JP3000309B2 - カルボキシメチルセルラーゼ及びこれを生産する微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なカルボキシメチル
セルラーゼに関し、更に詳細には作用pH範囲及び作用温
度範囲が広く、特にpH安定性が極めて優れた新規酵素カ
ルボキシメチルセルラーゼ５８１２及びこれを生産する
微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルラーゼはセルロースとその類似多糖
をグルコース、又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖
まで分解する酵素反応を触媒する複雑な酵素系から成
り、その作用機構により、Ｃ₁ 酵素、Ｃ_x 酵素とβ−グ
ルコシダーゼ、或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エン
ド−β−グルカナーゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ば
れる酵素の総称と理解されている。長年、セルラーゼ研
究の歴史は専らバイオマス資源の有効利用を図る目的か
ら進められてきており、例えばトリコデルマ属、アスペ
ルギルス属、アクレモニウム属、フミコーラ属などのカ
ビ類にその供給源を求めてきた。然るに、カビを含めて
微生物起源のセルラーゼには、その構成酵素群の作用特
異性や物理化学的諸性質等の多様性が有り、その実態は
未だ明確化されたとは言い難い。

【０００３】上記セルラーゼのうち、カルボキシメチル
セルロースに対する作用、すなわちエンド型水解作用が
特に高いものをカルボキシメチルセルラーゼと称する
が、最近、カルボキシメチルセルラーゼを含むセルラー
ゼの新規な産業用途として、例えば、衣料用洗浄剤組成
物の添加成分としての用途が開発されている。しかしな
がら、自然界において微生物の生産するセルラーゼは、
上述の微生物起源のものをみるかぎり、大部分が酸性pH
で至適活性を有し、かつアルカリpHにおいて失活する、
いわゆる酸性セルラーゼ（至適作用pHが４〜６）であっ
て、衣料用洗浄剤組成物の要件である、アルカリ側で最
大活性を有し、かつ耐性を有する、いわゆるアルカリセ
ルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は極めて少
ないのが実情である。

【０００４】即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物として使
用し得るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラー
ゼの生産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の
培養によりセルラーゼＡを採取する方法（特開昭５０−
２８５１５号公報）、セルロモナス属に属する好アルカ
リ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生
産する方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好ア
ルカリ性バチルスNo.１１３９を培養してカルボキシメ
チルセルラーゼを生産する方法（Ｆ．Ｆｕｋｕｍｏｒ
ｉ，Ｔ．Ｋｕｄｏ ａｎｄ Ｋ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，３３３９
（１９８５））及びストレプトマイセス属の一種を用い
てアルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−１
９４８３号公報）が報告されているに過ぎず、しかもい
ずれも工業的発酵生産に適うものでは無かった。

【０００５】一方、近年、好アルカリ性微生物の一種で
あるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｋ
ＳＭ−６３５）（微工研菌寄第８８７２号）が、衣料用
洗浄剤組成物として適したカルボキシメチルセルラーゼ
を効率良く生産すること、及び更に培養条件を選択する
ことにより、より高収率で、カルボキシメチルセルラー
ゼが得られ、工業的発酵生産が可能となることが報告さ
れた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記バ
チルス エスピー ＫＳＭ−６３５由来のカルボキシメ
チルセルラーゼは、作用至適温度が４０℃付近であり、
低温洗浄に適うものであるが、一方では、より高温下で
の洗浄剤として使用できる酵素が望まれている。また、
一般に、pHが高い程洗剤の洗浄力が向上するので、より
高pHにおいて安定性の高いカルボキシメチルセルラーゼ
が求められている。

【０００７】従って本発明は、高温においても作用し、
作用pH範囲が広く、特に高pHにおける安定性の良好なカ
ルボキシメチルセルラーゼを得ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、カルボキシ
メチルセルラーゼを生産する微生物を自然界に求め、鋭
意探索を続けて来たが、今般、フィリピン国 ラグナ州
ロスバニオスの土壌より採取したバチルス属に属する
微生物が、衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な
新規なカルボキシメチルセルラーゼ５８１２を生産する
こと及び該カルボキシメチルセルラーゼ５８１２が従来
のカルボキシメチルセルラーゼよりも作用pH範囲が広
く、また熱安定性も優れており、特に高アルカリpHにお
ける安定性が良好であることを見出し、本発明を完成し
た。

