JP2652871B2 - アルカリセルラーゼおよびその製造法 - Google Patents
アルカリセルラーゼおよびその製造法Info
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- C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なセルラーゼに関し、更に詳細にはアル
カリ側に最適pHを有する新規なアルカリセルラーゼおよ
びその製造法に関する。
カリ側に最適pHを有する新規なアルカリセルラーゼおよ
びその製造法に関する。
セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコー
ス、セロビオース又はセロオリゴ糖まで分解する酵素反
応を触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構によ
り、C1酵素、CX酵素、エキソ−β−グルカナーゼ、エン
ド−β−グルカナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナー
ゼ（EC 3.2.1.4）〔カルボキシメチルセルラーゼ（CMC
アーゼ）又はCXセルラーゼ〕、エキソ−β−1,4−グル
カナーゼ（EC 3.2.1.91）（C1セルラーゼ又はセロビオ
ヒドロラーゼ）、β−1,4−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.
21）（セロビアーゼ又はβ−グルコシダーゼ）などの名
称で呼ばれる酵素の総称と理解されている。長年、セル
ラーゼ研究の歴史は専らバイオマス資源の有効利用を図
る目的から進められてきており、例えばトリコデルマ
属、アスペルギルス属、アクレモニウム属、フミコーラ
属などのカビの類にその供給源を求めてきた。然るに、
カビを含めて微生物起源のセルラーゼには、その構成酵
素群の作用特異性や物理化学的諸性質等の多様性が有
り、その実態は未だ明確化されたとは言い難い。
ス、セロビオース又はセロオリゴ糖まで分解する酵素反
応を触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構によ
り、C1酵素、CX酵素、エキソ−β−グルカナーゼ、エン
ド−β−グルカナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナー
ゼ（EC 3.2.1.4）〔カルボキシメチルセルラーゼ（CMC
アーゼ）又はCXセルラーゼ〕、エキソ−β−1,4−グル
カナーゼ（EC 3.2.1.91）（C1セルラーゼ又はセロビオ
ヒドロラーゼ）、β−1,4−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.
21）（セロビアーゼ又はβ−グルコシダーゼ）などの名
称で呼ばれる酵素の総称と理解されている。長年、セル
ラーゼ研究の歴史は専らバイオマス資源の有効利用を図
る目的から進められてきており、例えばトリコデルマ
属、アスペルギルス属、アクレモニウム属、フミコーラ
属などのカビの類にその供給源を求めてきた。然るに、
カビを含めて微生物起源のセルラーゼには、その構成酵
素群の作用特異性や物理化学的諸性質等の多様性が有
り、その実態は未だ明確化されたとは言い難い。
最近、セルラーゼの新規な産業用途として、例えば、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分としての用途が開発され
つつある。しかしながら、自然界において微生物の産生
するセルラーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎ
り、大部分がアルカリpHにおいて失活する、いわゆる酸
性セルラーゼ（最適作用pHが４〜６）であって、衣料用
洗浄剤組成物の要件であるアルカリ側で最大活性を有
し、且つ耐性を有する、いわゆるアルカリセルラーゼの
存在は極めて少ないのが実情であった。
衣料用洗浄剤組成物の添加成分としての用途が開発され
つつある。しかしながら、自然界において微生物の産生
するセルラーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎ
り、大部分がアルカリpHにおいて失活する、いわゆる酸
性セルラーゼ（最適作用pHが４〜６）であって、衣料用
洗浄剤組成物の要件であるアルカリ側で最大活性を有
し、且つ耐性を有する、いわゆるアルカリセルラーゼの
存在は極めて少ないのが実情であった。
すなわち、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアル
カリセルラーゼに関しては、好アルカリ性微生物起源の
アルカリセルラーゼを生産する方法として、バチルスに
属する細菌を培養して培地よりセルラーゼＡを採取する
方法（特公昭50−28515号公報）、セルロモナス属に属
する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ30
1−Ａを生産する方法（特開昭58−224686号公報）、好
アルカリ性バチルスNo.1139を培養してカルボキシメチ
ルセルラーゼを生産する方法〔Horikoshiら、J.Gen.Mic
robiol.,131巻,3339頁（1985年）〕、及びストレプトマ
イセス属の種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方
法（特開昭61−19483号公報）が知られているにすぎな
い。
カリセルラーゼに関しては、好アルカリ性微生物起源の
アルカリセルラーゼを生産する方法として、バチルスに
属する細菌を培養して培地よりセルラーゼＡを採取する
方法（特公昭50−28515号公報）、セルロモナス属に属
する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ30
1−Ａを生産する方法（特開昭58−224686号公報）、好
アルカリ性バチルスNo.1139を培養してカルボキシメチ
ルセルラーゼを生産する方法〔Horikoshiら、J.Gen.Mic
