JPH0371878B2 - - Google Patents

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JPH0371878B2
JPH0371878B2 JP5764487A JP5764487A JPH0371878B2 JP H0371878 B2 JPH0371878 B2 JP H0371878B2 JP 5764487 A JP5764487 A JP 5764487A JP 5764487 A JP5764487 A JP 5764487A JP H0371878 B2 JPH0371878 B2 JP H0371878B2
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Shuji Kawai
Kazushi Oshino
Hiromi Oogoshi
Susumu Ito
Kikuhiko Okamoto
Hiroshi Mori
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Kao Corp
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Kao Corp
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Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は新規なアルカリセルラーゼ及びこれを
製造する方法に関する。
[従来の技術] 繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バ
イオマス資源、特にセルロース資源の有効利用を
一大目標として進められてきた。セルラーゼ生産
菌として分離されてきた菌株は多種類にわたり、
アスベルギルス属、ペニシリウム属、トリコデル
マ属、フザリウム属、フミコーラ属、アクレモニ
ウム属等の糸状菌を中心に、シユドモナス属、セ
ルロモナス属、ルミノコツカス属、バチルス属等
の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモア
クチノマイセス属等の放線菌でも報告されてい
る。しかしながら、現時点では、バイオマス用セ
ルラーゼの工業的規模での利用は、多くはない。
一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、
衣料用洗浄剤の配合成分としての利用が検討され
注目を集めている(特公昭59−49279号公報、特
公昭60−23158号公報、特公昭60−36240号公報)。
しかし、自然界に於いて、微生物の産生するセル
ラーゼのほとんどが、中性乃至酸性領域に於いて
最大且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若しく
は酸性セルラーゼに分類されるものであつて、衣
料用洗浄剤組成物中に配合するための条件を有す
るセルラーゼ、すなわち、アルカリ領域で最大活
性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有する、所
謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラー
ゼの存在は、極めて少ないのが実情である。ここ
でアルカリセルラーゼとは、至適PHがアルカリ領
域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラーゼと
は、至適PHは中性から酸性領域にあるが、アルカ
リ領域に於いても至適PHに於ける活性に比較して
十分に活性を有しかつ安定性を保持するものを言
う。また、中性とはPH6〜8の範囲を言い、アル
カリ性とはこれより高いPH範囲をいう。
すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において
使用し得るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性
セルラーゼの生産方法としては、好アルカリ性バ
チルス属細菌の培養によりセルラーゼAを採取す
る方法(特公昭50−28515号公報)、セルロモナス
属に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリ
セルラーゼ301−Aを生産する方法(特開昭58−
224686号公報)、好アルカリ性バチルスNo.1139を
培養してカルボシキメチルセルラーゼを生産する
方法(Fukumori、F.、Kudo、T.and
Horikoshi、K.、J.Gen.Microbiol.、131、3339、
(1985))及びストレプトマイセス属の一種を用い
てアルカリセルラーゼを生産する方法(特開昭61
−19483号公報)が報告されているに過ぎず、し
かもいずれも工業的醗酵生産に適うものでは無か
つた。
ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌
の一種であるバチルスエスピー KSM−635
(Bacillus sp.KSM−635)(FERM P−8872)
が衣料用洗浄剤配合成分として適したアルカリセ
ルラーゼKを収率良く生産すること及び更に培養
条件を選択することにより、より生産性が高ま
り、アルカリセルラーゼの工業的醗酵生産が可能
となることを見出した。
[発明が解決しようとする問題点] しかしながら、上記バチルスエスピーKSM−
635の培養条件は、必ずしも工業的に有利なもの
と言えない。すなわち、好アルカリ性菌株は培養
中、PHをアルカリ性に保ち続ける必要があるが、
現在までのところ、好アルカリ性菌株を用いる所
謂アルカリ性醗酵法の歴史は浅く、通常の中性微
生物と比較するとこれら好アルカリ性微生物の生
理、生化学についての知見は充分に蓄積されてお
らず、工業的醗酵生産を行うにあたつての培地調
製、培養方法が操作上の難点となつていた。
更に、前述した報告例のうち、至適PHがアルカ
リ領域にある本来のアルカリセルラーゼとして
は、バチルス N1菌株、N2菌株、N3菌株(特
公昭50−28515号公報)の生産する、至適PHがそ
れぞれ8〜9、9、8〜9の酵素、バチルスNo.
