JPH0630579B2 - アルカリ耐性セルラ−ゼ - Google Patents
アルカリ耐性セルラ−ゼInfo
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- JPH0630579B2 JPH0630579B2 JP29445886A JP29445886A JPH0630579B2 JP H0630579 B2 JPH0630579 B2 JP H0630579B2 JP 29445886 A JP29445886 A JP 29445886A JP 29445886 A JP29445886 A JP 29445886A JP H0630579 B2 JPH0630579 B2 JP H0630579B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリ耐性セルラーゼに関する。
繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ
属、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウドモ
ナス属、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス
属等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアク
チノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかし
ながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的
規模での利用は、多くはない。
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ
属、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウドモ
ナス属、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス
属等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアク
チノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかし
ながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的
規模での利用は、多くはない。
一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界において従来見出されたセルラーゼのほとん
どは、酸性乃至中性領域に於いて最大且つ安定な酵素活
性を示す、所謂酸性若しくは中性セルラーゼに分類され
るものであつて、衣料用洗浄剤配合成分としての必要条
件である。アルカリ領域で最大活性を示すが、あるいは
アルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂アルカリセルラ
ーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界において従来見出されたセルラーゼのほとん
どは、酸性乃至中性領域に於いて最大且つ安定な酵素活
性を示す、所謂酸性若しくは中性セルラーゼに分類され
るものであつて、衣料用洗浄剤配合成分としての必要条
件である。アルカリ領域で最大活性を示すが、あるいは
アルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂アルカリセルラ
ーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。
ここで言うアルカリセルラーゼとは、至適pHがアルカリ
領域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラーゼとは、
至適pHは酸性から中性領域にあるが、アルカリ領域に於
いても至適pHに於ける活性に比較して充分に活性を有し
かつ安定性を保持するものを言う。
領域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラーゼとは、
至適pHは酸性から中性領域にあるが、アルカリ領域に於
いても至適pHに於ける活性に比較して充分に活性を有し
かつ安定性を保持するものを言う。
また、中性とはpH6〜８の範囲を言い、アルカリ性とは
これより高いpH範囲をいう。
これより高いpH範囲をいう。
即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアル
カリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法
としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセ
ルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０−２８５１５号
公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培
養してアルカリセルラーゼ ３０１−Ａを生産する方法
（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バ
チルス NO.１１３９を培養してカルボキシメチルセル
ラーゼを生産する方法（Fukumori,F.,Kudo,T.and Horik
oshi,K.,J.Gen.Microbiol.,131,3339,(1985)）及びスト
レプトマイセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを
生産する方法（特開昭６１−１９４８３号公報）が報告
されているに過ぎず、しかもいずれも工業的発酵生産に
適うものでは無かった。
カリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法
としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセ
ルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０−２８５１５号
公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培
養してアルカリセルラーゼ ３０１−Ａを生産する方法
（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バ