robiol.,131巻,3339頁（1985年）〕、及びストレプトマ
イセス属の種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方
法（特開昭61−19483号公報）が知られているにすぎな
い。
従って、アルカリ側において至適pHを有し、衣料洗浄
用酵素としての機能を有するアルカリセルラーゼを新た
に提供することが要望されていた。
用酵素としての機能を有するアルカリセルラーゼを新た
に提供することが要望されていた。
本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を
自然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県
芳賀郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物
が、衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規な
アルカリセルラーゼを生産することを見出し、本発明を
完成した。
自然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県
芳賀郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物
が、衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規な
アルカリセルラーゼを生産することを見出し、本発明を
完成した。
したがって、本発明は新規なアルカリセルラーゼ及び
分子量的に多成分性を有するアルカリセルラーゼの製造
法を提供するものである。
分子量的に多成分性を有するアルカリセルラーゼの製造
法を提供するものである。
本発明のアルカリセルラーゼを生産する上記微生物
は、次のような菌学的性状を示す。なお、以下において
菌株の分類に用いた培地は次の培地Ａ〜Ｘの24種類であ
り、これらは何れも別途滅菌した炭酸ナトリウム（Na2C
O3）を1.0％含有する。
は、次のような菌学的性状を示す。なお、以下において
菌株の分類に用いた培地は次の培地Ａ〜Ｘの24種類であ
り、これらは何れも別途滅菌した炭酸ナトリウム（Na2C
O3）を1.0％含有する。
使用した培地の組成（表示は重量％）： 培地A:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;バクト寒天,
1.5 培地B:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3 培地C:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;食塩,7.0 培地D:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;バクトゼラチ
ン,20.0 培地E:バクトリトマスミルク,10.5 培地F:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;KNO3,0.1 培地G:バクトペプトン,0.7;グルコース,0.5;食塩,0.5 培地H:バクトペプトン,3.0;肉エキス,0.3;チオ硫酸ナト
リウム,0.005;塩酸システイン,0.02;クエン酸鉄アンモ
ニウム,0.05;バクト寒天,0.5 培地I:バクトペプトン,1.5;肉エキス,0.4;乳糖,1.0;蔗
糖,1.0;グルコース,1.0;食塩,0.5;チオ硫酸ナトリム,0.
008;亜硫酸ナトリウム,0.04;硫酸第一鉄,0.02;フェノー
ル・レッド,0.002;バクト寒天,1.5 培地J:バクトペプトン,1.5;酵母エキス,0.5;可溶性澱
粉,2.0;K2HPO4,0.1;バクト寒天,1.5;MgSO4・7H2O,0.02 培地K:リン酸アンモニウム,0.1;塩化カリウム,0.02;酵
母エキス,0.05;MgSO4・7H2O,0.02;糖類,1.0（濾過滅
菌） 培地L:リン酸−水素カリウム,0.1;リン酸二水素アンモ
ニウム,0.1;クエン酸ナトリウム,0.2;MgSO4・7H2O,0.0
3;食塩,0.5;ブロム・チモール・ブルー,0.0024;バクト
寒天,1.5 培地M:酵母エキス,0.05;塩酸システイン,0.01;クエン酸
ナトリウム,0.3;食塩,0.5;チオ硫酸ナトリウム,0.008;
クエン酸鉄アンモニウム,0.04;グルコース,0.02;リン酸
二水素カリウム,0.15;フェノール・レッド,0.0012;バク
ト寒天,1.5 培地N:リン酸アンモニウム,0.1;リン酸二水素カリウム,
0.05;クエン酸ナトリウム,0.2;バクト寒天,1.5;MgSO4・
7H2O,0.02 培地O:酵母エキス,0.05;NaSO4,0.1;KH2PO4,0.1;グルコ
ース,1.0;無機窒素源，適当量＊ ＊硫酸ナトリウムは0.25％，亜硝酸ナトリウムは0.2025
％，塩化アンモニウムは0.158％，リン酸アンモニウム
は0.195％（各々0.0412N％に相当）になるように加え
た。
1.5 培地B:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3 培地C:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;食塩,7.0 培地D:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;バクトゼラチ
ン,20.0 培地E:バクトリトマスミルク,10.5 培地F:バクトペプトン,0.5;肉エキス,0.3;KNO3,0.1 培地G:バクトペプトン,0.7;グルコース,0.5;食塩,0.5 培地H:バクトペプトン,3.0;肉エキス,0.3;チオ硫酸ナト
リウム,0.005;塩酸システイン,0.02;クエン酸鉄アンモ
ニウム,0.05;バクト寒天,0.5 培地I:バクトペプトン,1.5;肉エキス,0.4;乳糖,1.0;蔗
糖,1.0;グルコース,1.0;食塩,0.5;チオ硫酸ナトリム,0.
