JP2509539B2

JP2509539B2 - 新規アルカリプロテア―ゼを産生する新規微生物

Info

Publication number: JP2509539B2
Application number: JP26848094A
Authority: JP
Inventors: 潤人見; 徹小林; 浩史園原; 進伊藤; 暉公彦岡本
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1994-11-01
Filing date: 1994-11-01
Publication date: 1996-06-19
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: JPH07163337A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリプロテア
ーゼを産生する微生物に関し、更に詳細には、バチルス
属に属し、日本の洗濯状況に適した洗浄用酵素として広
く用いることのできるアルカリプロテアーゼを産生する
微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】洗浄剤へのプロテアーゼの配合は、以前
より行われてきているが、当初洗浄剤へ配合されていた
プロテアーゼは、パパインや膵臓トリプシンといった中
性付近に最適反応pHを有しているものが用いられてい
た。

【０００３】しかし、周知の如く、洗浄剤のpHは高アル
カリ側にあり、洗剤用酵素もアルカリ側に最適反応pHを
有し、界面活性剤中において安定なものが望まれ、開発
されてきた。その結果、欧米諸国では１９６７年以降ア
ルカリプロテアーゼ配合洗剤の市場が急激に延び始めて
きた。日本においても１９７９年以降に本格的なプロテ
アーゼ配合洗剤が市場に出されるに至っている。

【０００４】現在、洗剤酵素として用いられている代表
的なアルカリプロテアーゼは、アルカラーゼ、サビナー
ゼ、エスペラーゼ（ノボインダストリー社製）、マキ
サターゼ（ギストプロカーデイス社製）等であり、こ
れらの酵素の最適反応温度は６０℃付近にあり欧米諸国
の洗濯様式にかなったものである。

【０００５】しかしながら、日本の洗濯様式は、室温付
近で洗浄を行うことが一般的であるため、より低い温度
領域において従来のプロテアーゼより活性の強いプロテ
アーゼの提供が求められており、これに適合するものと
してＡＰＩ−２１（昭和電工（株）社製）が開発される
に至っている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来より、ケラチン等
の不溶性蛋白を良く分解する能力のあるプロテアーゼが
洗浄に寄与することも知られており（皆川基：繊消誌
２６３２２（１９８５））、前記のプロテアーゼに要
求される諸性質、すなわち、アルカリ側でも作用するこ
と及び低温においても活性が高いことに加え、更にケラ
チン等の不溶性蛋白質に対する優れた作用を有するとい
う性質を兼ね備えたプロテアーゼを洗剤中に配合すれ
ば、優れた洗浄力と使い易さを有する洗剤組成物が得ら
れることが期待される。したがって、このような性質を
有するアルカリプロテアーゼの開発が求められていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、ケ
ラチンを分解する能力を有し、かつ最適反応温度の低い
（低温域においても活性の高い）アルカリプロテアーゼ
を得べく、プロテアーゼ生産菌について鋭意検討を行っ
た。

【０００８】そしてその結果、栃木県芳賀郡の土壌中か
ら得られた一群の微生物が上記条件を満足するアルカリ
プロテアーゼを産生することを見出し、本発明を完成し
た。

【０００９】本発明のアルカリプロテアーゼを産生する
微生物は、それぞれバチルス・エスピー（Bacillus s
p.）ＫＳＭ−２００１、バチルス・エスピーＫＳＭ−２
００２、バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３及びバ
チルス・エスピーＫＳＭ−２００５と名付けられたも
のであり、以下に示すような菌学的性質を有する。

【００１０】（Ａ）形態的性質

【００１１】（ａ）細胞の形及び大きさ

【００１２】

【表１】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：桿菌０．５〜１．０×１．０〜３．５μｍバチルス・エスピーＫＳＭ−２００２：桿菌０．５〜０．８×１．５〜３．０μｍバチルス・エスピーＫＳＭ−２００３：桿菌０．５〜０．８×０．８〜２．５μｍバチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：桿菌０．５〜０．８×１．５〜５．０μｍ

【００１３】（ｂ）多形性いずれの菌株も認められない。（ｃ）運動性いずれの菌株も周鞭毛を有し、運動性あり。

【００１４】（ｄ）胞子（大きさ、形、位置）

【００１５】

【表２】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：０．
４〜０．６×０．４〜０．６μｍ，卵円形又は円形，中
央準端バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２：０．４〜０．
８×０．４〜０．８μｍ，円形又は卵円形，中央準端バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３：０．５〜０．
８×０．８〜１．２μｍ，卵円形又は円柱形，中央準端バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：０．５〜０．
８×０．８〜１．２μｍ，卵円形，中央準端

