浄力の点数を表した。洗浄力指数の差は０．５以上で有意の差とみなすことができる。
【００８３】
（４）結果
以上の洗浄試験の結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】
【００８５】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは、作用最適温度を低温領域に有し、界面活性剤によってもほとんど阻害を受けず、また、酸性から高アルカリ溶液中で幅広く安定である。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として、低温下で有利に使用できるものである。また、低温条件下における、皮なめしや、パンの小麦蛋白の加工、食肉の軟化、チーズの熟成といった食品の改質にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】低温アルカリプロテアーゼＴ１６の温度−活性曲線を示す図である。
【図２】低温アルカリプロテアーゼＴ１６の温度安定性を示す図である。
【図３】低温アルカリプロテアーゼＴ１６のpH活性曲線を示す図である。
【図４】低温アルカリプロテアーゼＴ１６のpH安定性を示す図である。
【図５】低温アルカリプロテアーゼＴ１６の分子量の測定結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な低温アルカリプロテアーゼ、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種起源のプロテアーゼは、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去、消化助剤、消炎剤の成分等、多分野で盛んに利用されている。
【０００３】
その中で、最も大量に工業生産され、市場規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアーゼであり、アルカラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社製）、プロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）等が知られている。しかしながら、これらの酵素は最適温度が高温側にあるため、水道水の温度などの低温領域で衣料を洗浄する場合、その酵素特性が充分に発揮されているとはいいがたい。また、上述のプロテアーゼの応用分野のほとんどは、体温、室温、低温条件下であるため、高温至適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用いる高温処理工程は、省エネルギーの観点からも好ましいとはいえない。
【０００４】
一方、低温至適プロテアーゼは、皮なめし、パンの小麦蛋白の加工、あるいは反応系に熱をかけられないようなケース、すなわちチーズの熟成、肉の軟化等の食品の改質にも有効である。
【０００５】
プロテアーゼの洗剤等の商品への配合や工業的プロセス等での利用を考えた場合、室温から低温領域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵素の機能を充分発揮させる上で、必須の条件である。これまでに、寒冷地土壌、寒冷環境に棲息する生物、海水、冷蔵中のミルク等から分離された、プロテアーゼ生産菌が生産するプロテアーゼは必ずしも低温酵素ばかりではないが、数多くの報告例がある。
【０００６】
すなわち、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）No.５４８株（Agric. Biol. Chem.,３６巻，１１８５頁，１９７０年）、エシェリヒア フロインディ（Escherichia freundii）の一菌株（Eur. J. Biochem.,４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモナス マルトフィラ（Xanthomonas maltophila）０４７／０８株（FEMS Microbiol. Lett.,７９巻，２５７頁，１９９１）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｔ１６株（Appl. Environ. Microbiol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナス フルオレセンスＡＦＴ３６株（Biochim. Biophys. Acta,７１７巻，３７６頁，１９８２年）、シュードモナス エスピー１４５−２株（Microbios.,３６巻，７頁，１９８２年）、アエロモナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）９０１６／０２株（J. Appl. Bacteriol.,５３巻，２８９頁，１９８３年）、シュードモナス パウシモビリス（Pseudomonas paucinomobilis）０４９／０３株，１７８／１３株，１８９／０６株とバチルス エスピー（Bacillus sp.）１７２／１５株（J. Basic Microbiol.,３１巻，３７７頁，１９９１年）、ビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＡ１株（Antonie van Leeuwenhoek,４４巻，１５７頁，１９７８年）、シュードモナス フルオレセンスＮＣＤＯ２０８５株（J. Dairy Res.,５３巻，４５７頁，１９８６年）、シュードモナス フルオレセンスＯＭ２２８株とセラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）ＯＭ１１９２株（J. Dairy Res.,５３巻，９７頁，１９８６年）、シュードモナス フルオレセンスＧＲ８３株（Lebensm.-Wiss. u.-Technol.,２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペシロミセス マルクァンディ（Paecilomyces marquandii（ＷＯ８８／０３９４８）、キサントモナス エスピー（Xanthomonas sp.）Ｓ−１株（特開平５−２１１８６８号公報）等の低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼを生産する。
