JP2651576B2 - アルカリセルラーゼｅ−▲ｉｉ▼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼに関する。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマ
ス資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標とし
て進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて
きた菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシ
リウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ
属、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウドモ
ナス属、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス
属等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアク
チノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかし
ながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的
規模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用
洗浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めて
いる（特公昭59−49279号公報、特公昭60−23158号公
報、特公昭60−36240号公報）。しかし、自然界に於い
て、微生物の産生するセルラーゼのほとんどが、中性乃
至酸性領域に於いて最大且つ安定な酸素活性を示す、所
調中性若しくは酸性セルラーゼに分類されるものであっ
て、衣料用洗浄剤組成物中に配合するための条件を有す
るセルラーゼ、すなわち、アルカリ領域で最大活性を示
すか、あるいはアルカリ耐性を有する、所謂アルカリセ
ルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は、極めて
少ないのが実情である。ここでアルカリセルラーゼと
は、至適pHがアルカリ領域にあるものを言い、アルカリ
耐性セルラーゼとは、至適pHは中性から酸性領域にある
が、アルカリ領域に於いても至適pHに於ける活性に比較
して十分に活性を有しかつ安定性を保持するものを言
う。また、中性とはpH6〜８の範囲を言い、アルカリ性
とはこれより高いpH範囲をいう。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し
得るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの
生産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養
によりセルラーゼＡを採取する方法（特公昭50−28515
号公報）、セルロモナス属に属するアルカリ性細菌を培
養してアルカリセルラーゼ301−Ａを生産する方法（特
開昭58−224686号公報）、好アルカリ性バチルスNo.113
9を培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方
法（Fukumori,F.,Kudo,T.and Horikoshi,K.,J.Gen.Micr
obiol.,131,3339,（1985））及びストレプトマイセス属
の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特
開昭61−19483号公報）が報告されているに過ぎず、し
かもいずれも工業的醗酵生産に適うものでは無かった。

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一種
であるバチルス・エスピーKSM−635（Bacillus sp.KSM
−635）（FERM P−8872）が衣料用洗浄剤配合成分とし
て適したアルカリセルラーゼＫを収率良く生産すること
及び更に培養条件を選択することにより、より生産性が
高まり、アルカリセルラーゼの工業的醗酵生産が可能と
なることを見出した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記バチルス・エスピーKSM−635の培
養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない。す
なわち、好アルカリ性菌株は培養中、pHをアルカリ性に
保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好アルカ
リ性菌株を用いる所謂アルカリ性醗酵法の歴史は浅く、
通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ性微生
物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積されてお
らず、工業的醗酵生産を行うにあたっての培地調製、培
養方法が操作上の難点となっていた。

更に、前述した報告例のうち、至適pHがアルカリ領域
にある本来のアルカリセルラーゼとしては、バチルス
N1菌株、N2菌株、N3菌株（特公昭50−28515号公報）の
生産する、至適pHがそれぞれ８〜９、９、８〜９の酵
素、バチルス No.1139の産生する、至適pH9のもの及び
バチルス・エスピーKSM−635の産生する至適pH10のアル
カリセルラーゼＫ（特願昭61−257776号）が存在する
が、更に洗浄剤組成物に配合し用いることのできる至適
pHがアルカリ側にあり、かつその作用pH範囲の広いアル
カリセルラーゼの提供が求められていた。

〔問題点を解決するための手段〕

斯る実情において本発明者らは中性培地で生育し、し
かも作用の優れたアルカリセルラーゼを産生することの
できる菌株を得べく種々研究をおこなった。

かかる問題点を解決するには、中性領域で生育する菌
株を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニ
ングする、所謂遺伝子組換えの手法を取ることも可能で
あるが、アルカリ領域に至適pHを有するアルカリセルラ
ーゼを生産する中性微生物を自然界に探索し、これを分
離することがより有効である。しかして、本発明者らは
上記微生物を自然界に求めた結果、一群のバチルス属に
属する微生物は中性培地において生育するにもかかわら
ず一定のアルカリセルラーゼを産生することを見出し
た。