【００１６】（ｅ）グラム染色いずれの菌株も陽性（ｆ）抗酸性いずれの菌株も陰性

【００１７】（ｇ）肉汁寒天平板上での発育形態

【００１８】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：
pH７．０にて生育し、円形、中凸状、円滑波状のコロニ
ーを形成する。コロニーの大きさは直径１．０〜４．０
mm、表面は円滑で露滴状の淡黄色を呈する。また半透明
であり脂状のコロニーである。

【００１９】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２：
円形、凸円状、円滑波状のコロニーを形成する。大きさ
は直径１．０〜５．０mm、表面は円滑で露滴状、淡黄色
〜乳白色を呈する。また半透明であり脂状のコロニーで
ある。

【００２０】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３：
pH７．０にて生育し、円形、台状、円滑波状のコロニー
を形成する。コロニーの表面は、円滑、露滴状で淡黄色
を呈する。また半透明であり脂状のコロニーである。

【００２１】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：
pH７．０にて生育し、円形、中凸状、円滑波状のコロニ
ーを形成する。コロニーの表面は、円滑、露滴状で淡黄
色を呈する。また半透明であり、脂状のコロニーであ
る。

【００２２】（ｈ）肉汁寒天斜面上での生育

【００２３】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：
pH７．０において帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透
明のコロニーを形成する。pH１０．０において拡帯状に
生育する。

【００２４】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２：
pH７．０において帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透
明のコロニーを形成する。pH１０．０において拡帯状に
生育する。

【００２５】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３：
pH７．０において帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透
明のコロニーを形成する。pH１０．０において拡帯状に
生育する。

【００２６】バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：
pH７．０，１０．０にて拡帯状に生育し、乳白色、半透
明のコロニーを形成する。

【００２７】（ｉ）肉汁液体培養いずれの菌もpH７．０にて僅かに生育するが菌膜は形成
しない。

【００２８】（ｊ）肉汁ゼラチン穿刺培養バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：pH７．０にお
いてゼラチン液化せず。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２，２００３，２
００５：pH７．０においていずれもゼラチンを液化す
る。

【００２９】（ｋ）リトマスミルクいずれの菌株も僅かに生育するがミルクの凝固、リトマ
スの色調変化は認められない。

【００３０】（Ｂ）生理的性質

【００３１】（ａ）以下の生理試験の結果は、いずれの
菌株も陰性であった。硝酸塩の還元、脱窒反応、ＭＲテ
スト、ＶＰテスト、インドールの生成、硫化水素の生
成、無機窒素源の利用（硝酸ナトリウム，硫酸アンモニ
ウム）、色素の生成、クエン酸の利用（Christensen, S
imonsの培地）、ウレアーゼ及びＯＦテスト。

【００３２】（ｂ）以下の生理試験の結果はいずれの菌
株も陽性であった。オキシダーゼ、カタラーゼ。（ｃ）デンプンの加水分解バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１，２００３：分
解する。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２，２０
０５：分解せず。

【００３３】（ｄ）生育pH範囲バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：pH８〜１０．
０で生育良好。但し、pH７．０〜１１．０の範囲内で生
育可能。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２：pH６．０〜１
１．０で生育する。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３：pH７．０〜１
１．０で生育する。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：pH７．０〜１
０．０で生育する。

【００３４】（ｆ）生育温度範囲バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：２０℃〜３７
℃で生育良好。但し、１０℃〜４０℃の範囲内で生育可
能。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２，２００３，２
００５：２０℃〜３０℃で生育良好。但し、１０℃〜３
７℃の範囲内で生育可能。

【００３５】（ｇ）酵素に対する態度いずれの菌株も、好気性条件下で生育可能。

【００３６】（ｈ）糖類からの酸及びガスの生成いずれの菌株も、以下の糖類から酸及びガスを生成しな
かった。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラ
クトース、マルトース、シュークロース、ラクトース、
トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
イノシトール、グリセロール、スターチ。