1139の産生する、至適PH9のもの及びバチルスエ
スピー KSM−635の産生する至適PH10のアルカ
リセルラーゼK(特願昭61−257776号)が存在す
るが、更に洗浄剤組成物に配合し用いることので
きる至適PHがアルカリ側にあり、かつその作用PH
範囲の広いアルカリセルラーゼの提供が求められ
ていた。
[問題点を解決するための手段] 斯る実情において本発明者らは中性培地で生育
し、しかも作用の優れたアルカリセルラーゼを産
生することのできる菌株を得べく種々研究をおこ
なつた。
かかる問題点を解決するには、中性領域で生育
する菌株を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝
子をクローニングする、所謂遺伝子組換えの手法
を取ることも可能であるが、アルカリ領域に至適
PHを有するアルカリセルラーゼを生産する中微生
物を自然界に探索し、これを分離することがより
有効である。しかして、本発明者らは上記微生物
を自然界に求めた結果、一群のバチルス属に属す
る微生物は中性培地において生育するにもかかわ
らず、一定のアルカリセルラーゼを産生すること
を見出し、本発明を完成した。
本発明のアルカリセルラーゼの代表的なものと
しては、次の酵素学的性質、 (1) PH7〜10の広い至適PH範囲を有し、その最適
PH10近傍である。
(2) Hg2+の存在により、その活性が阻害され、
Ca2+の存在により活性化される。
(3) プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤で
ほとんどその活性は阻害されない。
(4) CMCアーゼ活性(Cx活性)を主活性とし、
濾紙崩壊活性やアビセラーゼ活性(C1活性)
をも有する。
(5) 分子量 約3.1万(セフアデツクスG100を用いるゲル
濾過法による)。
を有するアルカリセルラーゼが挙げられる。
本発明のアルカリセルラーゼを産生する微生物
の例としては、本発明者が栃木県芳賀郡の土壌よ
り分離し、工業技術院微生物工業技術研究所へ寄
託した、バチルスエスビーKSM−521(FERM
P−9009)が挙げられる。
この菌株は、下に示すような菌学的性質を示
す。なお、菌株の分類には、次に示す1〜25の培
地を用いた。(表示は、質量%) 培地1 肉エキス、1.0;バクトペプトン、1.0;
NaCl、0.5;バクト寒天、1.5(PH7.2) 培地2 肉エキス、1.0;バクトペプトン、1.0;
NaCl、0.5;(PH7.2) 培地3 肉エキス、1.0;バクトペプトン、1.0;
NaCl、0.5;ゼラチン、1.0(PH7.2) 培地4 バクトリトマスミルク、10.0 培地5 バクトペプトン、1.0;KNO3、0.1 培地6 バクトペプトン、1.0;NaNO3、1.0 培地7 バクトペプトン、0.7;NaCl、0.5;ブド
ウ糖、0.5(PH7.0) 培地8 バクトペプトン、1.0 培地9 TSI寒天(栄研化学製):指示量 培地10 肉エキス、1.0;バクトペプトン、1.0;
NaCl、0.5;可溶性澱粉、0.2;寒天、1.5 培地11 NaNH4HPO4・4H2O、0.15;KH2PO4
0.1;MgSO4・7H2O、0.02;クエン酸ナトリウ
ム、0.25(PH6.8) 培地12 クリステンセン(Christensen)培地
(栄研化学製):指示量 培地13 ブドウ糖、1.0;KH2PO4、0.1;
MgSO4・7H2O、0.05;KCl、0.02;窒素源、
0.1(PH7.2)窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫
酸アンモニウムを用いた。
培地14 キングA培地“栄研”(栄研化学製):指
示量 培地15 キングB培地“栄研”(栄研化学製):指
示量 培地16 尿素培地“栄研”(栄研化学製):指示量 培地17 チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙
(日水製薬製) 培地18 3%過酸化水素水 培地19 OF基礎培地(Difco社製):指示量 培地20 (NH42HPO4、0.1;KCl、0.02;
MgSO4・7H2O、0.02;酵母エキス、0.02;バ