008;亜硫酸ナトリウム,0.04;硫酸第一鉄,0.02;フェノー
ル・レッド,0.002;バクト寒天,1.5 培地J:バクトペプトン,1.5;酵母エキス,0.5;可溶性澱
粉,2.0;K2HPO4,0.1;バクト寒天,1.5;MgSO4・7H2O,0.02 培地K:リン酸アンモニウム,0.1;塩化カリウム,0.02;酵
母エキス,0.05;MgSO4・7H2O,0.02;糖類,1.0（濾過滅
菌） 培地L:リン酸−水素カリウム,0.1;リン酸二水素アンモ
ニウム,0.1;クエン酸ナトリウム,0.2;MgSO4・7H2O,0.0
3;食塩,0.5;ブロム・チモール・ブルー,0.0024;バクト
寒天,1.5 培地M:酵母エキス,0.05;塩酸システイン,0.01;クエン酸
ナトリウム,0.3;食塩,0.5;チオ硫酸ナトリウム,0.008;
クエン酸鉄アンモニウム,0.04;グルコース,0.02;リン酸
二水素カリウム,0.15;フェノール・レッド,0.0012;バク
ト寒天,1.5 培地N:リン酸アンモニウム,0.1;リン酸二水素カリウム,
0.05;クエン酸ナトリウム,0.2;バクト寒天,1.5;MgSO4・
7H2O,0.02 培地O:酵母エキス,0.05;NaSO4,0.1;KH2PO4,0.1;グルコ
ース,1.0;無機窒素源，適当量＊ ＊硫酸ナトリウムは0.25％，亜硝酸ナトリウムは0.2025
％，塩化アンモニウムは0.158％，リン酸アンモニウム
は0.195％（各々0.0412N％に相当）になるように加え
た。
培地P:酵母エキス,0.05;Na2SO4,0.1;KH2PO4,0.1;グルコ
ース,1.0;無機窒素源，適当量＊＊;CaCl2・2H2O,0.05;M
nSO4・４〜6H2O,0.001;FeSO4・7H2O,0.001（濾過滅
菌）;MgSO4・7H2O,0.02（濾過滅菌） ＊＊硝酸ナトリウムは0.25％，亜硝酸ナトリウムは0.20
25％，塩化アンモニウムは0.158％，リン酸アンモニウ
ムは0.195％（各々0.0412N％に相当）になるように加え
た。
ース,1.0;無機窒素源，適当量＊＊;CaCl2・2H2O,0.05;M
nSO4・４〜6H2O,0.001;FeSO4・7H2O,0.001（濾過滅
菌）;MgSO4・7H2O,0.02（濾過滅菌） ＊＊硝酸ナトリウムは0.25％，亜硝酸ナトリウムは0.20
25％，塩化アンモニウムは0.158％，リン酸アンモニウ
ムは0.195％（各々0.0412N％に相当）になるように加え
た。
培地Q:キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量 培地R:キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量 培地S:ポテトデストロース寒天培地“栄研”（栄研化学
社製），指示量 培地T:バクトペプトン,0.25;食塩,0.25;酵母エキス,0.2
5;マンニット,0.5;バクト寒天,2.0 培地U:尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量 培地V:バクトペプトン,0.1;食塩,0.5;KH2PO4,0.2;酵母
エキス,0.05;グルコース,0.1;尿素,2.0;フェノール・レ
ッド,0.001 培地W:バクトペプトン,0.5;酵母エキス,0.5;K2HPO4,0.
