JP2509534B2 - アルカリ耐性セルラ―ゼを産生する微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリ耐性セル
ラーゼを産生する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従
来、バイオマス資源、特にセルロース資源の有効利用を
一大目標として進められてきた。セルラーゼ生産菌とし
て分離されてきた菌株は多種類にわたり、アルペルギル
ス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム
属、フミコーラ属、アクレモニウム属等の糸状菌を中心
に、シュードモナス属、セルロモナス属、ルミノコッカ
ス属、バチルス属等の細菌、更に、ストレプトマイセス
属、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告され
ている。しかしながら、現時点では、バイオマス用セル
ラーゼの工業的規模での利用は、多くはない。

【０００３】一方、セルラーゼの新規な産業的用途とし
て、衣料用洗浄剤の配合成分としての利用が検討され注
目を集めている（特公昭５９−４９２７９号公報、特公
昭６０−２３１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号
公報）。しかし、自然界において従来見出されたセルラ
ーゼのほとんどは、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ
安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラー
ゼに分類されるものであって、衣料用洗浄剤配合成分と
しての必要条件である、アルカリ領域で最大活性を示す
か、あるいはアルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂ア
ルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在
は、極めて少ないのが実情である。

【０００４】ここで言うアルカリセルラーゼとは、至適
pHがアルカリ領域にあるものを言い、アルカリ耐性セル
ラーゼとは、至適pHは中性から酸性領域にあるが、アル
カリ領域に於いても至適pHに於ける活性に比較して充分
に活性を有し且つ安定性を保持するものを言う。

【０００５】また、中性とはpH６〜８の範囲を言い、ア
ルカリ性とはそれ以上のpH範囲を言う。即ち、従来、衣
料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカリセルラーゼ
及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法としては、好ア
ルカリ性バチルス属細菌の培養によりセルラーゼＡを採
取する方法（特公昭５０−２８５１５号公報）、セルロ
モナス属に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリ
セルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２
２４６８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮｏ．１１
３９を培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する
方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ，Ｆ．，Ｋｕｄｏ，Ｔ．ａｎｄ
Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，１３１，３３３９，（１９８５））及びス
トレプトマイセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼ
を生産する方法（特開昭６１−１９４８３号公報）が報
告されているに過ぎず、いずれも工業的発酵生産に適う
ものではなかった。

【０００６】ところが、最近、本発明者らは好アルカリ
性微生物の一種であるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ Ｐ−８８
７２）が、衣料用洗浄剤組成物として適したアルカリセ
ルラーゼＫを効率良く生産すること、及び更に培養条件
を選択することにより、より高収率で、アルカリセルラ
ーゼＫが得られ、アルカリセルラーゼの工業的発酵生産
が可能となることを見出した。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記バ
チルス エスピーＫＳＭ−６３５の培養条件は、必ずし
も工業的に有利なものと言えない。即ち、好アルカリ性
菌株は培養中、pHをアルカリ性に保ち続ける必要がある
が、現在までのところ、好アルカリ性菌株を用いる所謂
アルカリ性発酵法の歴史は浅く、通常の中性微生物と比
較するとこれら好アルカリ性微生物の生理、生化学につ
いての知見は充分に蓄積されておらず、工業的発酵生産
を行うにあたっての培地調製、培養方法が操作上の難点
となっていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる問題
点を解決するためにアルカリ領域に至適pHを有するアル
カリセルラーゼ或いは、アルカリ領域に於いても、至適
pHに於ける最高活性に比較しても高活性を維持し得るア
ルカリ耐性セルラーゼを生産する中性細菌を得べく、中
性領域で生育する菌株を宿主として、該当するセルラー
ゼ遺伝子をクローニングする、所謂遺伝子組換えの手段
と併行し、自然界において該細菌の探索を続けてきた。

【０００９】そして、その結果、栃木県芳賀郡の土壌か
ら分離した菌株は、アルカリ側においても充分作用を有
し、且つ安定性を保持する、所謂アルカリ耐性セルラー
ゼを産生することを見出し、本発明を完成した。