クト寒天、2.0;BCP(0.2%溶液)、0.4 培地21 バクト・サブロー・デキストロース寒天
培地(Difco社製):指示量 培地22 肉エキス、0.3;バクトペプトン、0.5;
酵母エキス、1.0;グリセリン、2.0 培地23 フエニルアラニンマロン酸塩培地(日水
製薬社製):指示量 培地24 スキムミルク、5.0;バクト寒天、1.5 培地25 肉エキス、0.3;バクトぺプトン、0.5;
L−チロシン、0.5;バクト寒天、1.5 (菌学的性質) (a) 顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、0.6〜0.8μm×1.0〜2.0μm
の桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形
の内生胞子(0.4〜0.8μm×1.0〜2.0μm)を作
る。周鞭毛を有し運動性がある。グラム染色は
陽性。抗酸性はない。
(b) 各種培地に於ける生育状態 肉汁寒天平板培養(培地1) 良く生育す。集落の形状は円形であり、表
面は円滑、周縁は円滑又は葉状である。又、
集落の色調は淡黄色半透明で光沢がある。
肉汁寒天斜面培養(培地1) 生育する。その状態は拡布状で光沢が有
り、淡黄色半透明である。
肉汁液体培養(培地2) 生育し混濁する。
肉汁ゼラチン穿刺培養(培地3) 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認めら
れる。
リトマスミルク培地(培地4) ミルクの液化が認められ、リトマスの変色
は認められない。
(c) 生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応(培地5、6) 共に、陰性。
MRテスト(培地7) 陽性。
VPテスト(培地7) 陽性。
インドールの生成(培地8) 陰性。
硫化水素の生成(培地9) 陰性。
澱粉の加水分解(培地10) 陰性。
クエン酸の利用(培地11、12) クリステンセン培地で陽性、コーサ培地で
は陰性か陽性か特定できない。
無機窒素源の利用(培地13) 硝酸塩、アンモニウム塩ともに陰性。
色素の生成(培地14、15) 陽性。
ウレアーゼ(培地16) 陰性。
オキシダーゼ(培地17) 陰性、陽性は、はつきりせず。
カタラーゼ(培地18) 陽性。
生育の範囲(培地2) 生育の温度範囲は10〜50℃で、生育最適温
度範囲は20〜40℃である。生育のPH範囲はPH
5〜10、生育最適PH範囲はPH6〜10である。
酸素に対する態度 好気性。
O−Fテスト(培地19) 酸化。
糖類からの酸及びガスの生成(培地20) (+:生成、−:生成せず) 酸の生成 ガスの生成 1 L−アラビノース + − 2 D−キシロース + − 3 D−グルコース + − 4 D−マンノース + − 5 クラクトース + − 6 D−ガラクトース + − 7 麦芽糖 − − 8 シヨ糖 + − 9 乳糖 − − 10 トレハロース + − 11 D−ソルビツト − − 12 D−マンニツト + − 13 イノシツト − − 14 グリセリン + − 15 デンプン − − (17) VP培地に於けるPH(培地7) PH5.0 (18) 食塩含有培地に於ける生育(培地1を改
変) 5%、7%および10%NaCl存在中でいず
れも生育する。
(19) PH5.7に於ける生育(培地21) 生育する。
(20) ジハイドロキシアセトンの生成(培地
22) 陰性。
フエニルアラニンの脱アミノ化(培地23) 陰性。
カゼインの分解(培地24) 陽性。
チロシンの分解(培地25) 陰性。
以上の分類学的考察から判断して、KSM−521
株は容易に有胞子桿菌であるバチルス
(Bacillus)属の一種であると認められる。
そして更に、菌学的性質について、バージー
ズ・マニユアル・オブ・デイタミネイテイブ・バ
クテリオロジー(Bergey′s Mannual of
Determinative Bacteriology)第8版及びザ・
ジーナス・バチルス(“The Genus Bacillus”
Ruth、E.Gordon Agriculture Hand−book No.