これらのうち、栃木県日光市の土壌より採取したバチ
ルス属に属する微生物（バチルス・エスピーKSM−522
（FERM Ｐ−9370））は衣料用洗浄剤組成物の添加成分
として有効な新規アルカリセルラーゼＫ−522を生産す
ること及び該アルカリセルラーゼを更に精製するとその
主成分として新規なアルカリセルラーゼＥ−II及びＥ−
IIIが得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は新規酵素アルカリセルラーゼＥ−
IIを提供するものである。

本発明のアルカリセルラーゼＥ−IIの製造において用
いられる微生物は、次の様な菌学的性質を示す。なお、
菌株の分類には、次に示す１〜22の培地を用いた（表示
は、重量％）。

培地 1.肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.0;NaCl,0.5;
バクト寒天,1.5（pH7.2） 培地 2.肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.0;NaCl,0.5
（pH7.2） 培地 3.肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.0;NaCl,0.5;
ゼラチン,1.0（pH7.2） 培地 4.バクトリトマスミルク,10.0 培地 5.バクトペプトン,1.0;KNO₃,0.1 培地 6.バクトペプトン,1.0;NaNO₃,0.1 培地 7.バクトペプトン,0.7;NaCl,0.5;ブドウ糖,0.5
（pH7.0） 培地 8.バクトペプトン,1.0 培地 9.TSI寒天（栄研化学製）：指示量 培地10.肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.0;NaCl,0.5;可
溶性澱粉,0.2;寒天,1.5 培地11.NaNH₄HPO₄・4H₂O,0.15;KH₂PO₄,0.1;MgSO₄・7H
₂O,0.02;クエン酸ナトリウム,0.25（pH6.8） 培地12.クリステンセン（Christensen）培地（栄研化学
製）：指示量 培地13.ブドウ糖,1.0;KH₂PO₄,0.1;MgSO₄・7H₂O,0.05;KC
l,0.02;窒素源,0.1（pH7.2） 窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムを用い
た 培地14.キングＡ培地“栄研”（栄研化学製）：指示量 培地15.キングＢ培地“栄研”（栄研化学製）：指示量 培地16.尿素培地“栄研”（栄研化学製）：指示量 培地17.チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬製） 培地18.3％過酸化水素水 培地19.OF基礎培地（Difco社製）：指示量 培地20.（NH₄）₂HPO₄,0.1;KCl,0.02;MgSO₄・7H₂O,0.02;
酵母エキス,0.02;バクト寒天,2.0;BCP（0.2％溶液）,0.
4 培地21.バクト・サブロー・デキストロース寒天培地（D
ifco社製）：指示量 培地22.スキムミルク,5.0;バクト寒天,1.5 （菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、0.5〜0.8μｍ×1.0〜2.0μｍの桿菌
であり、菌体の中央準備に卵円形または円柱形の内生胞
子（0.5〜0.8μｍ×1.0〜1.2μｍ）を作る。周鞭毛を有
し運動性がある。グラム染色は陽性。抗酸性はない。

（ｂ）各種培地に於ける生育状態 肉汁寒天平板培養（培地１） 良く生育する。集落の形状は円形であり、表面は粗
造、周縁は円滑又は波状である。又、集落の色調は淡黄
色半透明で硬度は脂状である。

肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色又
は、淡黄色で半透明である。

肉汁液体培養（培地２） 生育し混濁する。

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 上層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。