【００１０】本発明の菌株は、次のような菌学的性質を
有する。なお、以下の分類同定において用いた培地は次
の通りである。

【００１１】培地 １． 肉エキス，１．０；バクトペ
プトン，１．０；ＮａＣｌ，０．５；バクト寒天，１．
５（pH７．２）（表示は、重量％；以下同じ） 培地 ２． 肉エキス，１．０；バクトペプトン，１．
０；ＮａＣｌ，０．５（pH７．２） 培地 ３． 肉エキス，１．０；バクトペプトン，１．
０；ＮａＣｌ，０．５；ゼラチン，１．０（pH７．２） 培地 ４． バクトリトマスミルク，１０．０ 培地 ５． バクトペプトン，１．０；ＫＮＯ₃，０．
１ 培地 ６． バクトペプトン，１．０；ＮａＮＯ₃，
１．０ 培地 ７． バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．
５；ブドウ糖，０．５（pH７．０） 培地 ８． バクトペプトン，１．０ 培地 ９． ＴＳＩ寒天（栄研化学社製）；指示量 培地１０． 肉エキス，１．０；バクトペプトン，１．
０；ＮａＣｌ，０．５；可溶性澱粉，０．２；寒天，
１．５

【００１２】培地１１． ＮａＮＨ₄ＨＰＯ₄・４Ｈ
₂Ｏ，０．１５；ＫＨ₂ＰＯ₄，０．１；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ，０．０２；クエン酸ナトリウム，０．２５（pH
６．８） 培地１２．クリステンセン培地（栄研化学社製）；指示
量 培地１３．ブドウ糖，１．０；ＫＨ₂ＰＯ₄，０．１；Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０５；ＫＣｌ，０．０２；窒素
源，０．１（窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸アンモ
ニウムを用いた）（pH７．２） 培地１４．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製）；指
示量 培地１５．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製）；指
示量 培地１６．尿素培地“栄研”（栄研化学社製）；指示量 培地１７．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
水製薬製） 培地１８．３％過酸化水素水 培地１９．ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）；指示量 培地２０．（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄，０．１；ＫＣｌ，０．
０２；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０２；酵母エキス，
０．０２；バクト寒天，２．０；ＢＣＰ（０．２％溶
液），０．４

【００１３】培地２１．バクト・サブロー・デキストロ
ース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）；指示量 培地２２．肉エキス，０．３；バクトペプトン，０．
５；酵母エキス，１．０；グリセリン，２．０ 培地２３．フェニルアラニン マロン酸塩培地（日水製
薬社製）；指示量 培地２４．スキムミルク，５．０；バクト寒天，１．５ 培地２５．肉エキス，０．３；バクトペプトン，０．
５；Ｌ−チロシン，０．５；バクト寒天，１．５

【００１４】（菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．４〜０．８μｍ×１．５〜６．５
μｍの桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形の内
生胞子（０．６〜０．８μｍ×１．０〜２．５μｍ）を
作る。周鞭毛を有し運動性がある。グラム染色は陽性。
抗酸性はない。

【００１５】（ｂ）各種培地に於ける生育状態 （１）肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は弱い。集落の形状は円形であり、表面は円
滑、周縁は円滑である。また集落の色調は淡黄色半透明
で光沢がある。 （２）肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育は弱く、その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半
透明である。 （３）肉汁液体培養（培地２） 生育するが、その状態は弱い。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。 （５）リトマスミルス培地（培地４） ミルスの液化は認められるが、リトマス色素の明確な変
化はない。

【００１６】（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５，培地６） ともに、陰性。 （２）ＭＲテスト（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（pH５．２）。 （３）ＶＰテスト（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（pH５．２）。 （４）インドールの生成（培地８） 陰性。 （５）硫化水素の生成（培地９） 陰性。

【００１７】（６）澱粉の加水分解（培地１０） 陽性。 （７）クエン酸の利用（培地１１，培地１２） コーサ培地及びクリステンセン培地で、ともに陽性。 （８）無機窒素源の利用（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。 （９）色素の生成（培地１４，培地１５） 陰性。 （10）ウレアーゼ（培地１６） 陰性。

【００１８】（11）オキシダーゼ（培地１７） 陽性。 （12）カタラーゼ（培地１８） 陽性。 （13）生育の範囲（培地２） 生育の温度範囲は、１５〜５０℃、生育最適温度範囲は
２５〜４０℃ 生育のpH範囲は、pH５〜１１、生育最適pH範囲はpH６〜
１０であった。