【００３７】（ｉ）糖類の資化性

【００３８】

【表３】

【００３９】（ｊ）塩化ナトリウムに対する耐性バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１，２００２，２
００３：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：７％塩化ナト
リウム存在下で生育する。以上のアルカリプロテアーゼ生産菌の菌学的性質を、
「バージエーズマニュアルオブディターミネイテ
ィブバクテリオロジー第８版（１９７４）」及び
「ザジーナスバチルス，アグリカルチャーハンドブ
ックＮｏ．４２７（１９７３）」の記載に順じ、他の菌
株と比較すると次の通りである。

【００４０】いずれの菌株も、グラム陽性の有胞子細菌
でバチルス属に属する細菌であることは明白であるが、
更に若干の相違点はあるものの、グルコース、マンニト
ール等を資化することはできるが酸産生が認められない
こと、硝酸還元能を持たないこと、クエン酸を利用しな
いこと並びに嫌気条件下では生育不可能であることか
ら、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）に近縁で
あると考えられる。

【００４１】しかし、バチルス・ブレビスは、５％の食
塩を含む培地では生育できない点が本発明の菌と異なっ
ている。また、バチルス・パスツーリ（Bacillus paste
urii）にも近縁であるが、嫌気条件下での生育、アルカ
リ培地においてＮＨ₄Ｃｌを要求しないこと、尿素を炭
酸アンモニウムに変換しない等の点において本発明の菌
とは異なっている。またバチルス・ブレビスとバチルス
・パスツーリの中間に位置するバチルス・フロイデンラ
イヒ（Bacillus freudenreichii）にも同様に類似はし
ているが、尿素の変換及びフェニルアラニンの脱アミノ
反応を行う点で本発明の菌とは異なっている。

【００４２】更に本発明菌株中、バチルス・エスピー
ＫＳＭ−２００１及び−２００３はいずれもデンプン加
水分解能を有しており、バチルス・アルカロフィラス
（Bacillus alcalophilus）の近縁とも判断されるが、
バチルス・アルカロフィラスはpH７で生育できないのに
対し、これら菌株はpH７以上で生育できる点において相
違する。

【００４３】以上の点から、本発明者は本発明のアルカ
リプロテアーゼ生産菌、すなわち、バチルス・エスピー
ＫＳＭ−２００１、ＫＳＭ−２００２、ＫＳＭ−２０
０３及びＫＳＭ−２００５はいずれも従来知られている
バチルス属の菌種とは異なるバチルス属の新菌種と判断
した。それら菌株を以下のように工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した。バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１（微工研菌寄第
９４４９号）バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２（微工研菌寄第
９４５０号）バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３（微工研菌寄第
９４５１号）バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５（微工研菌寄第
９４５３号）

【００４４】上記の各菌株を用いて新規なアルカリプロ
テアーゼを得るには、適当な培地に該菌株を接種し、常
法に従って培養すれば良い。培地中には資化し得る炭素
源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。

【００４５】この炭素源及び窒素源については特に制限
はないが、その例としては、窒素源としては、コーング
ルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、
肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミ
ール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カル
チベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、ア
ジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては、資
化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、
グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトー
ス、蔗糖、麦芽糖、乳糖、ソルビトール、マンニトー
ル、イノシトール、グリセリン、可溶性デンプンや廉価
な廃糖蜜、転化糖等、また資化し得る有機酸、例えば酢
酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ²⁺，Ｃ
ａ²⁺，Ｍｎ²⁺，Ｚｎ²⁺，Ｃｏ²⁺，Ｎａ ⁺，Ｋ⁺などの無
機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中
に適宜添加することもできる。

【００４６】斯くして得られた培養物中からの目的物質
であるプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採
取及び精製の手段に準じて行うことができる。

【００４７】すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液
から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、
溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、イソプロパノー
ル、アセトン等）によって蛋白を沈澱させたり、又、限
外濾過（例えばダイアフローメンブレンＹＣ、アミコン
社製）により濃縮させて本発明のプロテアーゼを得る。
塩析法では例えば、硫安（３０〜７０％飽和画分）、溶
媒沈澱では例えば、７５％エタノール中で酵素を沈澱さ
せた後、濾過或いは遠心分離、脱塩することによってこ
れを凍結乾燥粉末とすることも可能である。脱塩の方法
としては透析又はセファデックスＧ−２５等を用いる
ゲル濾過法等の一般的方法が用いられる。

【００４８】このようにして得られる酵素液は、そのま
ま使用することもできるが、更に公知の方法により精製
結晶化して用いることもできる。更に酵素を精製するに
は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス
又はＤＥＡＥ−セルロース等のイオン交換クロマトグラ
フィー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩
ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製す
ればよい。