【０００９】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５８
１２を生産する微生物は次のような菌学的性状を示す。
尚、該酵素生産菌の分離・培養に用いた培地は次のＡ〜
Ｃである。また、Ｎａ₂ＣＯ₃は他の成分と別滅菌して加
えた。 培地Ａ（ＰＣＭＣ培地）：ポリペプトン（日本製薬
（株）製），２０ｇ；カルボキシメチルセルロース（Ｃ
ＭＣ，山陽国策パルプ（株）製），１０ｇ；酵母エキス
（ディフコ ラボラトリーズ社製），１ｇ；ＫＨ₂ＰＯ₄
（和光純薬（株）製），１ｇ；ＮａＣｌ（メルク社
製），５ｇ；Ｎａ₂ＣＯ₃ （無水、岩井化学（株）
製），５ｇ；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（和光純薬（株）
製），０．２ｇ；トリパンブルー色素（メルク社製），
０．０７５ｇ；寒天（ディフコ ラボラトリーズ社
製），１５ｇ（脱イオン水で１．０ｌとする） 培地Ｂ：培地Ａからトリパンブルー色素を除いたもの。 培地Ｃ（ＣＭＣ−ペプトン培地）：ＣＭＣ，１０ｇ；ポ
リペプトン，２０ｇ；酵母エキス，０．５ｇ；ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄，１ｇ；ＮａＣｌ，５ｇ；Ｎａ₂ＣＯ₃，５ｇ（脱イ
オン水で１．０ｌとする）

【００１０】（菌学的性質） １．顕微鏡的観察結果：菌体の大きさは、０．６〜０．
８μｍ×１．５〜３．３μｍの桿菌であり、菌体の中央
又は末端近くに楕円形の芽胞（０．７〜１．０μｍ×
１．０〜１．６μｍ）を作る。 ２．運動性；陽性、周鞭毛を有する。 ３．グラム染色；陽性。

【００１１】４．各種培地における生育状態： （１）栄養寒天培地（ニュートリエント寒天平板培地） 集落の形状は円形で、その表面は粗く、周縁は波状を呈
する。また、集落の色調は白色乃至極めて淡い黄色であ
る。 （２）栄養液体培地（ニュートリエント・ブロス培地） 生育する。 （３）ニュートリエント・ブロス中におけるＮａＣｌ耐
性 ５％ＮａＣｌで生育し、７％ＮａＣｌ及び１０％ＮａＣ
ｌで生育しない。 （４）ゼラチン培地 ゼラチンを液化する。 （５）リトマスミルク培地 培養液の上層を弱く脱色する。

【００１２】５．生理学的性質： （１）硝酸の亜硝酸への還元 陰性。 （２）脱窒作用 陰性。 （３）ＭＲ試験 陰性。 （４）Ｖ−Ｐ試験 陽性。 （５）インドールの生成 陰性。 （６）硫化水素の生成 陽性。 （７）デンプンの加水分解 陰性。 （８）カゼインの加水分解 陽性。 （９）クエン酸の利用性 シモンズ（Ｓｉｍｏｎｓ）クエン酸寒天平板培地；陽
性。 クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）クエン酸寒
天平板培地；陽性。 （１０）無機窒素源の利用 陰性。 （１１）色素の生成 キング（Ｋｉｎｇ）Ａ培地；陰性。 キング（Ｋｉｎｇ）Ｂ培地；陰性。 馬鈴薯デキストロース寒天栄研；陰性。 マンニット・食塩寒天培地；陰性。 （１２）ウレアーゼ 陰性。 （１３）オキシダーゼ 陽性。 （１４）カタラーゼ 陽性。 （１５）生育の範囲 生育温度；１５〜４５℃ 生育至適温度；２５〜＜４５℃ 生育pH；４．７〜１０ 生育至適pH；６．０〜９．５ （１６）酸素に対する態度 好気的かつ嫌気的に増殖する。 （１７）Ｏ−Ｆ試験 発酵（Ｆ）。 （１８）プロピオン酸の利用 陽性。 （１９）チロシン分解性 陰性。 （２０）フェニルアラニンの脱アミノ化 陰性。 （２１）糖からの酸生成 陽性；Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−グルコース、マンニトール 陰性；Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、麦芽糖、蔗
糖、トレハロース、イノシトール、グリセロール、Ｄ−
ガラクトース、ラクトース、ソルビトール、デキストリ
ン、ラフィノース、澱粉 （２２）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量 ４２．６モル％。