チルス NO.１１３９を培養してカルボキシメチルセル
ラーゼを生産する方法（Fukumori,F.,Kudo,T.and Horik
oshi,K.,J.Gen.Microbiol.,131,3339,(1985)）及びスト
レプトマイセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを
生産する方法（特開昭６１−１９４８３号公報）が報告
されているに過ぎず、しかもいずれも工業的発酵生産に
適うものでは無かった。
ところが、最近、本発明者らは好アルカリ性微生物の一
種であるバチルス エスピー（Bacillussp.）ＫＳＭ−
６３５−（ＦＥＲＭ Ｐ−8872）が、衣料用洗浄剤組成
物として適したアルカリセルラーゼＫを効率良く生産す
ること、及び更に培養条件を選択することにより、より
高収率で、アルカリセルラーゼＫが得られ、アルカリセ
ルラーゼの工業適発酵生産が可能となることを見出し
た。
種であるバチルス エスピー（Bacillussp.）ＫＳＭ−
６３５−（ＦＥＲＭ Ｐ−8872）が、衣料用洗浄剤組成
物として適したアルカリセルラーゼＫを効率良く生産す
ること、及び更に培養条件を選択することにより、より
高収率で、アルカリセルラーゼＫが得られ、アルカリセ
ルラーゼの工業適発酵生産が可能となることを見出し
た。
しかしながら、上記バチルス エスピー ＫＳＭ−６３
５の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えな
い。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、pHをアルカ
リに保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好ア
ルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史は浅
く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ性
微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積され
ておらず、工業的発酵生産を行うにあたつての培地調
製、培養方法が操作上の難点となつていた。
５の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えな
い。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、pHをアルカ
リに保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好ア
ルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史は浅
く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ性
微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積され
ておらず、工業的発酵生産を行うにあたつての培地調
製、培養方法が操作上の難点となつていた。
本発明者らはかかる問題点を解決するためにアルカリ領
域に至適pHを有するアルカリセルラーゼ或いは、アルカ
リ領域に於いても、至適pHに於ける最高活性に比較して
も高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼを生産す
る中性細菌を得べく、鋭意検索をおこなっていたとこ
ろ、すでに北海道大学農学部菌株保存施設（ＡＨＵ）に
おいて保存されている菌株がアルカリ側においても該作
用を有し、且つ安定性を保持する、所謂アルカリ耐性セ
ルラーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
域に至適pHを有するアルカリセルラーゼ或いは、アルカ
リ領域に於いても、至適pHに於ける最高活性に比較して
も高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼを生産す
る中性細菌を得べく、鋭意検索をおこなっていたとこ
ろ、すでに北海道大学農学部菌株保存施設（ＡＨＵ）に
おいて保存されている菌株がアルカリ側においても該作
用を有し、且つ安定性を保持する、所謂アルカリ耐性セ
ルラーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
本発明において用いられる菌株は、北海道大学農学部菌
株保存施設（ＡＨＵ）においてバチルス ズブチリス
（Bacillus subtilis）ＡＨＵ １６１５として保存さ
れている公知菌株であり、また、工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−９０１４として寄託してあ
る。そして、この菌株は日本微生物保存連盟（ＪＦＣ
Ｃ）に加盟する前記保存機関から自由に分譲を受けるこ
とができる。
株保存施設（ＡＨＵ）においてバチルス ズブチリス
（Bacillus subtilis）ＡＨＵ １６１５として保存さ
れている公知菌株であり、また、工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−９０１４として寄託してあ
る。そして、この菌株は日本微生物保存連盟（ＪＦＣ
Ｃ）に加盟する前記保存機関から自由に分譲を受けるこ
とができる。
この菌株を用いてアルカリ耐性セルラーゼ、セルラーゼ
Ｋ−１６１５を得るには、培地に該菌株を接種し、常
法に従つて培養すれば良い。培地中には、資化し得る炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。この炭素源及び窒素源については特に制限はない
が、その例としては、窒素源として無機態の硝安、硫
安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダや、コーン
グルテン ミール、大豆粉、コーン スチープ リカ
ー、カザミノ酸、酵母エキス、フアーマメディア、イワ
シミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーン ソイビーン ミール、コーヒー粕、綿実油
粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼ
スト、アジックスなどが挙げられる。又、炭素源として
は、籾殻、麸、濾紙、一般紙類、おが屑などの植物繊維
質、廃糖密、転化糖、ＣＭＣ、アビセル、セルロース
綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、例
えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノ
ース、フラクトース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトー
ル、マンニトール、イノシトール、グリセリン、可溶性
デンプンや資化し得る有機酸、例えば酢酸、クエン酸等
が挙げられる。また、その他、リン酸、Mg2+，Ca2+，Mn
2+，Zn2+，Co2+，Na+，K+などの無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。
Ｋ−１６１５を得るには、培地に該菌株を接種し、常
法に従つて培養すれば良い。培地中には、資化し得る炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。この炭素源及び窒素源については特に制限はない
が、その例としては、窒素源として無機態の硝安、硫
安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダや、コーン
グルテン ミール、大豆粉、コーン スチープ リカ
ー、カザミノ酸、酵母エキス、フアーマメディア、イワ
シミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーン ソイビーン ミール、コーヒー粕、綿実油
粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼ
スト、アジックスなどが挙げられる。又、炭素源として
は、籾殻、麸、濾紙、一般紙類、おが屑などの植物繊維
質、廃糖密、転化糖、ＣＭＣ、アビセル、セルロース
綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、例
えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノ
ース、フラクトース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトー
ル、マンニトール、イノシトール、グリセリン、可溶性
デンプンや資化し得る有機酸、例えば酢酸、クエン酸等
が挙げられる。また、その他、リン酸、Mg2+，Ca2+，Mn
2+，Zn2+，Co2+，Na+，K+などの無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。
斯くして得られた培養物中から目的物質であるセルラー
ゼＫ−１６１５の採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠心
分離又は過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去して粗酵素液を得ることも出来る。この粗酵
素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応じ
て、塩析法、沈殿法、限外過法等の分離手段により粗
酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製
酵素として使用することも可能である。
ゼＫ−１６１５の採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠心
分離又は過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去して粗酵素液を得ることも出来る。この粗酵
素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応じ
て、塩析法、沈殿法、限外過法等の分離手段により粗
酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製
酵素として使用することも可能である。
斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼ Ｋ−１
６１５は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵
素活性の測定は、以下の方法に従つて行ない、また用い
た緩衝液は次の通りである。
６１５は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵
素活性の測定は、以下の方法に従つて行ない、また用い
た緩衝液は次の通りである。
pH3〜８ マクルベイン緩衝液 pH8〜１１ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH1２〜１３ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法： (1)ＣＭＣアーゼ活性 １０mgＣＭＣ（Ａ−０１Ｌ，山陽国策パルプ社）、１０
０μmol各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリシン
−NaOH等）を含む基質溶液0.９ｍに0.１ｍの酵素溶
液を加え、３０℃、２０分反応した。反応後、３，５−
ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic ac
id(DNS)）法にて還元糖の定量を行つた。すなわち、反
応液1.０ｍにＤＮＳ試薬1.０ｍを加え、５分間、１
００℃で加熱発色させ、冷却後、4.０ｍの脱イオン水
を加えて希釈した、これを波長５３５nmで比色定量し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。
０μmol各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリシン
−NaOH等）を含む基質溶液0.９ｍに0.１ｍの酵素溶
液を加え、３０℃、２０分反応した。反応後、３，５−
ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic ac
id(DNS)）法にて還元糖の定量を行つた。すなわち、反
応液1.０ｍにＤＮＳ試薬1.０ｍを加え、５分間、１
００℃で加熱発色させ、冷却後、4.０ｍの脱イオン水
を加えて希釈した、これを波長５３５nmで比色定量し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。
(2)ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性0.１μmol
ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社）、１００
μmolリン酸緩衝液（pH7.０）を含む反応液1.０ｍ中
に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１ＭNa2CO3
を0.３ｍ、脱イオン水を1.７ｍ順次加え、遊離する
ｐ−ニトロフェノールを４００nmで比色定量した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのｐ−ニトロ
フェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。
ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社）、１００
μmolリン酸緩衝液（pH7.０）を含む反応液1.０ｍ中
に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１ＭNa2CO3
を0.３ｍ、脱イオン水を1.７ｍ順次加え、遊離する
ｐ−ニトロフェノールを４００nmで比色定量した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのｐ−ニトロ
フェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。
(3)アビセル、セルロース粉末、及び濾紙分解活性 ２０mgアビセル（メルク社）、２００μmolリン酸緩衝
液（pH7.０）を含む反応液2.０ｍ中に適当量の酵素液
を加え、３０℃、２５０rpmで振とうしながら作用させ
た。反応後、冷却遠心分離（５℃、３０００rpm、２０
分）を行い、その上清1.０ｍをＤＮＳ法にて還元糖の
定量を行つた。セルロース粉末分解活性はセルロース粉
末（東洋濾紙社）を、濾紙分解活性は濾紙（セルラーゼ
活性検定用濾紙、東洋NO.５１−特）を用い、アビセラ
ーゼ活性の時と同様に行つた。酵素力価は、上記の条件
下で１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を
生成する酵素量を１単位とした。
液（pH7.０）を含む反応液2.０ｍ中に適当量の酵素液
を加え、３０℃、２５０rpmで振とうしながら作用させ
た。反応後、冷却遠心分離（５℃、３０００rpm、２０
分）を行い、その上清1.０ｍをＤＮＳ法にて還元糖の
定量を行つた。セルロース粉末分解活性はセルロース粉
末（東洋濾紙社）を、濾紙分解活性は濾紙（セルラーゼ
活性検定用濾紙、東洋NO.５１−特）を用い、アビセラ
ーゼ活性の時と同様に行つた。酵素力価は、上記の条件
下で１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を
生成する酵素量を１単位とした。
(4)セロビアーゼ活性 １０mgセロビオース（関東化学社）、１００μmolリン
酸緩衝液（pH7.０）を含む反応液1.０ｍ中に適当量の
酵素液を３０℃で作用させた後、１００℃、２分処理し
酵素を失活させた後、生成グルコース量をムロターゼ・
ＧＯＤ法（Glucose C-Test、和光純薬工業社）で測定し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に２μmolのグ
ルコースを生成する酵素量を１単位とした。
酸緩衝液（pH7.０）を含む反応液1.０ｍ中に適当量の
酵素液を３０℃で作用させた後、１００℃、２分処理し
酵素を失活させた後、生成グルコース量をムロターゼ・
ＧＯＤ法（Glucose C-Test、和光純薬工業社）で測定し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に２μmolのグ
ルコースを生成する酵素量を１単位とした。
（酵素学的性質） (1)作用 セルロース、濾紙、アビセル、ＣＭＣ等の繊維素によく
作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を
生成する。
作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を
生成する。
(2)基質特異性 本酵素はＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル、
濾紙、ｐ−ニトロフェニルセロビオシド及びセロビオー
スに対する活性を有していた。
濾紙、ｐ−ニトロフェニルセロビオシド及びセロビオー
スに対する活性を有していた。
(3)作用pH及び最適pH 作用pH範囲は、３〜１2.５と極めて広範囲にわたる。最
適pHは、５〜７であり、3.５〜１0.５の範囲に於いても
至適pHに於ける活性の５０％以上の相対活性を有してお
り、過去に研究されたセルラーゼの中でも最もアルカリ
側で作用pH範囲が広い酵素と言える（第１図）。
適pHは、５〜７であり、3.５〜１0.５の範囲に於いても
至適pHに於ける活性の５０％以上の相対活性を有してお
り、過去に研究されたセルラーゼの中でも最もアルカリ
側で作用pH範囲が広い酵素と言える（第１図）。
(4)pH安定性 各々のpHで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測定
し、pH安定性を調べた。その結果、pH４〜１０で極めて
安定で失活せず、pH3.５〜１１に於いても、５０％以上
の活性を維持していた。本酵素は、このように高アルカ
リ領域に於いても充分に安定である。（第２図）。
し、pH安定性を調べた。その結果、pH４〜１０で極めて
安定で失活せず、pH3.５〜１１に於いても、５０％以上
の活性を維持していた。本酵素は、このように高アルカ
リ領域に於いても充分に安定である。（第２図）。
(5)最適温度 作用温度は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であつた。又、４５〜７５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた（第
３図）。
温度は６０℃であつた。又、４５〜７５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた（第
３図）。
(6)温度安定性 至適pHに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存活
性を測定した結果、５０℃では安定しており、５５℃に
於いても約５０％の残存活性を有していた（第４図）。
性を測定した結果、５０℃では安定しており、５５℃に
於いても約５０％の残存活性を有していた（第４図）。
(7)分子量 本酵素をセフアデックスＧ−１００（SephadexＧ−１０