1;グルコース,1.0;MgSO4・7H2O,0.02 培地X:酵母エキス,0.5;グルコース,1.0;カゼイン（ハー
マーシュタイン，メルク社製）,0.5;K2HPO4,0.1;MgSO4
・7H2O,0.02;バクト寒天,1.5 （菌学的性状） 1.顕微鏡的観察結果 本菌体は0.5〜1.2μｍ×1.5〜4.0μｍの大きさの桿菌
であり、菌体の一端に内生胞子（0.7〜1.2μｍ×1.0〜
2.0μｍ）を形成する。又、周鞭毛を有して運動性があ
り、グラム染色では陽性を示す。
社製），指示量 培地T:バクトペプトン,0.25;食塩,0.25;酵母エキス,0.2
5;マンニット,0.5;バクト寒天,2.0 培地U:尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量 培地V:バクトペプトン,0.1;食塩,0.5;KH2PO4,0.2;酵母
エキス,0.05;グルコース,0.1;尿素,2.0;フェノール・レ
ッド,0.001 培地W:バクトペプトン,0.5;酵母エキス,0.5;K2HPO4,0.
1;グルコース,1.0;MgSO4・7H2O,0.02 培地X:酵母エキス,0.5;グルコース,1.0;カゼイン（ハー
マーシュタイン，メルク社製）,0.5;K2HPO4,0.1;MgSO4
・7H2O,0.02;バクト寒天,1.5 （菌学的性状） 1.顕微鏡的観察結果 本菌体は0.5〜1.2μｍ×1.5〜4.0μｍの大きさの桿菌
であり、菌体の一端に内生胞子（0.7〜1.2μｍ×1.0〜
2.0μｍ）を形成する。又、周鞭毛を有して運動性があ
り、グラム染色では陽性を示す。
2.各種培地における生育状態 肉汁寒天培地（培地Ａ） 集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平状であ
る。又、集落の色調は白色乃至黄色の半透明であり、光
沢がある。
る。又、集落の色調は白色乃至黄色の半透明であり、光
沢がある。
肉汁液体培地（培地Ｂ） 生育し、混濁する。培地を中性pHにすると、ほとんど
生育しない。
生育しない。
７％食塩肉汁液体培地（培地Ｃ） 生育し、混濁する。
肉汁ゼラチン穿刺培養（培地Ｄ） 生育しない。
リトマスミルク培地（培地Ｅ） ミルクの凝固、ペプトン化は認められず、又培地Ｅが
アルカリ性のため、リトマスの変色は無い。
アルカリ性のため、リトマスの変色は無い。
3.生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地Ｆ） 硝酸還元するが、脱窒反応は陰性。
MRテスト（培地Ｇ） 培地がアルカリ性のため、メチルレッドの変化は認め
られない。
られない。
VPテスト（培地Ｇ） 陽性。
インドールの生成（培地Ｈ） インドール産生試験用濾紙（「ニッサン」，日水製薬
社製）に対する反応、コバックの試薬に対する呈色のい
ずれに対しても陰性。
社製）に対する反応、コバックの試薬に対する呈色のい
ずれに対しても陰性。
硫化水素の生成（培地Ｉ） 陰性。
澱粉の加水分解 平板寒天培地、培地Ｊを4N塩酸で酸性にしても通常の
ヨウ素反応による検出法では陰性といえる。又、液体培
地Ｋにおいても可溶性澱粉の資化性は認められない。
ヨウ素反応による検出法では陰性といえる。又、液体培
地Ｋにおいても可溶性澱粉の資化性は認められない。
クエン酸の利用 培地K;クエン酸を利用する。
コーサ（シモンズ）のクエン酸寒天平板培地（培地
Ｌ）；育成せず。培地Ｌから寒天を除き0.05％の酵母エ
キスを加えた液体培地では、クエン酸の資化が認められ
る。
Ｌ）；育成せず。培地Ｌから寒天を除き0.05％の酵母エ
キスを加えた液体培地では、クエン酸の資化が認められ
る。
クリステンセンの寒天平板培地（培地Ｍ）；生育する
が、アルカリ性のためフェノールレッドの変化なし。
が、アルカリ性のためフェノールレッドの変化なし。
培地N;クエン酸を利用しない。培地Ｎから寒天を除き0.