【０００７】
低温細菌が生産するプロテアーゼに関しては、Fairbainらが要領よく総説にまとめている（J. Dairy Res.,５３巻，１３９頁，１９８６年）。これらのプロテアーゼの一部には、低温領域に至適温度を有している酵素も存在しているので前述の用途に使えることが期待できる。
【０００８】
最近、Asgeissonらは、スケソウダラのエラスターゼについて（Biochim. Biophys. Acta,１１６４巻，９１頁，１９９３年）、Fellerらは、好冷細菌であるバチルス ＴＡ４１株の産生するプロテアーゼ（J. Biol. Chem.,２６９巻，１７４５３頁，１９９４年）と好冷細菌であるアルテロモナス ハロプランクティス（Alteromonas haloplanctis）Ａ２３株が産生するα−アミラーゼについて（J. Biol. Chem.,２６７巻，５２１７頁，１９９２年）、それぞれの触媒化学的性質から、これらの酵素が低温条件に適応している可能性を示唆した。また、Jackmanら（Appl. Environ. Microbiol.,４６巻，６頁，１９８３年）あるいはPatelら（Appl. Environ. Microbiol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）によると、好冷細菌であるシュードモナス フルオレセンスが生産するプロテアーゼは、中温細菌由来のプロテアーゼと比較して、活性化エネルギーが低い。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来、種々の低温プロテアーゼが知られているが、更に洗浄剤等に利用する上で、高性能の低温プロテアーゼの開発が望まれている。従って本発明は、低温条件下においても高い活性を保持し、かつ反応の最適pHがアルカリ側にある新規な低温アルカリプロテアーゼを提供すること、並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当該微生物を用いた低温アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは低温アルカリプロテアーゼを自然界から探索した結果、土壌サンプルから至適温度を２８〜３２℃に有し、低温条件下（例えば０℃以下）でも充分に作用するアルカリプロテアーゼを生産するスフィンゴモナス属細菌を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の酵素学的性質を有する低温アルカリプロテアーゼＴ１６、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤を提供するものである。
【００１２】
１）作用温度及び最適温度
少なくとも０〜６０℃で作用し、最適温度は２８〜３２℃である。１０℃で最適温度における活性の２０〜３０％、０℃で最適温度における活性の１０〜２０％の活性を保持する。
Ｃａ2+が存在すると最適温度は３８〜４２℃に移行する。
【００１３】
２）温度安定性
pH１０．０、１５分間の処理条件で約４８〜５２℃まで安定であり、Ｃａ2+が存在すると約６０℃まで安定である。
【００１４】
３）作用pH及び最適pH
少なくともpH５〜１２で作用し、最適pHは約９である。pH１２においても最大活性値の６０〜７０％の活性を保持する。
【００１５】
４）pH安定性
２０℃、１５分間の処理条件でpH５〜１２の範囲で安定である。
【００１６】
５）分子量
セファクリルＳ−２００を用いたゲルクロマトグラフィーによる推定分子量は、２６，０００±１，０００である。
【００１７】
６）基質特異性
カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンとケラチンに対しても作用する。
合成基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa、Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNa、Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNa、Z-Gly-Gly-Phe-pNa、Suc-Ala-Ala-Ala-pNa、Suc-Ala-Pro-Ala-pNa及びSuc-Ala-Ala-Phe-pNaに対して作用し、ｐ−ニトロアニリンを遊離する（Sucはスクシニル基を、Gltはグルタリル基を、Zはカルボベンゾイル基を、pNaはｐ−ニトロアニリノ基を示す）。
【００１８】
７）金属イオンの影響
Ｈｇ2+によって阻害される。
【００１９】
８）阻害剤
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及びキモスタチンによって阻害される。
【００２０】
９）界面活性剤の影響
ソジュウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）、ソジュウムα−オレフィンスルホン酸（ＡＯＳ）、ソジュウムアルカンスルホン酸（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、ソジュウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム（ＥＳ）等に対して極めて安定である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６は、例えばスフィンゴモナス エスピー（Sphingomonas sp.）ＫＳＭ−Ｔ１６を培養し、その培養物から採取することにより製造される。