【００１３】以上の菌学的性質について、バージーズ・
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Ｂｅｒｇｅｙ′ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻を
参照した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属の一種であると判定された。

【００１４】そして、本菌株の菌学的性質は、公知のバ
チルスのいずれとも一致しないのでこれを新規菌株と判
断してバチルス エスピー ＰＫＭ−５８１２と命名
し、微工研菌寄第１２５７３号として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した。

【００１５】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５８
１２を収得するには、上記バチルスエスピー ＰＫＭ−
５８１２若しくはその変異株を培地中で培養し、得られ
た培養物を通常の酵素精製法を用いて、分離、精製すれ
ばよい。

【００１６】カルボキシメチルセルラーゼ５８１２の発
酵生産にあたっては、適当な培地を加熱等により殺菌
後、バチルス エスピー ＰＫＭ−５８１２（微工研菌
寄第１２５７３号）を接種し、１５℃〜４５℃、好まし
くは２５℃〜４３℃で、１〜４日振盪又は通気攪拌培養
すれば良い。pHは中性〜pH １０に調整すると良い結果
が得られる。時として発泡するが、適当な消泡剤を適宜
添加することによって解消される。

【００１７】カルボキシメチルセルラーゼ５８１２生産
には、資化し得る窒素源と炭素源を適宜組み合わせて培
養培地に含有させれば良く、特に両栄養源を限定するも
のではない。例えば、窒素源としては、コーングルテン
ミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、
酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキ
ス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロ
ン、ゼスト、アジックスなどの有機窒素源が挙げられ
る。又、炭素源としては、籾殻、麩、濾紙、一般紙類、
おが屑などの植物繊維質、廃糖密、転化糖、ＣＭＣ、ア
ビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチンに加え、資
化し得る炭素源、例えば、リボース、アラビノース、キ
シロース、グルコース、マンノース、フラクトース、麦
芽糖、蔗糖、マンニトール、イノシトール、グリセロー
ルや資化し得る有機酸、例えば、酢酸、クエン酸などが
挙げられる。すなわち、これらの窒素源と炭素源を適宜
組み合わせたいかなる培地を使用しても良く、上述の栄
養源を特に限定するものではない。その他、リン酸、Ｍ
ｇ²⁺，Ｃａ²⁺，Ｍｎ²⁺，Ｚｎ²⁺，Ｃｏ²⁺，Ｎａ⁺，Ｋ⁺な
どの無機塩や、必要であれば、無機、有機態微量栄養源
を含有する培地を適宜選択して使用される。

【００１８】斯くして得られた培養物中から、カルボキ
シメチルセルラーゼ５８１２を得るには、一般の採取及
び精製の手段に準じて行うことができる。すなわち、培
養物を遠心分離、又は濾過等によって菌体を分離し、そ
の菌体及び培養上清から通常の分離手段、例えば、塩析
法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノー
ル、イソプロパノール等）によってタン白を沈澱させた
り、又、限外濾過により濃縮しカルボキシメチルセルラ
ーゼ５８１２の粗酵素液を得る。塩析法では例えば、硫
安（３０〜１００％飽和画分）、溶媒沈澱では例えば、
７５％エタノール中で酵素を沈澱させた後、濾過あるい
は遠心分離、脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末
とすることも可能である。脱塩の方法としては透析又は
セファデックスやバイオゲル等を用いるゲル濾過法等の
一般的方法が用いられる。