05％の酵母エキスを加えた液体培地では、クエン酸の資
化が認められる。
05％の酵母エキスを加えた液体培地では、クエン酸の資
化が認められる。
無機窒素源の利用 培地O;硝酸、亜硝酸、アンモニアのいずれも陰性ないし
微弱である。
微弱である。
培地P;硝酸と亜硝酸は旺盛に資化される。一方、塩化ア
ンモニウムの利用性は微弱であるが、リン酸アンモニウ
ムは利用する。
ンモニウムの利用性は微弱であるが、リン酸アンモニウ
ムは利用する。
色素の生成 キングＡ培地（培地Ｑ）では生育しない。
キングＢ培地（培地Ｒ）では淡黄色を呈するが、蛍光
性はない。又、ポテトデキストロース寒天培地（培地
Ｓ）とマンニット酵母エキス寒天培地（培地Ｔ）では生
育するが、色素の生成は認められない。
性はない。又、ポテトデキストロース寒天培地（培地
Ｓ）とマンニット酵母エキス寒天培地（培地Ｔ）では生
育するが、色素の生成は認められない。
ウレアーゼ 培地U;生育せず。培地Ｕからフェノール・レッドを除
き、本菌を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を
確認したが、陰性。
き、本菌を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を
確認したが、陰性。
培地Ｖ（クリステンセンの尿素培地に酵母エキスを添
加）；培地からフェノール・レッドを除き、本菌を培養
後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確認したが、陰
性。培地Ｖの尿素濃度を0.1,0.2,0.5,1.0,2.0％と変化
させて試験しても、ウレアーゼ活性は陰性を示す。
加）；培地からフェノール・レッドを除き、本菌を培養
後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確認したが、陰
性。培地Ｖの尿素濃度を0.1,0.2,0.5,1.0,2.0％と変化
させて試験しても、ウレアーゼ活性は陰性を示す。
オキシダーゼ 陽性、陰性ははっきりしない。
カタラーゼ 陽性。
生育の範囲（培地Ｗ） 生育温度範囲は20〜45℃にあり、生育最適温度範囲は
29〜37℃である。
29〜37℃である。
培地Ｗの初発pHをNa2CO3で変化させると、生育pH範囲
は８〜11にあり、生育最適pHは9.5〜10.2である。一
方、K2CO3で培地のpHを調整すると、生育量は著しく少
なく、生育至適pHは、約９である。
は８〜11にあり、生育最適pHは9.5〜10.2である。一
方、K2CO3で培地のpHを調整すると、生育量は著しく少
なく、生育至適pHは、約９である。
酸素に対する態度 好気的。
Ｏ−Ｆテスト アルカリ性のため変色せず。好気のみ生育する。
糖類の利用性（培地Ｋ） 利用できる炭素源:D−リボース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−
フラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロース、Ｄ−マ
ンニット、イノシット、グリセリン。
−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−
フラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロース、Ｄ−マ
ンニット、イノシット、グリセリン。
利用できない炭素源:D−ガラクトース、乳糖、Ｄ−ソル
ビット、デンプン、デキストリン、ラフィノース。
ビット、デンプン、デキストリン、ラフィノース。
ガゼインの加水分解（培地Ｘ） 寒天平板培地Ｘに、菌を生育せしめ、30％トリクロロ
酢酸処理による菌体集落周囲の透明帯形成は認められ
ず、カゼインの分解性は陰性と思われる。
酢酸処理による菌体集落周囲の透明帯形成は認められ
ず、カゼインの分解性は陰性と思われる。
栄養要求性 ビオチン（又はデスチオビオチン）を生育に必要とす
る。
る。
GC含量（Tm法） 本発明にかかる菌のGC含量は約39.5mol％である。
以上の菌学的性質について、バージーズ・マニュアル
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Berg
ey's Mannual of Determinative Bacteriology）第８版
を参照した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス
（Bacillus）属の一種であると認められる。しかし、本
菌株は中性pHでは生育できず、専ら高アルカリpHを良好
な生育で示すことから、最近、掘越と秋葉（“Alkaloph
ilic Microorganisms",Japan Scientific Society Pres
s（Tokyo）,1982年刊）の主張する、いわゆる好アルカ
リ性（alkalophilic）微生物に属し、従来の中性で生育
するバチルスと区別される。
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Berg
ey's Mannual of Determinative Bacteriology）第８版
を参照した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス
（Bacillus）属の一種であると認められる。しかし、本
菌株は中性pHでは生育できず、専ら高アルカリpHを良好
な生育で示すことから、最近、掘越と秋葉（“Alkaloph