【００２２】
本発明のスフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６の分類同定に用いた培地を以下に示す（重量％で示す）。
【００２３】
スフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６の分類学的性質を以下に示す。
【００２５】
（ａ）顕微鏡的観察結果
０．９〜１．０μm ×１．８〜４．４μm の桿菌であり、極鞭毛を有し、運動性がある。胞子の形成は認められない。
【００２６】
（ｂ）グラム染色性
陰性。
【００２７】
（ｃ）各種培地における生育状態
１．肉汁寒天平板培養（培地１）
生育状態は良い。集落の形状は円形、表面は円滑で光沢がある。集落の色調は、黄白色で半透明である。
２．肉汁寒天斜面培養（培地１）
生育する。
３．肉汁液体培養（培地２）
生育は良好で、菌膜の形成は認められない。
４．肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）
ゼラチンの液化が認められる。
５．リトマスミルク培地（培地４）
酸生成は認められない。
【００２８】
（ｄ）生理学的性質
１．硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）
いずれも陰性。
２．ＶＰテスト（培地６）
陰性。
３．インドールの生成（培地７）
陰性。
４．硫化水素の生成（培地８）
陰性。
５．澱粉の加水分解（培地９）
陰性。
６．クエン酸の利用（培地１０、１１）
陽性。
７．無機窒素源の利用（培地１２）
アンモニウム塩及び硝酸塩を利用しない。
８．色素の生成（培地１３、１４）
陰性。
９．ウレアーゼ（培地１５）
陰性。
10．オキシダーゼ（培地１６）
陽性。
11．カタラーゼ（培地１６）
陽性。
12．生育のpH範囲（培地１８）
生育のpH範囲は５〜１１である。
生育の至適pH範囲は８〜９にある。
13．生育の温度範囲（培地１、１９）
生育の温度範囲は５〜３５℃であり、最も生育が旺盛な温度は２０〜３０℃の間にある。
14．酸素に対する態度（培地２０）
通性嫌気性。
15．Ｏ−Ｆテスト（培地２１）
酸化型。
16．糖の利用性
Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース等を利用することができる。
17．食塩含有培地における生育（培地１中）
食塩濃度３％では生育するが、５％では生育できない。
18．カゼインの分解（培地２２）
陽性。
【００２９】
以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology）第８版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、スフィンゴモナス属の一種と判断された。そこで、本菌株をスフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６と命名し、ＦＥＲＭ Ｐ−１５４５７として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００３０】
上記の菌株を用いて、本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。
【００３１】
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、その例としては、炭素源として例えばグルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、マルトース、廃糖蜜や資化うしる有機酸、例えばクエン酸等が挙げられる。また窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミール、綿実油粕、カルチベータ、ゼスト等の有機窒素源が有効である。また、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
【００３２】
培養温度は、５〜３５℃、特に１５〜３０℃前後が好ましく、培養初発pHは５〜１１、特にpH８〜９が好ましい。この条件下において通常１〜３日間で培養は完了する。
【００３３】
かくして得られた培養液の中から目的の酵素である低温アルカリプロテアーゼＴ１６を採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行えば良い。即ち、培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。
【００３４】
本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６の酵素学的諸性質について以下に説明する。
【００３５】
〔酵素活性測定法〕
カゼイン１％を含む５０mMの各種緩衝液１mlを０．１mlの酵素溶液と混合し、２５℃、１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）２mlを加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem.,１９３巻，２６５頁，１９５１年）によって測定した。上記反応条件下において、１分間に１mmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００３６】