【００１９】この粗酵素液はそのまま使用することもで
きるが必要に応じて公知の方法、例えばヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス
又はＤＥＡＥ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラ
フィー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩
ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて精製し、精
製酵素として使用することも可能である。

【００２０】斯くして得られたカルボキシメチルセルラ
ーゼ５８１２（粗酵素）は、以下に示すような性質を有
する。尚、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行っ
た。

【００２１】（ａ）カルボキシメチルセルラーゼ活性：
活性測定は、ＤＮＳ法（Ｊ．Ｒ．Ｓｕｍｍｅｒ ａｎｄ
Ｇ．Ｆ．Ｓｏｍｅｒｓ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９４４）に従って行
った。すなわち、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH ９．
０）０．１ Ｍ中で、１．１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ（Ａ０
１ＭＣ）の基質溶液０．９mlに適宜希釈した酵素溶液
０．１mlを加え、通常４０℃で２０分間反応させ、次い
で０．０５％（ｗ／ｖ）の３，５−ジニトロサリチル酸
（和光純薬（株）製）１ mlを添加し、すぐに沸騰水浴
に５分間入れ、次に氷水浴で冷却した。これに脱イオン
水４ mlを更に添加し、その後５３５nmにおける吸光度
で比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に
１μmoleのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位とした。

【００２２】（ｂ）セルロース基質に対する加水分解活
性：水酸化ナトリウム膨潤セルロース及びリン酸膨潤セ
ルロースは、Ｔｏｍｉｔａらの方法（Ｙ．Ｔｏｍｉｔ
ａ，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ ａｎｄ Ｋ．Ｎｉｓｉｚａｗ
ａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７８，４９９（１９７
５））の方法に従って調製した。セルロース基質を含有
する基質溶液を用いることと反応温度を３０℃にした以
外は（ａ）と同様な操作により、生成した還元糖を測定
した。

【００２３】（ｃ）ポリサッカライドに対する加水分解
活性：ポリサッカライドを含有する基質溶液を用いるこ
とと反応温度３０℃にした以外は（ａ）と同様な操作に
より、生成した還元糖を測定した。

【００２４】（ｄ）ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グル
コピラノシド（ＰＮＰＧ：シグマ社製）及びｐ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ＰＮＰＣ：シグマ社
製）に対する加水分解活性：pH ７．０の０．１ Ｍリン
酸緩衝液中で、ＰＮＰＧ又はＰＮＰＣ，８ mMを含有す
る基質溶液に、適宜希釈した酵素溶液を加え、３０℃で
２０分間反応させた。生成したｐ−ニトロフェノールを
４００nmで測定し、その生成量を求めた。

【００２５】（酵素学的性質） （１）作用 本酵素は、ＣＭＣに対する酵素活性を有する。

【００２６】（２）基質特異性 下記表１に示す如く、本酵素はＣＭＣ及びリケナンに対
して強い活性を有する。また、セロビオース、ＰＮＰ
Ｇ、ＰＮＰＣ、セルロース粉末及びリン酸膨潤セルロー
スに対しても活性を有する。

【００２７】

【表１】

【００２８】（３）作用pH及び至適pH 本酵素の作用pH範囲は４．２〜１２．５であり、至適pH
は約７．７と約９．５に２つある（図１）。尚、pH １
０．０においても最大活性の約９０％の活性を有し、ま
たpH １１．５においても活性は約３０％を越え、pH １
２．５においても約１０％の活性を維持している。

【００２９】（４）pH安定性 本酵素をマクルベイン緩衝液（pH３〜７）、０．１ Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（pH ７〜９）、０．１ Ｍ グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH ８〜１１）、０．
１ Ｍ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH ９
〜１４）中で一晩５℃で保持した後、pH ６．０の０．
１ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液とpH ９．０の０．１
Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で残存活性を
測定し、pH安定性を調べた。その結果、本酵素は両pH共
にpH ４．８〜１２の範囲で極めて安定で、ほとんど失
活しない（図２）。