427、Agricultural Research Service、U.S.
Department of Agriculture Washington D.C.、
(1973))を参照し比較、検索すると、この菌株
は、最近、掘越と秋葉(“Alkalophilic
Microorganism”、Japan Scientific Society
Press(Tokyo)、1982年刊)の主張をしている、
所謂好アルカリ性(Alkalophilic)微生物、すな
わちPH8以上のアルカリ培地に於いて生育し、こ
れ以下の中性PH領域では生育出来ない微生物に属
するものでなく、弱酸性領域からアルカリ領域
(PH5〜10)に於いて生育可能な、一般的な中性
で生育するバチルス属微生物と判断できる。
更にこの菌株を他の公知のバチルス属の菌株と
比較すると、最も類縁の種としてバチルス・プミ
ルス(Bacillus pumilus)が挙げられる。しかし
ながら、公知のバチルス・プミルスに属する菌株
と本菌株とを比較すると、上記公知菌株は少なく
ともアルカリセルラーゼを産生しないので、本菌
株は新菌株と判断される。
上記したような菌株を用いて本発明のアルカリ
セルラーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常
法に従つて培養すれば良い。培地中には、資化し
得る炭素源及び窒素源を適用量含有せしめておく
ことが好ましい。この炭素源及び窒素源について
は特に制限はないが、その例としては、窒素源と
してコーングルテンミール、大豆粉、コーンスチ
ーブリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フアーマ
メデイア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、
ハイプロ、アジパワー、コーンソイビーンミー
ル、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミ
フレツクス及びアジプロン、ゼスト、アジツクス
などが挙げられる。又、炭素源としては、籾殻、
麩、濾紙、一般紙類、おが屑等の植物繊維質、廃
糖蜜、転化糖、CMC、アビセル、セルロース綿、
キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、
例えば、アラビノース、グルコース、マンノー
ス、クラクトース、麦芽糖、シヨ糖、マンニツ
ト、ソルビツト、イノシツト、グリセリン、可溶
性デンプンや資化し得る有機酸、例えば、クエン
酸や酢酸などが挙げられる。また、その他、リン
酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Na+
K+等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微
量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
斯くして得られた培養物中からの目的物質であ
るアルカリセルラーゼの採取及び精製は、一般の
酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことがで
きる。即ち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分
離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液
を得ることができる。この粗酵素液は、そのまま
使用することもできるが、必要に応じて、塩析
法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗酵
素を得、更に公知の方法により精製結晶化して、
精製酵素として使用することも可能である。
斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼ
の代表的なものとしては、アルカリセルラーゼK
−521と命名されたものが挙げられ、以下このも
のを例に取り本発明を更に説明する。
なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従つて
行い、次の緩衝液を用いた。
PH3〜8 マクルベイン緩衝液 PH8〜11 グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 PH12〜13塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性側定法: (1) CMCアーゼ活性 10mgCMC(A−01L、山陽国策パルプ社)、
100μmol各種緩衝液(マクルベイン、リン酸、