【００４９】斯くして得られたアルカリプロテアーゼは
以下に示すような理化学的性質を有する。なお、以下に
おいて、バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１株の産
生するアルカリプロテアーゼをアルカリプロテアーゼＫ
−２００１と、ＫＳＭ−２００２株の産生するものをア
ルカリプロテアーゼＫ−２００２と、ＫＳＭ−２００３
株の産生するものをアルカリプロテアーゼＫ−２００３
と、ＫＳＭ−２００５株の産生するものをアルカリプロ
テアーゼＫ−２００５とそれぞれ称する。

【００５０】（ａ）基質特異性尿素変性ヘモグロビンに対する各酵素の活性を同一と
し、ケラチン、カゼイン、ミオグロビン及び牛血清アル
ブミンに対する活性を測定した。１００mMホウ酸緩衝液
（pH１０．５）に各基質を１％（尿素変性ヘモグロビン
は２．２％）加え、各酵素液１×１０^-4 Ａ．Ｕ．を添
加し、２５℃にて１０分間反応を行った（ケラチンを基
質とした場合は６０分間）。それぞれの基質に対するＡ
ＰＩ−２１の活性を１とした時の各酵素の相対活性を表
４に示す。

【００５１】

【表４】

【００５２】この結果から明らかなように、本発明微生
物産生のアルカリプロテアーゼは現在洗剤用酵素として
良く用いられている酵素ＡＰＩ−２１、アルカラーゼ、
サビナーゼ等と比べ、ケラチン分解性が優れている。

【００５３】（ｂ）反応最適pH 各緩衝液（１００mM）中に最終濃度２．２％の尿素変性
ヘモグロビンを添加し、１．０×１０^-4 Ａ．Ｕ．の各
酵素液を加え、２５℃１０分間反応を行った。最適pHの
値を１００％とし、各pHでの反応初速度を相対的に表わ
した。この結果を図１〜図４に示す。なお、使用した緩
衝液及びそのpH範囲は以下の通りである。

【００５４】

【表５】酢酸緩衝液 pH４．０−６．０リン酸緩衝液 pH６．０−８．０ホウ酸緩衝液 pH８．０−１０．０炭酸緩衝液 pH９−１１．０リン酸ナトリウム緩衝液 pH１０．５−１２．０

【００５５】これらの図から明らかな如く、アルカリプ
ロテアーゼＫ−２００１及びＫ−２００２の最適pHは
９．５〜１０．５、アルカリプロテアーゼＫ−２００３
の最適pHは８．５〜１１．５、アルカリプロテアーゼＫ
−２００５の最適pHは８．５〜１０．０であった。

【００５６】（ｃ）pH安定性上記（ｂ）で用いたのと同じ各緩衝液（１００mM）中に
２×１０^-4 Ａ．Ｕ．の酵素液を加え、５℃で２４時間
放置した。この処理液を０．５Ｍホウ酸緩衝液で５倍に
希釈後、尿素変性ヘモグロビンを基質とし、pH１０．５
で反応を行い、残存活性を測定した。処理前の酵素活性
を１００％とし、各pH領域にて処理したサンプルの活性
を相対的に表わした。この結果を図５〜図８に示す。

【００５７】これらの図から明らかな如く、アルカリプ
ロテアーゼＫ−２００１及びＫ−２００２はpH４〜１２
の範囲で安定であり、また、アルカリプロテアーゼＫ−
２００３及びＫ−２００５はpH５〜１２の範囲で安定で
あった。

【００５８】（ｄ）反応最適温度各温度下、１×１０^-4 Ａ．Ｕ．の各酵素液を用い、尿
素変性ヘモグロビンを基質としてpH１０．５で反応を行
った。結果を図９〜図１２に示す。

【００５９】これらの図から明らかな如く、アルカリプ
ロテアーゼＫ−２００１及びＫ−２００５は４０℃に最
適温度を、アルカリプロテアーゼＫ−２００２及びＫ−
２００３は３５〜４０℃に最適温度をそれぞれ有し、し
かもいずれの酵素の場合にも２０〜３０℃の低温域にお
いて最高活性時の５０％以上の活性を示した。