【００３０】（５）作用温度及び至適温度 本酵素のカルボキシメチルセルラーゼ活性をpH ９．０
のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で測定した。そ
の作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、至適温度
は５５℃付近である（図３）。

【００３１】（６）熱安定性 本酵素を各々の温度で１０分間前処理後、pH ９．０の
０．１ Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で残
存活性を測定し、熱安定性を調べた。その結果、６０℃
加熱まではほとんど失活せず、７０℃加熱後も若干の活
性が残存していた（図４）。本条件下において、Ｃａ²⁺
の添加効果は認められなかった。

【００３２】（７）金属イオンの影響 表２に示す各金属イオン調製物及びＣＭＣを酵素溶液と
混合し、カルボキシメチルセルラーゼ活性をpH ９．０
の０．１ Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中
で、４０℃にて２０分間測定した。試験した種々の金属
イオンの中で１mMＨｇ²⁺は酵素活性を７３％程度阻害し
た。１mM Ｃｏ²⁺は酵素活性を約５０％促進し、１mM
Ｍｎ²⁺は酵素活性を約５０％促進した。尚、同表に示し
た他の金属イオンは若干の阻害又は促進のいずれかを示
し、その他の金属イオンによる影響は認められなかっ
た。

【００３３】

【表２】

【００３４】（８）界面活性剤の影響 表３に示す界面活性剤を酵素溶液と混合し、カルボキシ
メチルセルラーゼ活性をpH ９．０の０．１ Ｍ グリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液中で、４０℃にて２０分間
測定した。表３の結果より、本酵素はドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、線状アルキルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム（ＬＡＳ）、アルキル硫酸エステルナトリウム
塩（ＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル
ナトリウム塩（ＥＳ）、α−オレフィンスルホン酸ナト
リウム（ＡＯＳ）、α−スルホン化脂肪酸エステルナト
リウム塩（α−ＳＦＥ）、脂肪酸塩（石鹸）、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテルによってほとんど活性の阻
害を受けないか、あるいは活性を促進した。就中、ＳＤ
Ｓは２１％、脂肪酸塩は２３％、酵素活性を促進した。

【００３５】

【表３】

【００３６】（９）阻害剤の影響 表４に示す阻害剤を酵素溶液と混合し、カルボキシメチ
ルセルラーゼ活性をpH９．０の０．１ Ｍ グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液中で、４０℃にて２０分間測定
した。本酵素の活性はＮ−ブロモスクシンイミドにより
９７％と顕著な阻害を受けるが、その他の阻害剤によっ
ては活性阻害を受けない。

【００３７】

【表４】

【００３８】（１０）キレート剤、チオール試薬、添加
物及びプロティナーゼ類の影響 表５に示す各試薬を酵素溶液と混合し、カルボキシメチ
ルセルラーゼ活性をpH９．０の０．１ Ｍ グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液中で、４０℃にて２０分間測定
した。本酵素はＥＤＴＡ又はＥＧＴＡにより活性が多少
阻害された。一方、１mMの２−メルカプトエタノールは
５２％、ジチオスレイトールは８４％酵素活性を促進し
た。また、アルカラーゼ、マキサターゼ、サビナーゼ、
プロテアーゼＡＰＩ−２１のようなプロティナーゼで
は、本反応条件下で、本酵素の失活は認められなかっ
た。

【００３９】

【表５】

【００４０】（１１）分子量 ＳｈｉｋａｔａとＮｉｓｉｚａｗａの方法（Ｓ．Ｓｈｉ
ｋａｔａ ａｎｄ Ｋ．Ｎｉｓｉｚａｗａ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，７８，４９９（１９７５））の方法に従っ
てバイオゲル Ａ−０．５ｍを用いたゲル濾過法を行っ
たところ、本酵素の分子量は２６，０００±１，０００
であった。

【００４１】

【発明の効果】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５
８１２は、作用pH範囲が４．２〜１２．５と極めて広く
また、pH １２まで極めて安定であるという特徴を有す
る。また作用温度が１０〜７０℃と広く、更に熱安定性
も良好であり、高温高アルカリ洗浄もできるという特徴
を有する。更に、界面活性剤、金属イオン、プロティナ
ーゼ類等の洗浄剤配合成分によってもほとんど阻害を受
けない。従って、本発明酵素は洗浄剤組成物の配合成分
として有利に使用することができるものである。