リトマスミルク培地（培地４） ミルクの液化が認められるが、リトマスの変色は認め
られない。

（ｃ）生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地5,6） 共に陰性。

MRテスト（培地７） 陽性。

VPテスト（培地７） 陽性。

インドールの生成（培地８） 陰性。

硫化水素の生成（培地９） 陰性。

澱粉の加水分解（培地10） 陰性。

クエン酸の利用（培地11,12） クリステンセン培地で陽性、コーサ培地では陰性か陽
性か特定できない。

無機窒素源の利用（培地13） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに陰性。

色素の生成（培地14,15） キングＢ培地で水溶性の黄色色素を生成する。

ウレアーゼ（培地16） 陰性。

オキシダーゼ（培地17） 陰性、陽性ははっきりせず。

カタラーゼ（培地18） 陽性。

生育の範囲（培地２） 生育の温度範囲は10〜50℃で、生育最適温度範囲は20
〜40℃である。

生育のpH範囲は５〜10で、生育最適pH範囲はpH6〜10
である。

酸素に対する態度 好気性。

Ｏ−Ｆテスト（培地19） 酸化。

糖類からの酸及びガスの生成（培地20） （＋：生成、−：生成せず） 酸の生成 ガスの生成 1. Ｌ−アラビノース ＋ − 2. Ｄ−キシロース ＋ − 3. Ｄ−グルコース ＋ − 4. Ｄ−マンノース ＋ − 5. フラクトース ＋ − 6. Ｄ−ガラクトース ＋ − 7.麦芽糖 − − 8.ショ糖 ＋ − 酸の生成 ガスの生成 9. 乳糖 − − 10. トレハロース ＋ − 11. Ｄ−ソルビット − − 12. Ｄ−マンニット ＋ − 13. イノシット − − 14. グリセリン ＋ − 15. デンプン − − VP培地に於けるpH（培地７） pH5.0〜5.2（７日目）。

食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） ５％,7％および10％NaCl存在中でいずれも生育する。

pH5.7に於ける生育（培地21） 生育する。

カゼインの分解（培地22） 陽性。

以上の分類学的考察から判断して、KSM−522株は容易
に有胞子桿菌であるバチルス（Bacillus）属の一種であ
ると認められる。そして更に、菌学的性質について、バ
ージーズ・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バ
クテリオロジー（Bergey's Mannual of Determinative
Bacteriology）第８版及びザ・ジーナス・バチルス
（“The Genus Bacillus"Ruth,E.Gordon Agriculture H
and−book No.427,Agricultural Research Service,U.
S.Department of Agriculture Washington D.C.,（197
3））を参照し比較、検索すると、この菌株は、最近、
掘越と秋葉（“Alkalophilic Microorganisms",Japan S
cientific Society Press（Tokyo）,1982年刊）の主張
している、所謂好アルカリ性（Alkalophilic）微生物、
すなわちpH8以上のアルカリ培地に於いて生育し、これ
以下の中性pH領域では生育出来ない微生物に属するもの
でなく、弱酸性領域からアルカリ領域（pH5〜10）に於
いて生育可能な、一般的な中性で生育するバチルス属微
生物と判断できる。

更にこの菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較す
ると、最も類縁の種としてバチルス・プミルス（Bacill
us pumilus）が挙げられる。しかしながら、公知のバチ
ルス・プミルスに属する菌株は、少なくともアルカリセ
ルラーゼを産生しないので、本菌株は新菌株と判断され
る。

上記したような菌株を用いて本発明のアルカリセルラ
ーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培
養すれば良い。培地中には、資化し得る炭素源及び窒素
源を適当量含有せしめておくことが好ましい。この炭素
源及び窒素源については特に制限はないが、その例とし
ては、窒素源としてコーングルテンミール、大豆粉、コ
ーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファー
マメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイ
プロ、アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー
粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジ
プロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。又、炭
素源としては、籾殻、麸、濾紙、一般紙類、おが屑等の
植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、CMC、アビセル、セルロ
ース綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素
源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、
マンノース、フラクトース、ガラクトース、ショ糖、ト
レハロース、マンニット、グリセリンや、資化し得る有
機酸、例えば、クエン酸や酢酸などが挙げられる。ま
た、その他、リン酸、Hg²⁺,Ca²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Na⁺,K
⁺等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源
を培地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアル
カリセルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分
離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養液
から除去して粗酵素液を得ることができる。この粗酵素
液は、そのまま使用することもできるが、必要に応じ
て、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノール、
エタノール、イソプロパノール等）によって蛋白を沈澱
させたり、又、限外濾過（例えばダイアフローメンプレ
ンYC、アミコン社製）により濃縮させてアルカリセルラ
ーゼＫ−522を得る。塩析法では例えば、硫安（30〜70
％飽和画分）、溶媒沈澱では例えば、75％エタノール中
で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩する
ことによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能であ
る。脱塩の方法としては透析又はセフアデックスＧ−25
（ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法等の一般的
方法が用いられる。

更にこのアルカリセルラーゼＫ−522からアルカリセ
ルラーゼＥ−IIを得るには、例えばヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィー;DETA−セファデックス（ファル
マシア社製）、DETA−セルロース等によるイオン交換ク
ロマトグラフィー；セファデックス、バイオゲル（バイ
オラッドラボラトリーズ社製）等による分子篩ゲルクロ
マトグラフィー等を適宜組み合わせて分別精製すれば良
い。