【００６０】（ｅ）界面活性剤及びビルダーの影響約２×１０^-4 Ａ．Ｕ．の各アルカリプロテアーゼを所
定濃度の各種界面活性剤又はビルダーを溶解した５０mM
ホウ酸緩衝液（pH８．０）に加え、２５℃で１時間放置
した。その後、同緩衝液にて５倍に希釈後、アンソン−
ヘモグロビン法により残存活性を測定した。界面活性剤
及びビルダー無添加で同様に処理した酵素活性を１００
％とし、残存活性を相対値で表わした。この結果を表６
に示す。

【００６１】

【表６】

【００６２】この結果から明らかなように、アルカリプ
ロテアーゼＫ−２００１及びＫ−２００２は試験したす
べての界面活性剤及びビルダーに対し安定であった。ま
た、アルカリプロテアーゼＫ−２００３はＬＡＳ、ＳＡ
Ｓ及びＥＤＴＡに対してはやや不安定であるが、その他
の界面活性剤及びビルダーに対して非常に安定であっ
た。更に、アルカリプロテアーゼＫ−２００５は前者の
アルカリプロテアーゼよりはやや劣るものの比較的安定
であると言える。

【００６３】（ｆ）酵素阻害剤の影響一般的な酵素阻害剤、すなわち、パラクロロマーキュリ
ーベンゾエイト（ＰＣＭＢ）、ジイソプロピルフルオリ
デート（ＤＦＰ）、アンチパイン、ロイペプチン、ペプ
スタチン、キモスタチンについて、これらが本発明のア
ルカリプロテアーゼに対し与える影響を調べた。各阻害
剤は、所定濃度となるように１００mMホウ酸緩衝液（pH
８．０）（ＤＦＰの場合のみ１００mMトリス塩酸緩衝液
pH７．０）へ加え、４×１０^-4 Ａ．Ｕ．のアルカリプ
ロテアーゼを添加後２５℃１時間処理を行った。その後
同緩衝液にて１０倍に希釈後、アンソン−ヘモグロビン
法により残存活性を測定した。残存活性は、阻害剤無添
加で同様に処理した酵素活性に対する相対値で表わし
た。この結果を表７に示す。

【００６４】

【表７】

【００６５】いずれの酵素もＤＦＰ及びキモスタチンで
阻害されることからセリンプロテアーゼであることが示
唆されるが、その阻害率は従来のセリンプロテアーゼに
比較し、非常に小さく、本発明微生物産生のアルカリプ
ロテアーゼの特徴の１つとしてこれらの阻害剤に対し強
い抵抗性を有していることが挙げられる。

【００６６】（ｇ）金属イオンの影響金属イオンの酵素活性に及ぼす影響について調べた結果
を表８に示した。各金属塩を５mMとなるように０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液（pH８．０）に加え、各アルカリプロテア
ーゼ４×１０^-4 Ａ．Ｕ．添加後２５℃１０分間処理を
行った。その後同緩衝液にて１０倍に希釈してアンソン
−ヘモグロビン法にて酵素活性を測定した。金属塩未添
加の系を対照として用い、その活性を１００とした時の
相対値で各金属イオンの影響を表わした。

【００６７】

【表８】

【００６８】この結果、いずれのプロテアーゼもＣｕ²⁺
によっては強く阻害されたが、他の金属イオンに対して
は非常に安定であり、何ら影響を受けなかった。

【００６９】（ｈ）分子量トヨパールＨＷ−５５を用いるゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより、各アルカリプロテアーゼの分子量を測定し
た。このゲル濾過において、溶出液としては、０．１Ｍ
塩化カリウム、５mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス
−塩酸緩衝液（pH７．０）を用い、また標準蛋白として
牛血清アルブミン（ＭＷ：６８，０００）、卵白アルブ
ミン（ＭＷ：４５，０００）、キモトリプシノーゲンＡ
（ＭＷ：２５，０００）、及びリボヌクレアーゼＡ（Ｍ
Ｗ：１３，７００）を用いた。この結果を表９に示す。

【００７０】

【表９】

【００７１】

【発明の効果】本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌の
産生するアルカリプロテアーゼは、叙上の如く、アルカ
リ側において高い活性を示し、しかもこの活性は低温域
においても最高活性の５０％以上の活性を有するもので
ある。更に、このアルカリプロテアーゼは、ケラチン等
において優れた分解力を有し、かつ、洗剤組成物中に配
合されたり、洗濯中に混入する各種成分、例えば界面活
性剤、ビルダー成分、金属イオン等の存在下においても
ほとんどその作用の低下は認められない。従って、本発
明の微生物産生のプロテアーゼは、各々の洗剤に配合す
るプロテアーゼとして極めて優れたものである。