【００１９】（14）酸素に対する態度 通気嫌気性。 （15）Ｏ−Ｆテスト（培地１９） 好気、嫌気ともに生育する。 （16）糖の利用性（培地２０）（＋：利用する、−：利
用しない）

【００２０】

【表１】１．Ｌ−アラビノース ＋ ２．Ｄ−キシロース ＋ ３．Ｄ−グルコース ＋ ４．Ｄ−マンノース ＋ ５．Ｄ−フラクトース ＋ ６．Ｄ−ガラクトース − ７．麦芽糖 − ８．ショ糖 ＋ ９．乳糖 ＋ １０．トレハロース − １１．Ｄ−ソルビット ＋ １２．Ｄ−マンニット ＋ １３．イノシット ＋ １４．グリセリン ＋ １５．デンプン ＋

【００２１】（17）ＶＰ培地に於けるpH（培地７） pH５．２ （18）食塩含有培地に於ける生育（改変培地１） ５％で生育する。 ７％で生育する。 １０％で生育せず。 （19）pH５．７に於ける生成（培地２１） 生育する。

【００２２】（20）ジハイドロキシアセトンの生成（培
地２２） 陰性。 （21）フェニルアラニンの脱アミノ化（培地２３） 陰性。 （22）カゼインの分解（培地２４） 陽性。 （23）チロシンの分解（培地２５） 陰性。

【００２３】以上の菌学的性質について、バージーズ・
マニュアル・オブ・デイタミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
第８版及びザ・ジーナス・バチルス（“Ｔｈｅ Ｇｅｎ
ｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”，Ｒｕｔｈ，Ｅ．Ｇｏｒｄｏ
ｎ著 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎ
ｏ．４２７，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ Ｄ．Ｃ．（１９７３））を参照し比較、検索した結
果、本発明の菌株は、有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属の一種であると認められる。そして本
菌株は、最近、掘越と秋葉（“Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉ
ｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”，Ｊａｐａｎ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏ
ｋｙｏ），１９８２年刊）の主張ている、所謂好アルカ
リ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物がpH８以上の
アルカリ培地に於いて生育し、これ以下の中性pH領域で
は生育できないのに対し、弱酸性領域からアルカリ領域
（pH５〜１１）に於いて生育が可能であることから、こ
の好アルカリ性微生物とは明らかに異なるものであり、
一般的な中性で生育可能なバチルス属微生物と判断でき
る。

【００２４】更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株
と比較すると、最も類縁の種としてバチルス・リケニホ
ルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）が挙げられる。しかしながら、公知のリケニホルミ
スに属する菌株と本菌株とを比較すると、硝酸塩の還元
能において相異する。更に上記リケニホルミスに属する
菌株は少なくともアルカリ耐性のセルラーゼを産生しな
いので本発明者らは本菌株を新菌株と判断し、バチルス
エスピー ＫＳＭ−５３９と命名して工業技術院微生
物研究所に寄託した（ＦＥＲＭ Ｐ−９０１１）。

【００２５】本発明の菌株を用いてアルカリ耐性セルラ
ーゼ、セルラーゼＫ−５３９を得るには、培地に該菌株
を接種し、常法に従って培養すれば良い。培地中には、
資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておく
ことが好ましい。この炭素源及び窒素源については特に
制限はないが、その例としては、窒素源として無機態の
硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ
や、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イ
ワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、
カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼス
ト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源として
は、籾殻、麸、濾紙、一般紙類、おが屑などの植物繊維
質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース（Ｃ
ＭＣ）、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン
に加え、資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キ
シロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガ
ラクトース、ショ糖、乳糖、ソルビトール、マンニトー
ル、イノシトール、グリセリン、可溶性デンプンや資化
し得る有機酸、例えば酢酸、クエン酸等が挙げられる。
また、その他、リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｚｎ
²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺などの無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。

【００２６】斯くして得られた培養物中からの目的物質
であるセルラーゼＫ−５３９の採取及び精製は、一般の
酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。
即ち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により
菌体を培養液から除去して粗酵素液を得ることができ
る。この粗酵素液は、そのまま使用することもできる
が、必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結
晶化して、精製酵素として使用することも可能である。