合成基質の加水分解反応を行う場合は、５５．５mM炭酸緩衝液（pH１０．０、０．９ml）に５０mMの各種合成基質溶液（ジメチルスルホキシドに溶解）０．０５mlを混合し、２５℃で５分間保温した後、０．０５mlの酵素液を加え２５℃で５分間反応させた。反応停止液（５％クエン酸）２mlを加えた後、分光光度計を用いて直ちに４２０nmにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１単位（Ｕ）は上記反応条件において１分間に１μmol のｐ−ニトロアニリンを遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００３７】
〔酵素学的性質〕
（１）基質特異性
５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に各種蛋白基質を０．１％又は１％になるように加えた後、酵素を適当量添加して２５℃で１５分間反応を行った。カゼインを基質とした場合の分解活性を１００として、それぞれの基質に対する分解活性を表１に示した。この結果から明らかなように、本酵素はカゼイン、ヘモグロビン及びケラチンに対して良好な分解活性を示した。
【００３８】
【表１】
ｐ−ニトロアニリンが結合した合成オリゴペプチド基質を用いて、これらの分解活性を調べた結果を表２に示した。供試したＮ−スクシニル化したAla-Ala-Pro-Phe、Ala-Ala-Pro-Val、Ala-Ala-Ala、Ala-Pro-Ala及びAla-Ala-Phe、Ｎ−グルタリル化したAla-Ala-Pro-Leu、Ｎ−カルボベンゾイル化したGly-Gly-Phe等の合成基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離が認められた。
【００４０】
【表２】
（２）作用温度及び最適温度
基質として０．９１％のカゼインを含む５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反応を行った。図１から明らかなように、本酵素の最適温度は２８〜３２℃であった。カルシウム（CaCl2として２mM）が存在すると、最適温度は約３８〜４２℃に移行し、カルシウム非存在下の最適温度に比べ、約１．５倍の活性促進が認められた。また本酵素は１０℃でも最適温度の活性の約２０〜３０％の活性を示し、０℃（氷水中）でも最適温度の活性の約１０〜２０％の活性を示し、低温条件下でも充分作用することがわかる。
【００４２】
（３）温度安定性
５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素を加え、各温度で１５分間加熱した後氷冷した。カゼインを基質として、２５℃で残存活性を求め、その結果を図２に示した。本酵素はＣａ2+非存在下で４８〜５２℃まで、２mM Ｃａ2+存在下で６０℃においても全く失活しなかった。一般に最適温度以上の高い温度に低温酵素をさらすと失活することが知られているが、本酵素の場合、最適温度以上で極めて安定な性質を示す特徴を有することがわかる。
【００４３】
（４）作用pH及び最適pH
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（５０mM）中に最終濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、２５℃で１５分間反応を行い、各pHでの活性を測定した。図３から明らかなように、本プロテアーゼの最適pHは９近傍に認められる。また、その作用pHは、少なくともpH５〜１２と幅広い。pH１２においても最大活性値の６０〜７０％の活性を保持する。
【００４４】
（５）pH安定性
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（２５mM，各pH）中に本酵素を加え、２０℃で１５分間放置し、カゼインを基質として残存活性を２５℃で測定した。図４に示したように、本酵素はpH５〜１２の広い範囲で安定であった。
【００４５】
（６）分子量
本酵素の分子量をセファクリルＳ−２００を用いたゲルクロマトグラフィーにより測定した。分子量マーカーには、低分子量用マーカーキット（バイオラッド社製）のアルブミン（分子量：６６，０００）、オブアルブミン（分子量：４３，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：２９，０００）、キモトリプシノーゲン（分子量：２５，０００）、リボヌクレアーゼ（分子量：１３，７００）及びチトクロームｃ（分子量：１２，４００）を用いた。図５から明らかなように、本プロテアーゼの見かけの推定分子量は２６，０００±１，０００である。
【００４６】
（７）金属イオンの影響
各種金属塩が１mMになるように添加した２０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素溶液を添加し、２０℃で２０分間放置した。その後、５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）で適当希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無添加系で同様に処理した酵素活性を１００％として処理群の残存活性を求めた。本酵素活性は、Ｈｇ2+によってのみ阻害された（表３）。
【００４７】
【表３】
（８）阻害剤の影響
１０mMリン酸緩衝液（pH７．０；２mM CaCl2含有）に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本酵素を添加し、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。表４から明らかなように、キレート剤であるＥＤＴＡとＥＧＴＡ及びセリン酵素阻害剤であるＰＭＳＦ及びキモスタチンによって阻害されることより、本酵素は金属依存性セリンプロテアーゼであると考えられる。
【００４９】
【表４】
（９）界面活性剤の影響