【００７２】

【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説
明する。

【００７３】実施例１プロテアーゼ産生菌株の分離、採取：（ｉ）栃木県芳賀郡で採取した土壌サンプルの約１ｇを
滅菌生理食塩水１０mlに懸濁し、８０℃にて２０分間放
置し熱処理した。熱処理上清液０．１mlをケラチンハロ
ー寒天培地へ接種し、３０℃で４８時間静置培養した。
用いたケラチンハロー寒天培地の組成は以下に示す通り
である。

【００７４】

【表１０】グルコース１％酵母エキス０．２％羊毛ケラチン１％カルボキシメチルセルロース１％リン酸第一カリウム０．１％硫酸マグネシウム・７水塩０．０２％寒天１．５％

【００７５】（ii）上記培地組成物に、別滅菌を施した
１０％炭酸ナトリウムを０．０１％、０．１％、１％添
加し、最終pHを７．０、９．０、１０．５に調整後、平
板培地を作製した。

【００７６】培養後、生育したコロニーの周囲にハロー
を生じたものを選抜し、同培地で２〜３回純化し、均一
のプロテアーゼ生産菌を得た。土壌サンプル３００点よ
り各pHの平板培養より得られた菌株は、１２０菌株であ
った。

【００７７】（iii）上記（ii）で得たこれらの菌株を
以下に示すケラチン液体培地へ接種し、３０℃で好気的
に４８時間振盪培養を行った。

【００７８】

【表１１】グルコース０．２％ケラチン（羊毛）０．５％酵母エキス０．０５％リン酸第一カリウム０．１％硫酸マグネシウム（７水塩）０．０２％炭酸ナトリウム（別滅菌）０．４％ pH ９．０

【００７９】培養中又は終了後、ケラチンの分解力が顕
著な菌株を選択し、アルカリプロテアーゼ生産菌を得
た。斯くして得られた４菌株をそれぞれバチルス・エス
ピーＫＳＭ−２００１、２００２、２００３及び２０
０５と命名した。

【００８０】参考例１実施例１により得られたバチルス・エスピーＫＳＭ−
２００１（ＦＥＲＭ．Ｐ−９４４９）、ＫＳＭ−２００
２（ＦＥＲＭ．Ｐ−９４５０）、ＫＳＭ−２００３（Ｆ
ＥＲＭ．Ｐ−９４５１）及びＫＳＭ−２００５（ＦＥＲ
Ｍ．Ｐ−９４５３）のそれぞれを以下の液体培地に接種
し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を行い、アルカ
リプロテアーゼを生産させた。

【００８１】

【表１２】グルコース２％魚肉エキス１％大豆粉１％硫酸マグネシウム０．０２％リン酸第一カリウム０．１％ pH １０．０

【００８２】培養終了後、得られた培養物を遠心分離
（３，０００rpm；１０分間）して菌を除去し、得られ
た培養上清を酵素液としてそのプロテアーゼ活性を測定
した。アルカリプロテアーゼの活性は次の２通りの方法
によって測定した。

【００８３】（ａ）尿素変性ヘモグロビンを基質とした
アンソン−ヘモグロビン法：アンソンの方法に従い（An
son, M. L ：J. Ger. Physiol, 22 79(1938) ）尿素を
用いて牛血清ヘモグロビンを変性させ、苛性ソーダにて
pH１０．５とした。この基質溶液（ヘモグロビンとして
２．２％）を０．５mlに酵素液０．１ml（１．０×１０
^-5〜１．０×１０^-3 Ａ．Ｕ．）を添加し２５℃にて１
０分間反応を行い４．９％トリクロル酢酸１．０mlを加
え反応を停止した。反応終了後、遠心分離（３，０００
rpm；１０分間）を行いその上清液中に含まれる蛋白分
解物をフォーリン・ローリー法（O.H.Lowry ら、J. Bio
l. Chem. 193265(1951) ）によって定量した。１Ａ．
Ｕ．は、上記反応条件下において１分間に１mmole のチ
ロシンを遊離する酵素量とした。