ilic Microorganisms",Japan Scientific Society Pres
s（Tokyo）,1982年刊）の主張する、いわゆる好アルカ
リ性（alkalophilic）微生物に属し、従来の中性で生育
するバチルスと区別される。
そして、本菌株の上記菌学的性質は、公知の好アルカ
リ性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規
菌株と判断して、バチルス エスピー KSM−635と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第
1485号（FERM BP−1485）として寄託した。
リ性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規
菌株と判断して、バチルス エスピー KSM−635と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第
1485号（FERM BP−1485）として寄託した。
本発明のアルカリセルラーゼは、例えば、上記の好ア
ルカリ性バチルス エスピー KSM−635（FERM BP−148
5）を用いる発酵法により製造することができる。
ルカリ性バチルス エスピー KSM−635（FERM BP−148
5）を用いる発酵法により製造することができる。
本発明方法には、上記微生物のほかに、これより高力
価の当該酵素生産性を有する各種突然変異株を使用する
こともできる。
価の当該酵素生産性を有する各種突然変異株を使用する
こともできる。
本発明方法を実施するには、適当な培地を加熱等によ
り殺菌し、これにバチルス エスピー KSM−635を接種
し、22℃〜40℃、好ましくは26℃〜37℃で、１〜４日間
振盪又は通気撹拌培養する。培地のpHは８〜11に調整す
るのが好ましい。培養中に発泡することがあるが、これ
は適当な消泡剤を添加することによって解消される。
り殺菌し、これにバチルス エスピー KSM−635を接種
し、22℃〜40℃、好ましくは26℃〜37℃で、１〜４日間
振盪又は通気撹拌培養する。培地のpHは８〜11に調整す
るのが好ましい。培養中に発泡することがあるが、これ
は適当な消泡剤を添加することによって解消される。
培養培地としては、資化し得る窒素源と炭素源を適宜
組み合わせて含有せしめたものが使用される。両栄養源
は特に制限されず、例えば、窒素源としては、硝安、硫
安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ、コーング
ルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、
肉エキス、ぺプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンソ
イビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベー
タ、アジプロン、ゼストなどが；また炭素源としては、
籾殻、麩、濾紙、一般紙類、おが屑などの植物繊維質、
廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース（CM
C）、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、
リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロー
ス、マンニット、イノシット、グリセリン、酢酸、クエ
ン酸などが挙げられる。すなわち、本発明方法では、ビ
チオン又はその誘導体を含有する培地であれば、これら
の窒素源と炭素源を適宜組み合わせたいかなる培地も使
用できる。その他に、リン酸、Mg2+,Ca2+,Mn2+,Zn2+,Co
2+,Na+,K+などの無機塩や、必要であれば、無機、有機
微量栄養源を添加することもできる。
組み合わせて含有せしめたものが使用される。両栄養源
は特に制限されず、例えば、窒素源としては、硝安、硫
安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ、コーング
ルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、
肉エキス、ぺプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンソ
イビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベー
タ、アジプロン、ゼストなどが；また炭素源としては、
籾殻、麩、濾紙、一般紙類、おが屑などの植物繊維質、
廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース（CM
C）、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、
リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロー
ス、マンニット、イノシット、グリセリン、酢酸、クエ
ン酸などが挙げられる。すなわち、本発明方法では、ビ
チオン又はその誘導体を含有する培地であれば、これら
の窒素源と炭素源を適宜組み合わせたいかなる培地も使
用できる。その他に、リン酸、Mg2+,Ca2+,Mn2+,Zn2+,Co
2+,Na+,K+などの無機塩や、必要であれば、無機、有機