本酵素を、０．２％の界面活性剤を含有する５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０；２mM CaCl2含有）に加えて、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。表５から明らかなように、本酵素はＳＤＳ、ＡＯＳ、ＳＡＳ、α−ＳＦＥ、ＡＥ、ＬＡＳ、ＥＳ（それぞれ０．２％濃度）等の界面活性剤と長時間接触させてもほとんど失活せず、強力な界面活性剤耐性を有していることがわかる。
【００５１】
【表５】
このように、本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６は、過去の報告に無い新規酵素である。最近、南極の海水から分離されたバチルス属の一種が熱に不安定なズブチリシン型の酵素を生産することが報告されているが（Davailら、J. Biol. Chem.,２６９巻，１７４４８頁（１９９４年））最適温度が４０℃近傍にあり、その他の性質を較べても明らかに本発明の酵素とは異なっている。
【００５３】
本発明の洗浄剤組成物中への上記低温アルカリプロテアーゼＴ１６の配合量は、低温アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１kg当たり０．１〜５０００Ｕ、特に１〜５００Ｕが好ましい。
【００５４】
また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【００５５】
（１）界面活性剤
平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のオレフィンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルカンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０のα−スルホ脂肪酸メチルあるいはエステル塩、平均炭素数８〜２０の高級脂肪酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩等のアニオン性界面活性剤；平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、１〜２０モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付加物等の非イオン性界面活性剤；その他ベタイン型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性界面活性剤等の界面活性剤を単独で又は組合わせて用いることができる。
【００５６】
これらの界面活性剤は、洗浄剤組成物中５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物については２０〜５５％配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成物が漂白剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００５７】
（２）二価金属イオン捕捉剤
トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩等を任意に用いることができる。
【００５８】
この二価金属イオン捕捉剤は、０〜５０％、好ましくは５〜４０％配合される。また、リンを含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがより好ましい。
【００５９】
（３）アルカリ剤及び無機塩
ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミン等を任意に用いることができる。これらは０〜８０％配合される。
【００６０】
（４）再汚染防止剤
ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース等を任意に用いることができる。再汚染防止剤は０〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００６１】
（５）酵素
セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、低温アルカリプロテアーゼＴ１６以外のプロテアーゼ等の酵素を任意に用いることができる。低温アルカリプロテアーゼＴ１６はセルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ等の酵素と併用すれば洗浄力をいっそう向上させることができる。
【００６２】
（６）水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還元剤
有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、またグリシングルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及び牛血清アルブミン、カゼイン等の蛋白質、更には蛋白質の加水分解、肉エキス、魚肉エキス等が挙げられる。
【００６３】
還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土壌金属塩等、ロンガリットＣ等が挙げられる。
【００６４】
（７）漂白剤
過炭酸塩、過硼酸塩、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸化水素等、漂白作用を有するものであればよい。
【００６５】
（８）蛍光染料
通常洗浄剤に用いられる蛍光染料。
【００６６】
（９）可溶化剤
液体洗剤の場合には次のような可溶化剤を用いることができる。
エタノール等の低級アルコール、ベンゼン、スルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコール等のポリオール類など。
【００６７】
（10）その他