グリシン−NaOH等)を含む基質溶液0.9mlに
0.1mlの酵素溶液を加え、30℃、20分反応した、
反応後、3、5−ジニトロ−サリチル酸(3,
5−dinitro−salicylic acid(DNS))法にて還
元糖の定量を行つた。すなわち、反応液、1.0
mlにDNS試薬1.0mlを加え、5分間、100℃で
加熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を
加えて希釈した。これを波長535nmで比色定
量した。酵素力価は、上記の条件下で1分間に
1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成す
る酵素量を1単位とした。
(2) p−ニトロフエニルセロビオシド分解活性 0.1μmolp−ニトロフエニルセロビオシド
(シグマ社)、100μmolリン酸緩衝液(PH7.0)
を含む反応液1.0ml中に適当量の酵素液を30℃
で作用させた後、1M Na2CO3を0.3ml、脱イオ
ン水を1.7ml順次加え、遊離するp−ニトロフ
エノールを40nmで比色定量した。酵素力価
は、上記の条件下で1分間に1μmolのp−ニト
ロフエノールを遊離させる酵素量を1単位とし
た。
(3) アビセル、セルロース粉末、及び濾紙分解活
性 20mgアビセル(メルク社)、200μmolリン酸
緩衝液(PH7.0)を含む反応液2.0ml中に適当量
の酵素液を加え、30℃、250rpmで振とうしな
がら作用させた。反応後、冷却遠心分離(5
℃、3000rpm、20分)を行い、その上清1.0ml
を3,5−ジニトロ−サリチル酸(3,5−
dinitro−salicylic acid(DNS))法にて還元糖
の定量を行つた。セルロース粉末分解活性はセ
ルロース粉末(東洋濾紙社)を、濾紙分解活性
は濾紙(セルラーゼ活性度検定用濾紙、東洋No.
51−特を用い、アビセラーゼ活性の時と同様に
行つた。酵素力価は、上記の条件下で1分間に
1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成す
る酵素量を1単位とした。
(4) セロビアーゼ活性 10mgセロビオース(関東化学社)、100μmol
リン酸緩衝液(PH7.0)を含む反応液1.0ml内に
適当量の酵素液を30℃で作用させた後、100℃、
2分間処理して酵素を失活させた後、生成グル
コース量をムロターゼ・GOD法(Glucose C
−Test、和光純薬工業社)で測定した。酵素
力価は、上記の条件下で1分間に2μmolのグル
コースを生成する酵素量を1単位とした。
(酵素学的性質) (1) 作用 CMC、セルロース粉末、濾紙、アビセル等
の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、
グルコース等の還元糖を生成する。
(2) 基質特異性 本酵素は、CMCのほかにも、セルロース粉
末、アビセル、濾紙及びp−ニトロフエニルセ
ロビオシド、セルビオースに対する活性を有し
ていた。
(3) 作用PH及び至適PH 作用PH範囲は、3〜12.5と極めて広範囲であ
つた。最適PHは、7〜10と幅広く、PH4.5〜
10.5の範囲に於いても至適PHに於ける活性の50
%以上の相対活性を有しており、従つて過去に
研究されたアルカリセルラーゼの中でも最もア
ルカリ側で充分活性が発揮される酵素と言える
(第1図)。
(4) PH安定性 各々のPHで30℃、1時間保持した後の残存活
性を測定し、PH安定性を調べた。その結果、PH
5〜12で極めて安定で失活せず、PH4.5〜12.5
に於いても、約50%以上の活性を維持してい
た。本酵素は、このように高アルカリ領域に於
いても充分に安定である(第2図)。
(5) 最適温度 作用温度は、15〜80℃の広範囲にわたり、そ
の至適温度は60℃であつた。又、45〜65℃の範
囲に於いても、至適温度での活性の50%以上を
有していた。(第3図)。
(6) 温度安定性 至適PHに於いて、30分間各温度で処理した
後、残存活性を測定した結果、40℃では安定し
ており、55℃に於いても約50%の残存活性を有
していた(第4図)。
(7) 分子量 本酵素をセフアデツクスG−100(Sephadex
G−100)によるゲル濾過法に基づき分子量を
測定したところ、約3.1万であつた。
(8) 金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン(Al3+
Fe3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr2+
Cu2+、Fe2+、Hg2+、Mn2+、Mo2+、Ni2+
Pb2+、Zn2+、Li+、K+、Na+)を活性測定時に
共存させて、その影響を検討した(K+、Na+