斯して得られた本発明のアルカリセルラーゼＥ−II
は、以下に示す酵素学的性質を有する。

なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行い、
次の緩衝液を用いた。

pH3〜８マクルベイン緩衝液 pH8〜11グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH12〜13塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法： （１）CMCアーゼ活性 10mgCMC（Ａ−01L,山陽国索パルプ社）、100μmol各
種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリシン−NaOH等）
を含む基質溶液0.9mlに0.1mlの酵素溶液を加え、30℃、
20分反応した。反応後、3,5−ジニトローサリチル酸
（3,5−dinitro−salicylic acid（DNS））法にて還元
糖の定量を行った。すなわち、反応液、1.0mlにDNS試薬
1.0mlを加え、５分間、100℃で加熱発色させ、冷却後、
4.0mlの脱イオン水を加えて希釈した。これを波長535nm
で比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に
１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位とした。

（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性0.1μm
ol p−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社）、100
μmolグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）を含む反応液1.0m
l中に適当量の酵素液を30℃で作用させた後、1M Na₂CO₃
を0.3ml、脱イオン水を1.7ml順次加え、遊離するｐ−ニ
トロフェノールを400nmで比色定量した。酵素力価は、
上記の条件下で１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノー
ルを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロー
ス、アルカリ膨潤セルロース及び濾紙分解活性 15mgアビセル（メルク社）、150μmolグリシン−NaOH
緩衝液（pH9.0）を含む反応液1.5ml中に適当量の酵素液
を加え、30℃、280rpmで振とうしながら作用させた。反
応後、冷却遠心分離（５℃、3000rpm,20分）を行い、そ
の上清1.0mlを3,5−ジニトローサリチル酸（3,5−dinit
ro−salicylicacid（DNS））法にて還元糖の定量を行っ
た。セルロース粉末分解活性はセルロース粉末（東洋濾
紙社）を、リン酸膨潤セルロース分解活性、アルカリ膨
潤セルロース分解活性はトミタらの方法（Tomita,Y.et
al:J.Ferment.Technol.;52,235,1974）により処理し
たセルロースを、濾紙分解活性は濾紙（セルラーゼ活性
度検定用濾紙、東洋No.51−特）を用い、アビセラーゼ
活性の時と同様に行った。酵素力価は、上記の条件下で
１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成
する酵素量を１単位とした。

（４）セロビアーゼ活性 10mgセロビオース（関東化学社）、100μmolグリシン
−NaOH緩衝液（pH9.0）を含む反応液1.0ml内に適当量の
酵素液を30℃で作用させた後、10℃、５分間処理して酵
素を失活させた後、生成グルコース量をムタロターゼ・
GOD法（Glucose Ｃ−Test,和光純薬工業社）で測定し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に２μmolのグ
ルコースを生成する酵素量を１単位とした。

（酵素学的性質） （１）作用 CMC、リン酸膨潤セルロース等の繊維素によく作用
し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を生成
する。

（２）基質特異性 本酵素は、CMCに対する活性を主活性として有するほ
かにも、その約4.0％のリン酸膨潤セルロースに対する
活性を有する。又、キシラン、イヌリン、リケナン等に
対しても若干の分解活性を有している。セルロース粉
末、アビセル、濾紙、ｐ−ニトロフェニルセロビオシ
ド、セロビオースに対してはほとんど活性を有していな
い。

（３）作用pH及び至適pH 作用pH範囲は、４〜12.5と極めて広範囲であった。至
適pHは、７〜10と幅広く、pH5.5〜11の範囲に於いても
至適pHに於ける活性の50％以上の相対活性を有してお
り、従って過去に研究されたアルカリセルラーゼの中で
も最もアルカリ側で十分活性が発揮される酵素と言える
（第１図）。

（４）pH安定性 各々のpHで０℃、24時間保持した後の残存活性を測定
し、pH安定性を調べた。その結果、pH6〜11で極めて安
定で失活せず、pH5.5〜11.5に於いても約50％以上の活
性を維持していた。本酵素は、このように高アルカリ領
域に於いても充分に安定である（第２図）。