【００２７】斯くして得られたアルカリセルラーゼＫ−
５３９は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵
素活性の測定は、以下の方法に従って行い、また用いた
緩衝液は次の通りである。

【００２８】pH３〜８ マクルベイン緩衝液 pH８〜１１ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH１２〜１３ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液

【００２９】酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０mgＣＭＣ（Ａ−０１Ｌ，山陽国策パルプ社製）、１
００μmol 各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリシ
ン−ＮａＯＨ等）を含む基質溶液０．９mlに０．１mlの
酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反応後、
３，５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒ
ｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法にて
還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．０mlにＤＮＳ
試薬１．０mlを加え、５分間、１００℃で加熱発色さ
せ、冷却後、４．０mlの脱イオン水を加えて希釈した。
これを波長５３５nmで比色定量した。酵素力価は、上記
の条件下で１分間に１μmol のグルコースに相当する還
元糖を生成する酵素量を１単位とした。

【００３０】（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分
解活性 ０．１μmol ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ
社製）、１００μmolリン酸緩衝液（pH７．０）を含む
反応液１．０ml中に適当量の酵素液を３０℃で作用させ
た後、１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃を０．３ml、脱イオン水を１．
７ml順次加え、遊離するｐ−ニトロフェノールを４００
nmで比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間
に１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量
を１単位とした。

【００３１】（３）アビセル、セルロース粉末、及び濾
紙分解活性 ２０mgアビセル（メルク社製）、２００μmol リン酸緩
衝液（pH７．０）を含む反応液２．０ml中に適当量の酵
素液を加え、３０℃、２５０rpm で振とうしながら作用
させた。反応後、冷却遠心分離（５℃、３０００rpm 、
２０分）を行い、その上清１．０mlを３，５−ジニトロ
−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙ
ｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法にて還元糖の定量を行
った。セルロース粉末分解活性はセルロース粉末（東洋
濾紙社製）を、濾紙分解活性は濾紙（セルラーゼ活性検
定用濾紙、東洋Ｎｏ．５１−特）を用い、アビセラーゼ
活性の時と同様に行った。酵素力価は、上記の条件下で
１分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成
する酵素量を１単位とした。

【００３２】（４）セロビアーゼ活性 １０mgセロビオース（関東化学社製）、１００μmol リ
ン酸緩衝液（pH７．０）を含む反応液１．０ml中に適当
量の酵素液を３０℃で作用させた後、１００℃、２分処
理し酵素を失活させた後、生成グルコース量をムロター
ゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃ−Ｔｅｓｔ、和光純
薬工業社製）で測定した。酵素力価は、上記の条件下で
１分間に２μmol のグルコースを生成する酵素量を１単
位とした。

【００３３】（酵素学的性質） （１）作用 セルロース、濾紙、アビセル、ＣＭＣ等の繊維素によく
作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を
生成する。

【００３４】（２）基質特異性 本酵素はＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル、
濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオシドに対する活性
を有していた。

【００３５】（３）作用pH及び最適pH 作用pH範囲は、３〜１２．５と極めて広範囲にわたる。
最適pHは、７であり、４〜１１の範囲に於いても至適pH
に於ける活性の５０％以上の相対活性を有しており、過
去に研究されたセルラーゼの中でも最もアルカリ側で作
用pH範囲が広い酵素と言える（図１）。

【００３６】（４）pH安定性 各々のpHで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測定
し、pH安定性を調べた。その結果、pH５〜１２で極めて
安定で失活せず、pH３．５〜１２．５に於いても、約５
０％以上の活性を維持していた。本酵素は、このように
高アルカリ領域に於いても充分に安定である（図２）。

【００３７】（５）最適温度 作用温度は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であった。又、４５〜７５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた（図
３）。

【００３８】（６）温度安定性 至適pHに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存活
性を測定した結果、５０℃では安定しており、６０℃に
於いても約５０％の残存活性を有していた（図４）。

【００３９】（７）分子量 本酵素をセファデックスＧ−１００（“Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−１００”）によるゲル濾過法に基づき分子量を
測定したところ、約１．８万と約２．９万に主たるピー
クが観察された。