０）によるゲル過法に基づき分子量を測定したとこ
ろ、約1.６万に主たるピークが観察された。
０）によるゲル過法に基づき分子量を測定したとこ
ろ、約1.６万に主たるピークが観察された。
(8)金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Al3+，Fe3+，Ba2+，
Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr2+，Cu2+，Fe2+，Hg2+，Mn2+，Mo
2+，Ni2+，Pb2+，Zn2+，Li+，K+，Na+）を活性測定時に
共存させて、その影響を検討した（各種金属イオン濃度
は１mM，K+，Na+は５０mMである）。
Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr2+，Cu2+，Fe2+，Hg2+，Mn2+，Mo
2+，Ni2+，Pb2+，Zn2+，Li+，K+，Na+）を活性測定時に
共存させて、その影響を検討した（各種金属イオン濃度
は１mM，K+，Na+は５０mMである）。
その結果、Hg2+とBa2+で阻害されたが、その他の金属イ
オンについては、ほとんど阻害も活性化も認められなか
った。
オンについては、ほとんど阻害も活性化も認められなか
った。
(9)界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯ
Ｓ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレンセ
カンダリーアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす影響
を調べた。界面活性剤0.０５％溶液で３０℃、１５分間
処理後、活性測定を行つた。その結果、何れの界面活性
剤によつてもほとんど阻害を受けなかった。強力なデタ
ージェントであるソディウム・ドデシルサルフェートに
よつてもほとんど活性の阻害は認められなかつた。
Ｓ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレンセ
カンダリーアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす影響
を調べた。界面活性剤0.０５％溶液で３０℃、１５分間
処理後、活性測定を行つた。その結果、何れの界面活性
剤によつてもほとんど阻害を受けなかった。強力なデタ
ージェントであるソディウム・ドデシルサルフェートに
よつてもほとんど活性の阻害は認められなかつた。
(10)プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電
工）、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノ
ボ社）を、活性測定時に共存（0.１mg／ｍ）させてそ
の影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対して
も、本酵素は強い耐性を有することがわかった。
工）、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノ
ボ社）を、活性測定時に共存（0.１mg／ｍ）させてそ
の影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対して
も、本酵素は強い耐性を有することがわかった。
(11)キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ゼオ
ライト、ＳＴＰＰを活性測定時に１０mM共存させ、その
影響を検討したが、ほとんど阻害は認められなかった。
ライト、ＳＴＰＰを活性測定時に１０mM共存させ、その
影響を検討したが、ほとんど阻害は認められなかった。
本発明のセルラーゼ Ｋ−１６１５は、至適pHを約７に
有するにもかからわず高アルカリのpH１０においても最
適pHの６０％以上の相対活性を有し、pH４〜１０に於て
極めて安定である。また、界面活性剤、プロテアーゼ、
キレート剤等の洗浄剤配合成分によつてもほとんど阻害
を受けない。したがつて、本酵素は洗浄剤組成物の配合
成分として有利に使用することができるものである。
有するにもかからわず高アルカリのpH１０においても最
適pHの６０％以上の相対活性を有し、pH４〜１０に於て
極めて安定である。また、界面活性剤、プロテアーゼ、
キレート剤等の洗浄剤配合成分によつてもほとんど阻害
を受けない。したがつて、本酵素は洗浄剤組成物の配合
成分として有利に使用することができるものである。
また、本発明で用いる菌株、バチルス ズブチリス Ａ
ＨＵ １６１５は中性で生育する菌株であるので、好ア
ルカリ性細菌と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを工
業的に生産することができる。
ＨＵ １６１５は中性で生育する菌株であるので、好ア
ルカリ性細菌と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを工
業的に生産することができる。
以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。
実施例１ 北海道大学農学部菌株保存施設（ＡＨＵ）より分譲を受
けたバチルス ズブチリス ＡＨＵ １６１５ （ＫＳ
Ｍ−１６１５）を減菌生理食塩水に懸濁した後、これを
適当に希釈して下に示す分離用寒天培地（培地１）に塗
布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養し、集落
を形成させたところ、ＣＭＣの溶解に基づく透明帯を形
成した。この集落を下記の液体培地２に接種し、３０℃
で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液に
ついて、pH３〜１３に於けるＣＭＣアーゼ活性を測定
し、セルラーゼ生産性を確認した。
けたバチルス ズブチリス ＡＨＵ １６１５ （ＫＳ
Ｍ−１６１５）を減菌生理食塩水に懸濁した後、これを
適当に希釈して下に示す分離用寒天培地（培地１）に塗
布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養し、集落
を形成させたところ、ＣＭＣの溶解に基づく透明帯を形
成した。この集落を下記の液体培地２に接種し、３０℃
で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液に
ついて、pH３〜１３に於けるＣＭＣアーゼ活性を測定