については濃度を50mMとし、他のイオンにつ
いては、1mMとした)。その結果、Hg2+で阻
害が、Ca2+により活性化が認められた。
(9) 界面活性剤の影響 各種界面活性剤(例えば直鎖アルキルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム(LAS)、アルキル硫
酸ナトリウム(AS)、ポリオキシエチレンアル
キルエーテルスルホン酸ナトリウム(ES)、α
−オレフインスルホン酸ナトリウム(AOS)、
α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウム(α
−SFE)、アルカンスルホン酸ナトリウム
(SAS)、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダ
リアルキルエーテル)の酵素活性に及ぼす影響
を調べた。本酵素を界面活性剤0.05%溶液で30
℃、15分間処理後、活性測定を行つた。その結
果、何れの界面活性剤によつてもほとんど阻害
を受けなかつた。強力なデタージエントである
ソデイウム・ドデシルサルフエートによつても
活性の阻害は認められなかつた。
(10) プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばAPI−21(昭和
電工)、マクサターゼ(ギスト社)及びアルカ
ラーゼ(ノボ社)を、活性測定時に共存(0.1
mg/ml)させてその影響を調べたところ、何れ
のプロテアーゼに対しても強い耐性を有するこ
とがわかつた。
(11) キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA、EGTA、トリポ
リリン酸ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性
測定時に共存させ、その影響を検討したが、ほ
とんど阻害は認められなかつた。
[発明の効果] 本発明のアルカリセルラーゼは、従来のアルカ
リセルラーゼに比較して高アルカリ側(PH10)に
最適PHを有している。その上、PH7.0〜10の広範
囲に於いて、至適PHを有しており、更に広い範囲
に於いて極めて安定である。
また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤
等の洗浄剤配合成分によつてもほとんど阻害を受
けない。したがつて、本酵素は洗浄剤組成物の配
合成分として有利に使用することができるもので
ある。
更に、本発明の微生物は中性で生育するので、
好アルカリ性菌株と比べ容易にアルカリセルラー
ゼを工業的に生産することができる。
[実施例] 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
する。
実施例 1 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯(約0.5
g)、滅菌生理食塩水に懸濁し、80℃で10分間熱
処理した。この熱処理液の上清を適当に希釈し
て、分離用寒天培地(培地1)に塗布した。次い
で、これを30℃にて3日間培養し、集落を形成さ
せた。集約の周囲にCMCの溶解に基ずく透明帯
を形成するものを選出し、CMCアーゼ生産菌を
取得した。更に、取得菌を液体培地(培地2)に
接種し、30℃で3日間振とう培養した。培養後、
遠心分離した上清液についてCMCアーゼ活性を、
PH3〜13にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。
上述の方法により、本発明のKSM−521株
(FERM P−9009)を取得することが出来た。
培地1 CMC 2% ポリペプトン 0.5% 酵母エキス 0.05% KH2PO4 0.1% Na2HPO4・12H2O 0.25% MgSO4・7H2O 0.02%寒 天 0.75 PH6.8 培地2 CMC 1% ポリペプトン 1% 酵母エキス 0.5% KH2PO4 0.1% Na2HPO4・12H2O 0.25%MgSO4・7H2O 0.02% PH6.8 実施例 2 実施例1で得たバチルスエスピー KSM−521
株を同実施例の液体培地2に接種し、30℃で3日
間振とう培養した。培養後、菌体を遠心分離して
除き、粗酵素液を得た。この粗酵素液1に対し
てドライアイス−エタノール中で、3のエタノ
ールを加え、生じた沈澱を遠心分離し、更に凍結
乾燥を行い、乾燥粉末として、アルカリセルラー
ゼK−521(比活性*20単位/g)9gを得た。
*酵素活性はPH9に於ける測定値である(以下
同じ)。
実施例 3 CMCを1%シヨ糖に代え、ポリペプトンを7
%CSLに代える以外は実施例1の液体培地2と同
じ組成の培地にKSM−521株を接種し、30℃で2