【００４０】（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Ａｌ³⁺，Ｆｅ³⁺，Ｂ
ａ²⁺，Ｃａ²⁺，Ｃｄ²⁺，Ｃｏ²⁺，Ｃｒ²⁺，Ｃｕ²⁺，Ｆｅ
²⁺，Ｈｇ²⁺，Ｍｎ²⁺，Ｍｏ²⁺，Ｎｉ²⁺，Ｐｄ²⁺，Ｚ
ｎ²⁺，Ｌｉ⁺，Ｋ⁺，Ｎａ⁺）を活性測定時に共存させ
て、その影響を検討した（各種金属イオン濃度は１mM，
Ｋ⁺，Ｎａ⁺は５０mMである）。その結果、Ｈｇ²⁺で阻害
が、Ｃｏ²⁺，Ｃｄ²⁺，Ｂａ²⁺により活性化が認められ
た。

【００４１】（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯ
Ｓ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレンセ
カンダリーアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす影響
を調べた。界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、１５分
間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの界面活
性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強力なデ
タージエントであるソディウム・ドデシルサルフェート
によっても活性の阻害は認められなかった。

【００４２】（１０）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工社
製）、マクサターゼ（ギスト社製）及びアルカラーゼ
（ノボ社製）を、活性測定時に共存（０．１mg／ml）さ
せてその影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対
しても強い耐性を有することがわかった。

【００４３】（１１）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ゼオ
ライト、トリポリリン酸ソーダを活性測定時に共存さ
せ、その影響を検討したが、ほとんど阻害は認められな
かった。

【００４４】

【発明の効果】本発明の微生物より得られるセルラーゼ
Ｋ−５３９は、至適pHを７に有するにもかかわらず高ア
ルカリのpH１０に於いても最適pHの８０％以上、pH１１
に於いても６０％以上の相対活性を有し、pH５〜１２に
於いて極めて安定である。また、界面活性剤、プロテア
ーゼ、キレート剤等の洗浄剤配合成分によってもほとん
ど阻害を受けない。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配
合成分として有利に使用することができるものである。

【００４５】また、本発明の菌株、バチルス エスピー
ＫＳＭ−５３９は中性で生育する菌株であるので、好
アルカリ性細菌と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを
工業的に生産することができる。

【００４６】

【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。

【００４７】実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯（約０．５ｇ）を
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理し
た。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天
培地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて
３日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣ
の溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣ
アーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地２の液体
培地に接種し、３０℃で３日間振とう培養した。培養
後、遠心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、
pH３〜１３にて測定し、アルカリ耐性セルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。上述の方法により、本発明のバ
チルス エスピー ＫＳＭ−５３９株（ＦＥＲＭ Ｐ−
９０１１）を取得することができた。

【００４８】

【表２】 培地１．ＣＭＣ ２％ ポリペプトン ０．５％ 酵母エキス ０．０５％ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ０．２５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％ 寒天 ０．７５％ pH６．８

【００４９】

【表３】 培地２．ＣＭＣ １％ ポリペプトン １％ 酵母エキス ０．５％ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ０．２５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％ pH６．８

【００５０】参考例１ 実施例１で得たバチルス エスピー ＫＳＭ−５３９を
実施例１の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振とう
培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液
を得た。この粗酵素液１リットルに対して、ドライアイ
ス−エタノール中で３リットルのエタノールを加え、生
じた沈澱を遠心分離し更に凍結乾燥を行い乾燥粉末とし
てセルラーゼＫ−５３９ ９ｇ（比活性２６単位／ｇ；
pH９における測定値以下同じ）を得た。

【００５１】参考例２ 液体培地２に於いてＣＭＣを１％ショ糖に、ポリペプト
ンを７％ＣＳＬ（コーン・スチープ・リカー）に代えた
培地を用い、参考例１に準じて３０℃で２日間振とう培
養した。得られた培養液の遠心分離上清についてそのＣ
ＭＣアーゼ活性を測定したところ４０単位／ｌであっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素反応pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。

【図２】酵素処理pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。

【図３】酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面であ
る。

【図４】酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 森 啓 栃木県宇都宮市峰町396−12

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルカリ耐性セルラーゼＫ−５３９を生
   産する能力を有し、微工研菌寄第９０１１号として寄託
   されたバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
   ｐ．）ＫＳＭ−５３９。