上記以外に、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合することができる。
【００６８】
本発明の洗浄剤組成物の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。
【００６９】
また、本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６は、パンの小麦蛋白の加工、食肉の軟化、チーズの熟成等の食品加工や、皮なめしなどにも利用することができる。
【００７０】
本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を食品加工に用いるには、低温アルカリプロテアーゼＴ１６をそのまま、又は粉末状もしくは粒状の食品加工用酵素製剤として、使用することができる。かかる食品加工用酵素製剤には、低温アルカリプロテアーゼＴ１６のほか、澱粉類、蛋白質類、糖類、調味料、エステル類等を配合することができる。
【００７１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７２】
実施例１
土壌サンプル約１ｇを生理食塩水（１０ml）に懸濁し、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産判定プレートに塗抹し、２０℃で５〜７日間培養した。生育した集落の周囲に卵黄の分解によって生じた凹みを指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。得られた分離株の中から、低温プロテアーゼ生産性を調べ、スフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６を選抜した。
【００７３】
実施例２
実施例１で得られたスフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６株を下に示した液体培地で好気的に２０℃、２日間培養した。培養後、遠心分離（１２，０００×ｇ，２０分間）して得られた上清液を１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５；２mM CaCl2含有）で５℃、一昼夜透析した。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼイン基質として２０℃で測定したところ（５０mM炭酸緩衝液中，pH１０．０）、３〜４Ｕ／ｌ培養液に相当するプロテアーゼの生産が認められた。
【００７５】
実施例３
スフィンゴモナス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１６株を実施例２の液体培地に接種し、２０℃で４０時間培養した。培養後、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５；２mM CaCl2含有）に対し５℃で一昼夜透析した。この透析内液を凍結乾燥し、乾燥終了後、少量のイオン交換水で溶解し、同平衡緩衝液（pH７．５；２mM CaCl2含有）に対し５℃で一昼夜透析し濃縮液とした。この濃縮液を平衡化したセファクリルＳ−２００スーパーファイン（ファルマシア社製）のカラムでゲルクロマトグラフィーを行った。この結果、約２〜３倍まで精製された（回収率約９０％）。
【００７７】
実施例４ 洗浄試験
本発明の洗浄剤組成物を用い、以下の洗浄試験を行った。
（１）洗剤
表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製して用いた。
【００７８】
【表６】
（２）汚染布
ｉ）人工汚染布
スイス国立産業資材試験研究機関作製の市販人工汚染布ＥＭＰＡ１１６（血液／ミルク／カーボン汚れ）を実験に供した。
ii）天然襟布汚染布
木綿金布（＃２０２３布）をワイシャツの襟に縫い付け、青年男子に３日間着用させる。着用後２５℃、６５％ＲＨに１ケ月放置後、汚れの程度を三段階に分け、このうち最も汚れのひどいもののうち、中心点に対して汚れが対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁し、実験に供した。
【００８０】
（３）洗浄条件及び方法
ｉ）人工汚染布の洗浄
ＥＭＰＡ１１６を８×８cm程に裁断後、表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を０．０８３３％になるように４°ＤＨの水にて調整後、２０℃で１時間浸漬を行った。浸漬終了後、ターゴットメーター（上島製作所社製）を使用し、１リットル、２０℃、１００rpm、１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、色彩色差計ＣＲ−３００（ミノルタ社製）で明度を測定し、酵素未添加の洗浄系による明度を１００とした場合の比率を洗浄力指数として表した。
【００８１】
ii）天然汚染布のターゴットメーターによる洗浄
天然襟布汚染布を１１×１３cm程に裁断後、表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗浄剤を０．０８３３％になるように４°ＤＨの水にて調整後、２０℃、１時間浸漬を行った。浸漬終了後ターゴットメーター（上島製作所社製）を使用し、１リットル、２０℃、１００rpm、１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の襟布（１５組）を見比べ、汚れ落ちの程度を３名の熟練した判定者によりそれぞれ肉眼で判定を行った。判定方法は、汚れがほぼ完全に落ちている場合を５点、汚れがほとんど落ちていない場合を１点とし、１５枚の襟布の合計評価点を求め、酵素未添加の洗浄系による評価点を１００とした場合の比率を洗浄液指数として表した。
【００８２】
ii）天然汚染布の洗濯機による洗浄