【００４２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく
説明する。

【００４３】実施例１ フィリピン国 ラグナ州 ロスバニオスで採取した土壌
試料約０．５ｇを滅菌生理食塩水９ mlに懸濁し、８０
℃で１０分間加熱処理した。この熱処理サンプルを適当
に希釈して、寒天平板〔ＰＣＭＣ培地（培地Ａ）〕に塗
抹し、３０℃で３日間培養した。その後、集落の周りに
透明斑を有する菌を同じ平板培地に塗抹し３０℃で３日
間培養して、再度集落を形成させた。

【００４４】上述の手法により、本発明のバチルス エ
スピー ＰＫＭ−５８１２（微工研菌寄第１２５７３
号）を取得した。

【００４５】実施例２ 実施例１で、取得されたバチルス エスピー ＰＫＭ−
５８１２を培地Ｂ（培地Ａからトリパンブルー色素を除
いたもの）を用いて斜面培養を行った。次いで、得られ
たコロニーを５０ ml容の試験管に入れたＣＭＣ−ペプ
トン培地（培地Ｃ）５ mlに接種し、３００rpm で振盪
しながら３０℃にて２日間培養した。更に、５００ ml
容の坂口フラスコに入れた同培地５０ mlに対して、上
記培養物１ mlを接種し、１２０rpm で振盪しながら３
０℃にて３日間培養した。

【００４６】この様にして得られた培養液から遠心分離
により細胞を除去し、カルボキシメチルセルラーゼ５８
１２含有培養上清を得た。

【００４７】実施例３ 実施例２で得られた培養上清を硫酸アンモニウムで処理
（希アンモニア水でpHを中性に維持）し、９０％飽和で
沈澱したタン白を遠心分離（１１，０００×ｇ）によっ
て採取した。この沈澱をpH ７．０の２０ mMリン酸緩衝
液中に溶解し、同緩衝液に対して５℃で一晩透析した。

【００４８】Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｍ．Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８
（１９７６））に従い、ウシ血漿ガンマ・グロブリンを
標準として用いたバイオラッドタン白アッセイキット
（バイオラッド ラボラトリーズ社製）によりタン白濃
度を測定し、比活性７．７３単位（Ｕ）／mgタン白の粗
酵素液を得た。

【００４９】実施例４ 実施例３で得られた粗酵素液について、Ｄａｖｉｓの方
法（Ｂ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，１２１，４０４（１９６４））に従ってポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を９％（ｗ／
ｖ）ポリアクリルアミド スラブゲル（７０mm×８０m
m，１．０mm厚）上で泳動緩衝液として１５０ mMトリス
−グリシン緩衝液（pH ８．８）を用いて行った。電気
泳動は、室温で約２時間、ゲル１枚当り１０mAで行っ
た。Ｏａｋｌｅｙらの方法（Ｂ．Ｒ．Ｏａｋｌｅｙ，
Ｄ．Ｒ．Ｋｉｒｓｃｈ ａｎｄ Ｎ．Ｒ．Ｍｏｒｒｉ
ｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０５，３６１（１
９８０））の方法に従い、タン白を銀染色（銀染色キッ
ト、関東化学製）によって検出した。

【００５０】次いで、カルボキシメチルセルラーゼ活性
を有するタン白バンドをコンゴーレッドで活性染色し
た。すなわち、Ｂ'ｅｇｕｉｎの方法（Ｐ．Ｂ'ｅｇｕｉ
ｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，３３３（１
９８３）に従い、泳動したスラブゲルをＣＭＣ−寒天プ
レートの表面にのせ３７℃で３０分間放置した。ＣＭＣ
−寒天プレートの組成は、２％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ（Ｓｕ
ｎｒｏｓｅ Ａ１０ＭＣ）、３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、
１０％（ｖ／ｖ）０．５ Ｍ グリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH ９．０）及び０．８％（ｗ／ｖ）寒天
（ディフコ社製）とした。このプレートを０．１％（ｗ
／ｖ）コンゴーレッド（和光純薬（株）製）溶液で１５
分間室温で染色し、更に、１．０ Ｍ ＮａＣｌ溶液で
１５分間脱色した。その結果、相対移動度（Ｒｍ）０．
４３の位置にカルボキシメチルセルラーゼ活性を有する
タン白バンドが検出された。