（５）最適温度 作用温度は、10〜80℃の広範囲にわたり、その至適温
度は50℃であった。又、30〜65℃の範囲に於いても、至
適温度での活性の50％以上を有していた（第３図）。

（６）温度安定性 pH7に於いて、30分間各温度で処理した後、残存活性
を測定した結果、50℃では安定しており、55℃に於いて
も約50％の残存活性を有していた（第４図）。

（７）分子量 本酵素を、バイオゲルＰ−100（バイオラッドラボラ
トリーズ社製）によるゲル濾過法に基づき分子量を側定
したところ、約3.4万であった。又、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法では、約6.1万の分子量を示し
た。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Al³⁺,Fe³⁺,Ba²⁺,C
a²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Hg²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Z
n²⁺,K⁺,Na⁺）を活性測定時に共存させて、その影響を検
討した（K⁺,Na⁺についてはそれらの塩濃度を50mMとし、
他のイオンについては、1mMとした）。その結果、Hg²⁺
で阻害が、Co²⁺により活性化が認められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、LAS、AS、ES、AOS、α−SF
E、SAS、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダリアルキル
エーテル）の酵素活性に及ぼす影響を調べた。本酵素を
界面活性剤0.05％の存在下で活性測定を行なった。その
結果、第１表に示すように、何れの界面活性剤によって
も顕著な影響は認められなかった。

また、強力なデタージエントであるソデイウム・ドデ
シルサルフェートによっても活性の阻害は認められなか
った。

（10）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばAPI−21（昭和電工）、
マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ社）
を、活性測定時に共存（0.1mg/ml）させてその影響を調
べたところ、第２表に示すように、何れのプロテアーゼ
に対しても強い耐性を有することがわかった。

（11）キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA、EGTA、トリポリリン酸ソー
ダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に共存させ、そ
の影響を検討したが、ほとんど阻害は認められなかっ
た。

（12）UV吸収スペクトル 本酵素のUV吸収スペクトルを測定した結果、約280nm
に最大吸収を有し、微分吸収スペクトルにより290nmに
おける肩吸収の存在が示された（第７図）。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼは、従来のアルカリセル
ラーゼに比較して高アルカリ側（pH10）に至適pHを有し
ている。その上、pH7.0〜10の広範囲に於いて、至適pH
を有しており、更に広い範囲に於いて極めて安定であ
る。

また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗
浄剤配合成分によってもほとんど阻害を受けない。した
がって、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有利に
使用することができるものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県日光市の土壌を薬匙一杯（約0.5g）取り、これ
を滅菌生理食塩水に懸濁し、80℃で10分間熱処理した。
この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地
（培地１）に塗布した。次いで、これを30℃にて３日間
培養し、集落を形成させた。集落の周囲にCMCの溶解に
基づく透明帯を形成するものを選出し、CMCアーゼ生産
菌を取得した。更に、取得菌を液体培地（培地２）に接
種し、30℃で３日間振とう培養した。培養後、遠心分離
した上清液についてCMCアーゼ活性を、pH3〜13にて測定
し、アルカリセルラーゼ生産菌をスクリーニングした。

上述の方法により、本発明のKSM−522株（FERMP−937
0）を取得することが出来た。

培地1. CMC 2 ％ ポリぺプトン 0.5 ％ 酵母エキス 0.05％ KH₂PO₄ 0.1 ％ Na₂HPO₄・12H₂O 0.25％ MgSO₄・7H₂O 0.02％寒天 0.75％ pH6.8 培地2. CMC 1 ％ ポリペプトン 1 ％ 酵母エキス 0.5 ％ KH₂PO₄ 0.1 ％ Na₂HPO₄・12H₂O 0.25％MgSO₄・7H₂O 0.02％ pH6.8 実施例２ 実施例１で得たバチルス・エスピー KSM−522株を同
実施例の液体培地２に接種し、30℃で３日間振とう培養
した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を得
た。この粗酵素液１に対してドライアイス−エタノー
ル中で、３のエタノールを加え、生じた沈澱を遠心分
離し、更に凍結乾燥を行ない、乾燥粉末として、アルカ
リセルラーゼＫ−522（比活性＊23単位/g）8gを得た。