日間振とう培養した。この培養物を遠心分離し、
得られた上清のCMCアーゼ活性を測定したとこ
ろ100単位/であつた。
【図面の簡単な説明】
第1図は、アルカリセルラーゼK−521の酵素
反応PHと相対活性の関係を示す図面である。第2
図は、同酵素の処理PHと相対活性の関係を示す図
面である。第3図は、同酵素の反応温度と相対活
性の関係を示す図面である。第4図は、同酵素の
処理温度と相対活性の関係を示す図面である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 バチルス属に属し、中性培地で生育する微生
    物の生産する、次の酵素学的性質を有するアルカ
    リセルラーゼ。 (1) PH7〜10の広い至適PH範囲を有し、その最適
    PHはPH10近傍である。 (2) Hg2+の存在により、その活性が阻害され、
    Ca2+の存在により活性化される。 (3) プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤で
    ほとんどその活性は阻害されない。 (4) CMCアーゼ活性を主活性とし、濾紙崩壊活
    性、アビセラーゼ活性(C1活性)をも有する。 (5) 分子量 約3.1万(セフアデツクスG100を用いるゲル
    濾過法による)。 2 アルカリセルラーゼが次の酵素学的性質を有
    し、K−521と命名されたものである特許請求の
    範囲第1項記載のアルカリセルラーゼ。 (1) 作用 カルボキシメチルセルロース、セルロース、
    濾紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これ
    らを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を生成
    する。 (2) 基質特異性 CMCの他にも、セルロース粉末、アビセル、
    濾紙及びp−ニトロフエニルセロビオシド、セ
    ロビオースに対する活性を有する。 (3) 作用PH及び至適PH 作用PH範囲は、3〜12.5である。最適PHは、
    7〜10であり、4.5〜10.5の範囲に於いても至
    適PHに於ける活性の50%以上の相対活性を有す
    る。 (4) PH安定性 PH5〜12で極めて安定で失活せず、PH4.5〜
    12.5に於いても、約50%以上の活性を維持す
    る。 (5) 最適温度 作用温度は、15〜80℃の広範囲にわたり、そ
    の至適範囲は60℃である。又、45〜65℃の範囲
    に於いても、至適温度での活性の50%以上を有
    する。 (6) 分子量 約3.1万(セフアデツクスG100を用いるゲル
    濾過法による)。 (7) 金属イオンの影響 Hg2+により阻害され、Ca2+で活性化される。 (8) 界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウ
    ム、アルキル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチ
    レンアルキルエーテルスルホン酸ナトリウム、
    α−オレフインスルホン酸ナトリウム、α−ス
    ルホン化脂肪酸エステルナトリウム、アルカン
    スルホン酸ナトリウム、石鹸、ポリオキシエチ
    レンセカンダリーアルキルエーテルはほとんど
    活性を阻害しない。 (9) プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 (10) キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸、トリポリリン
    酸ソーダ、ゼオライトは活性を阻害しない。 3 バチルス属に属し、中性培地で生育するアル
    カリセルラーゼ生産菌を培養し、その培養物か
    ら、アルカリセルラーゼを採取することを特徴と
    する次の酵素学的性質を有するアルカリセルラー
    ゼの製造法。 (1) PH7〜10の広い至適PH範囲を有し、その最適
    PH10近傍である。 (2) Hg2+の存在により、その活性が阻害され、
    Ca2+の存在により活性化される。 (3) プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤で
    ほとんどその活性は阻害されない。 (4) CMCアーゼ活性を主活性とし、濾紙崩壊活
    性、アビセラーゼ活性(C1活性)をも有する。 (5) 分子量 約3.1万(セフアデツクスG100を用いるゲル
    濾過法による)。
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