【００５１】実施例５ 実施例３で得られた粗酵素液について、Ｗｒｉｇｌｅｙ
の方法（Ｃ．Ｗ．Ｗｒｉｇｌｅｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，２２，５５９（１９７１））に従っ
て、ＰＡＧＥによる等電点（ｐＩ）を求めた。各酵素溶
液（１mg／ml）１００μｌを１３．３％（ｗ／ｖ）グリ
セロール及び６．３％（ｖ／ｖ）ファルマライト（ファ
ルマシア社製：pH範囲３−１０）含有アクリルアミドゲ
ル５％（ｗ／ｖ）カラム中で２００Ｖの定電圧で約１５
時間電気泳動した。陽極は上部チャンバー（２０ mM
Ｈ₃ＰＯ₄）に、陰極は下部チャンバー（０．１ Ｍ 水
酸化ナトリウム）に接続した。泳動後、０．２％（ｗ／
ｖ）コマシーブリリアンドブルー Ｒ−２５０（メル
ク）でタン白染色した。カルボキシメチルセルラーゼ活
性を実施例４に従って活性染色して、活性バンドの相対
移動度を測定し、ｐＩ値を既知のタン白の標準曲線から
求めたところ、pH ４．５であった。

【００５２】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５８１２
のpH−活性曲線を示す図面である。

【図２】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５８１２
のpH安定性を示す図面である。

【図３】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５８１２
の温度−活性曲線を示す図面である。

【図４】本発明のカルボキシメチルセルラーゼ５８１２
の温度安定性を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 マリエッタ エヌ．バレンドール フィリピン国，ミサミスオリエンタル, ローワァーハサーン （番地なし) (72)発明者 ネリー エム．ラブノス フィリピン国，ミサミスオリエンタル, グラシア（番地なし) (72)発明者 上田 紳太 フィリピン国，カガヤン デ オロシテ ィ，グサ，ピーケイアイ （番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の物理化学的性質を有するカルボキシ
   メチルセルラーゼ５８１２。 （１）作用 カルボキシメチルセルロースを加水分解する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに対して強く
   作用し、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロース、セロ
   ビオース、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノ
   シド及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドに
   対しても作用する。 （３）作用pH及び至適pH 作用pHは４．２〜１２．５であり、至適pHは約７．７と
   約９．５に２つある。 （４）pH安定性 ５℃で一晩保持した場合、pH ４．８〜１２でほとんど
   失活しない。 （５）作用温度及び至適温度 作用温度は１０〜７０℃、至適温度は５５℃付近であ
   る。 （６）熱安定性 ６０℃で１０分間加熱してもほとんど失活せず、７０℃
   加熱後も若干の活性が残存する。 （７）界面活性剤の影響 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、線状アルキルベン
   ゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、アルキル硫酸エ
   ステルナトリウム塩（ＡＳ）、ポリオキシエチレンアル
   キル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、α−オレフィ
   ンスルホン酸ナトリウム（ＡＯＳ）、α−スルホン化脂
   肪酸エステルナトリウム塩（α−ＳＦＥ）、脂肪酸塩
   （石鹸）、ポリオシキエチレンアルキルエーテルは活性
   を阻害しない。 （８）分子量（バイオゲルＡ−０．５ｍによるゲル濾過
   法） ２６，０００±１，０００
2. 【請求項２】 請求項１記載のカルボキシメチルセルラ
   ーゼ５８１２を生産する、微工研菌寄第１２５７３号と
   して寄託されたバチルス エスピー ＰＫＭ−５８１
   ２。