９×３０cm程の天然汚染布を対称の位置で半裁し、９×１５cmの一対の汚染布の一方を基準洗剤である酵素無添加洗剤で洗浄し、片方を比較洗剤である本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗剤でそれぞれ洗浄した。
まず、天然汚染布片１５枚を５０×５０cmの綿布に縫い付け、６リットルの表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤０．４１７％の洗剤溶液に、この汚染布と綿製肌着を合わせて１kg入れ、２０℃で１時間浸漬後、東芝社製製洗濯機（銀河）に移し、全量を３０リットルとした後、強反転で１０分間洗浄した。濯ぎ、乾燥後、基準洗剤で洗った半裁布と本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗剤で洗った半裁布とを肉眼判定による一対比較で評価した。汚れの程度を表す１０段階にランクづけした標準汚れを基準にし、洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗剤の洗浄力を１００としたときの本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗剤の洗浄力の点数を表した。洗浄力指数の差は０．５以上で有意の差とみなすことができる。
【００８３】
（４）結果
以上の洗浄試験の結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは、作用最適温度を低温領域に有し、界面活性剤によってもほとんど阻害を受けず、また、酸性から高アルカリ溶液中で幅広く安定である。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として、低温下で有利に使用できるものである。また、低温条件下における、皮なめしや、パンの小麦蛋白の加工、食肉の軟化、チーズの熟成といった食品の改質にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】低温アルカリプロテアーゼＴ１６の温度−活性曲線を示す図である。
【図２】低温アルカリプロテアーゼＴ１６の温度安定性を示す図である。
【図３】低温アルカリプロテアーゼＴ１６のpH活性曲線を示す図である。
【図４】低温アルカリプロテアーゼＴ１６のpH安定性を示す図である。
【図５】低温アルカリプロテアーゼＴ１６の分子量の測定結果を示す図である。
Claims (5)
- 次の酵素学的性質を有する低温アルカリプロテアーゼＴ１６。
１）作用温度及び最適温度
少なくとも０〜６０℃で作用し、最適温度は２８〜３２℃である。１０℃で最適温度における活性の２０〜３０％、０℃で最適温度における活性の１０〜２０％の活性を保持する。
Ｃａ2+が存在すると最適温度は３８〜４２℃に移行する。
２）温度安定性
pH１０．０、１５分間の処理条件で約４８〜５２℃まで安定であり、Ｃａ2+が存在すると約６０℃まで安定である。
３）作用pH及び最適pH
少なくともpH５〜１２で作用し、最適pHは約９である。pH１２においても最大活性値の６０〜７０％の活性を保持する。
４）pH安定性
２０℃、１５分間の処理条件でpH５〜１２の範囲で安定である。
５）分子量
セファクリルS−２００を用いたゲルクロマトグラフィーによる見かけの推定分子量は２６，０００±１，０００である。
６）基質特異性
カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンとケラチンに対しても作用する。
合成基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa、Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNa、Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNa、Z-Gly-Gly-Phe-pNa、Suc-Ala-Ala-Ala-pNa、Suc-Ala-Pro-Ala-pNa及びSuc-Ala-Ala-Phe-pNaに対して作用し、ｐ−ニトロアニリンを遊離する（Sucはスクシニル基を、Gltはグルタリル基を、Zはカルボベンゾイル基を、pNaはｐ−ニトロアニリノ基を示す）。
７）金属イオンの影響
Ｈｇ2+によって阻害される。
８）阻害剤
エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸、フェニルメタンスルフォニルフルオライド及びキモスタチンによって阻害される。
９）界面活性剤の影響
ソジュウムドデシル硫酸、ソジュウムα−オレフィンスルホン酸、ソジュウムアルカンスルホン酸、α−スルホ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソジュウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム等に対して極めて安定である。 - スフィンゴモナス エスピー（Sphingomonas sp.）ＫＳＭ−Ｔ１６と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１５４５７として寄託された請求項１記載の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を生産する微生物。
- 請求項２記載の微生物を培養し、その培養物から当該低温アルカリプロテアーゼを採取することを特徴とする請求項１記載の低温アルカリプロテアーゼＴ１６の製造法。
- 請求項１記載の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する洗浄剤組成物。
- 請求項１記載の低温アルカリプロテアーゼＴ１６を含有する食品加工用酵素製剤。
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