＊酵素活性はpH9に於ける測定値である（以下同
じ）。

実施例３ CMCを１％ショ糖に代え、ポリペプトンを７％CSLに代
える以外は実施例１の液体培地２と同じ組成の培地にKS
M−522株を接種し、30℃で２日間振とう培養した。この
培養物を遠心分離し、得られた上清のCMCアーゼ活性を
測定したところ150単位／であった。

実施例４ 実施例３で得られた培養上清５について、以下の手
順に従って精製を行った。

限外濾過（アミコン社製、分画分子量１万）による
濃縮 ストレプトマイシン処理 DEAE−バイオゲルＡ（バイオラッドラボラトリーズ
社製）クロマトグラフィー ヒドロキシアパタイト（和光純薬工業社製）クロマ
トグラフィー DEAE−バイオゲルＡクロマトグラフィー上記工程の
うち、第３段階では、酵素を3.2×33cmのカラム（10m
M、pH7のリン酸緩衝液で平衡化したもの）に吸着させ、
NaCl濃度を０〜300mM迄直線的に増加させて溶出した。
これにより中性セルラーゼＥ−Ｉ、アルカリセルラーゼ
Ｅ−II、Ｅ−IIIが順に溶出されることが明らかとなっ
た（第５図）。Ｅ−Ｉの画分を除いた、533から580のフ
ラクションについて更に精製を行ない、第４段階では、
2.5×13cmのカラム（10mM、pH7のリン酸緩衝液で平衡化
したもの）に吸着させ、リン酸塩濃度を10〜200mM迄直
線的に増加させ、アルカリセルラーゼ画分（Ｅ−II、Ｅ
−IIIの混合物）を得た。第５段階ではと同様の操作
を行ない（NaCl濃度は70〜200mM迄直線的に増加）、ア
ルカリセルラーゼＥ−IIの精製物が取得された。得られ
た精製アルカリセルラーゼＥ−IIを常法に従い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付した後、コマシー・ブリ
リアント・ブルー染色及び銀染色を行ない、単一のバン
ドを与えることを確認した。

実施例５ 実施例４で得たアルカリセルラーゼＥ−IIについて、
常法に従いSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なった。この結果を第６図に示す。この結果から、アル
カリセルラーゼＥ−IIは分子量約6.1万であることが示
された。

また、バイオゲルＰ−100を用いたゲル濾過法では、
分子量は約3.4万であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルカリセルラーゼＥ−IIの酵素反応pHと相
対活性の関係を示す図面である。 第２図は、同酵素の処理pHと相対活性の関係を示す図面
である。 第３図は、同酵素の反応温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第４図は、同酵素の処理温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第５図は、精製第３段階のイオン交換クロマトグラフィ
ーを示す図面である。 第６図は、アルカリセルラーゼＥ−II、Ｅ−IIIのSDS・
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面であ
る。 第７図は、アルカリセルラーゼＥ−IIのUV吸収を示す図
面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (72)発明者 岡本 暉公彦 埼玉県越谷市七左町１−229−８

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の物理化学的性質を有するアルカリセル
   ラーゼＥ−II。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロース等
   の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、グルコー
   ス等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロースの
   他、キシラン、イヌリン、リケナンに対しても若干の活
   性を有する。 （３）作用pH及び至適pH 作用pHは４〜12.5であり、至適pHは７〜10である。 （４）pH安定性 ５℃で24時間保持した場合pH6〜10で失活しない。 （５）作用温度及び至適温度 作用温度は10〜80℃、至適温度は50℃である。 （６）分子量 約3.4万（ゲル濾過法による）。 （７）金属イオンの影響 Hg²⁺により阻害され、Co²⁺により活性化される。 （８）界面活性剤の影響 LAS、AS、ES、AOS、α−SFE、SAS、石鹸、ポリオキシエ
   チレンセカンダリーアルキルエーテルはほとんど活性を
   阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （10）キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸、トリポリリン酸ソーダ、ゼオラ
   イトは活性を阻害しない。
2. 【請求項２】バチルス・エスピー（Bacillus sp.）KSM
   −522（微工研菌寄第9370号）の培養物より分離取得さ
   れたものである特許請求の範囲第１項記載のアルカリセ
   ルラーゼＥ−II。