【００８４】（ｂ）ケラチンを基質とした方法：０．５
％羊毛ケラチンを２０mM炭酸緩衝液中に懸濁させた溶液
０．５mlに、酵素液０．１mlを添加し、２５℃２時間反
応を行い、４．９％トリクロル酢酸水溶液１．０mlを加
え反応を停止した。以下の操作は（ａ）と同一とし、蛋
白分解物量を測定した。なお、１ＫＵは、上記反応条件
下において１分間に１mmole のチロシンを遊離する酵素
量とした。

【００８５】参考例で得られた酵素液のプロテアーゼ活
性は、表１３の通りである。

【００８６】

【表１３】

【００８７】参考例２参考例１において得られた各酵素液に７５％飽和になる
ように硫安を添加した。生じた沈殿を遠心分離（８，０
００rpm ；１５分間）し、イオン交換水に対し透析後そ
の酵素学的性質（理化学的性質）を調べたところ、前記
の通りであった。

【００８８】参考例３洗浄試験：ＪＩＳＫ３３７１に準じ、洗浄試験を行
った。洗浄系は、市販の無リン重質洗剤（酵素未添加の
もの）を０．１３３％になるように４°ＤＨの水にて調
製後、アルカリプロテアーゼＫ−２００１、Ｋ−２００
２及びＫ−２００３の各プロテアーゼ溶液を０．０１Ａ
Ｕ／ｌとなるようにそれぞれ添加した。試験布は、ヒト
皮膚上の汚れが付着しやすいワイシャツの衿部分（３日
間着用）とし、一対比較ができるように１１×１３cm程
に裁断後、酵素添加、あるいは酵素未添加の洗浄系にて
３０℃１時間浸漬を行った。浸漬終了後ターゴットメー
ター（上島製作所社製）を使用し、２０℃、１２０rpm
で１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の衿布
（１５組）を見比べ汚れ落ちの程度を３名の熟練した判
定者によりそれぞれ肉眼で判定を行った。判定方法は、
汚れがほぼ完全におちている場合を５点、汚れがほとん
どおちていない場合を１点とし、１５枚の衿布の合計評
価点を求め、酵素未添加の洗浄系による評価点を１００
とした場合の比率を洗浄力指数として表わした。この結
果を表１４に示す。

【００８９】

【表１４】

【００９０】参考例４アルカリプロテアーゼＫ−２００２及びＫ−２００５の
プロテアーゼ液について、酵素濃度を０．０１６ＡＵ／
ｌとし、１０℃で２時間浸漬を行う以外は参考例３と同
様にして低温での洗浄試験を行った。この結果を表１５
に示す。

【００９１】

【表１５】

【００９２】以上の結果により、本発明の微生物が産生
するアルカリプロテアーゼは、通常の洗濯温度における
洗浄力はもとより、より低温においてもその作用を充分
に発揮しうる優れた洗浄剤用の酵素であることが明らか
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００１の活性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図２】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００２の活性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図３】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００３の活性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図４】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００５の活性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図５】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００１の安定性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図６】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００２の安定性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図７】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００３の安定性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図８】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００５の安定性に及ぼすpHの影響を示す図面である。

【図９】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ−
２００１の活性に及ぼす温度の影響を示す図面である。

【図１０】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ
−２００２の活性に及ぼす温度の影響を示す図面であ
る。

【図１１】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ
−２００３の活性に及ぼす温度の影響を示す図面であ
る。

【図１２】本発明微生物産生のアルカリプロテアーゼＫ
−２００５の活性に及ぼす温度の影響を示す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者伊藤進栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (72)発明者岡本暉公彦埼玉県越谷市七左町１−229−８

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）アルカリプロテアーゼＫ−２００
１を産生する能力を有し、微工研菌寄第９４４９号とし
て寄託されたバチルスエスピー（Bacillussp.）ＫＳ
Ｍ−２００１、（２）アルカリプロテアーゼＫ−２００
２を産生する能力を有し、微工研菌寄第９４５０号とし
て寄託されたバチルスエスピー（Bacillus sp.）ＫＳ
Ｍ−２００２、（３）アルカリプロテアーゼＫ−２００
３を産生する能力を有し、微工研菌寄第９４５１号とし
て寄託されたバチルスエスピー（Bacillus sp.）ＫＳ
Ｍ−２００３、及び（４）アルカリプロテアーゼＫ−２
００５を産生する能力を有し、微工研菌寄第９４５３号
として寄託されたバチルスエスピー（Bacillus sp.）
ＫＳＭ−２００５からなる群より選ばれる微生物。