し、セルラーゼ生産性を確認した。
実施例２ 実施例１においてセルラーゼ生産性の確認された微生物
を液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。
培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を得た。こ
の粗酵素液１に対して、ドライアイス−エタノール中
で３のエタノールを加え、生じた沈殿を遠心分離し更
に凍結乾燥を行ない乾燥粉末としてセルラーゼ Ｋ−１
６１５ ９ｇ（比活性６単位／ｇ；pH９における測定
値，以下同じ）を得た。
を液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。
培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を得た。こ
の粗酵素液１に対して、ドライアイス−エタノール中
で３のエタノールを加え、生じた沈殿を遠心分離し更
に凍結乾燥を行ない乾燥粉末としてセルラーゼ Ｋ−１
６１５ ９ｇ（比活性６単位／ｇ；pH９における測定
値，以下同じ）を得た。
実施例３ 前記液体培地２においてＣＭＣを１％蔗糖に、ポリペプ
トンを７％コーン スチープ リカーに代えた培地を用
い、実施例１に準じて３０℃で２日間振盪培養した。得
られた培養液の遠心分離上清についてそのＣＭＣアーゼ
活性を測定したところ４０単位／であつた。
トンを７％コーン スチープ リカーに代えた培地を用
い、実施例１に準じて３０℃で２日間振盪培養した。得
られた培養液の遠心分離上清についてそのＣＭＣアーゼ
活性を測定したところ４０単位／であつた。
第１図は、酵素反応pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。 第２図は、酵素処理pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。
る。 第２図は、酵素処理pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。
Claims (1)
- 【請求項１】次の酵素学的性質を有するアルカリ耐性セ
ルラーゼ Ｋ−１６１５。 (1)作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース、
紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解
せしめ、グルコース等の還元糖を生成する。 (2)基質特異性 ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル、濾紙、ｐ
−ニトロフェニルセロビオシド及びセロビオースに対す
る活性を有する。 (3)作用pH及び最適pH 作用pH範囲は、３〜１2.５である。最適pHは、５〜７で
あり、3.５〜１0.５の範囲に於いても至適pHに於ける活
性の約５０％以上の相対活性を有する。 (4)pH安定性 pH４〜１０で極めて安定で失活せず、pH3.５〜１１に於
いても、約５０％以上の残存活性を維持する。 (5)最適温度 作用温度は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃である。また、４５〜７５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有している。 (6)分子量 約1.６万に分子量のピークを有する（セフアデックスＧ
−１００を用いたゲル過法による）。 (7)金属イオンの影響 Hg2+、Ba2+で阻害される。 (8)界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
鹸、ポリオキシエチレン セカンダリー アルキルエー
テルは、活性をほとんど阻害しない。 (9)プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 (10)キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＳＴＰＰ、ゼオライト、クエン酸
は活性を阻害しない。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29445886A JPH0630579B2 (ja) | 1986-12-10 | 1986-12-10 | アルカリ耐性セルラ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29445886A JPH0630579B2 (ja) | 1986-12-10 | 1986-12-10 | アルカリ耐性セルラ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63146786A JPS63146786A (ja) | 1988-06-18 |
| JPH0630579B2 true JPH0630579B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=17808042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29445886A Expired - Lifetime JPH0630579B2 (ja) | 1986-12-10 | 1986-12-10 | アルカリ耐性セルラ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630579B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2859393B2 (ja) * | 1990-07-24 | 1999-02-17 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | セルラーゼ及びその製造法 |
| EP0626009B1 (en) * | 1991-12-10 | 1998-11-04 | Kao Corporation | Carboxymethylcellulases and bacillus strains producing same |
-
1986
- 1986-12-10 JP JP29445886A patent/JPH0630579B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63146786A (ja) | 1988-06-18 |
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