微量栄養源を添加することもできる。
斯くして得られた栄養物中から目的物質のアルカリセ
ルラーゼを単離、取得するには、後記実施例に示す如
く、一般の酵素の分離及び精製手段が採用される。
ルラーゼを単離、取得するには、後記実施例に示す如
く、一般の酵素の分離及び精製手段が採用される。
例えば、培養物を遠心分離又は濾過等によって菌体と
培養濾液に分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分
離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法
（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）など
によって蛋白を沈澱させる方法、また限外濾過（例えば
ダイアフローメンブレンYC、アミコン社製）により濃縮
させる方法などによってアルカリセルラーゼを分離採取
する。塩析法としては硫安法（30〜70％飽和画分）、溶
媒沈澱法としてはエタノール法（75％濃度）が好まし
い。斯くして沈澱させたアルカリセルラーゼは濾過、遠
心分離などによって採取し、脱塩後凍結乾燥などによっ
て乾燥する。脱塩には、透析、セファデックスＧ−25等
を用いるゲル濾過法等の一般的方法が採用される。
培養濾液に分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分
離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法
（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）など
によって蛋白を沈澱させる方法、また限外濾過（例えば
ダイアフローメンブレンYC、アミコン社製）により濃縮
させる方法などによってアルカリセルラーゼを分離採取
する。塩析法としては硫安法（30〜70％飽和画分）、溶
媒沈澱法としてはエタノール法（75％濃度）が好まし
い。斯くして沈澱させたアルカリセルラーゼは濾過、遠
心分離などによって採取し、脱塩後凍結乾燥などによっ
て乾燥する。脱塩には、透析、セファデックスＧ−25等
を用いるゲル濾過法等の一般的方法が採用される。
更にアルカリセルラーゼを精製するには、例えばヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、DEAE−セファデ
ックス又はDEAE−セルロース等のイオン交換クロマトグ
ラフィー及びセファデックス、バイオゲルのような分子
篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うこと
ができる。
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、DEAE−セファデ
ックス又はDEAE−セルロース等のイオン交換クロマトグ
ラフィー及びセファデックス、バイオゲルのような分子
篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うこと
ができる。
斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼは、以
下に示すような物理化学的性質を有する。
下に示すような物理化学的性質を有する。
（１） 作用 本酵素は、カルボキシメチルセルロース（CMC）に作
用するCX酵素活性を有する。更に、リン酸膨潤セルロー
ス、セルロース綿、アビセル、濾紙にも作用する。セロ
ビオース、セロオリゴ糖、人工基質であるｐ−ニトロフ
ェニルセロビオキシド等を若干ながら水解する。
用するCX酵素活性を有する。更に、リン酸膨潤セルロー
ス、セルロース綿、アビセル、濾紙にも作用する。セロ
ビオース、セロオリゴ糖、人工基質であるｐ−ニトロフ
ェニルセロビオキシド等を若干ながら水解する。
（２） 基質特異性 アルカリセルラーゼの基質特異性の一例を第１表に示
した。本発明のアルカリセルラーゼは、CMCに対して主
たる活性を有するが、アビセル（SF）、濾紙、セルロー
ス綿、リン酸膨潤セルロース、ペクチン（Citrus）、可
溶性澱粉（ジャガイモ）およびパラニトロフェニル−β
−Ｄ−セロビオシドに対しても若干の水解酵素活性を有
する。
した。本発明のアルカリセルラーゼは、CMCに対して主
たる活性を有するが、アビセル（SF）、濾紙、セルロー
ス綿、リン酸膨潤セルロース、ペクチン（Citrus）、可
溶性澱粉（ジャガイモ）およびパラニトロフェニル−β
−Ｄ−セロビオシドに対しても若干の水解酵素活性を有
する。
一方、アルカリ（NaOH）膨潤セルロース、キシラン
（カラマツ）、イヌリン（ダリヤの塊茎）、カードラン
（Alcaligenes feacalisvar.myxogenes）、デキストリ
ン（トウモロコシ）及びパラニトロフェニル−β−Ｄ−
グルコシドに対しては、ほとんど水解活性を有しない。
（カラマツ）、イヌリン（ダリヤの塊茎）、カードラン
（Alcaligenes feacalisvar.myxogenes）、デキストリ
ン（トウモロコシ）及びパラニトロフェニル−β−Ｄ−
グルコシドに対しては、ほとんど水解活性を有しない。
（３） 作用pH及び至適作用pH 本酵素の作用pHは４〜12、至適作用pHは大凡９〜10で
ある。
ある。
（４） 安定pH pHの異なる緩衝液の下、40℃で10分間及び30分間放置
した時の安定pHは、それぞれ4.5〜10.5及び6.8〜10であ
る（第２図）。５℃で放置すると、pH4〜11で少なくて
も一ケ月は安定である。
した時の安定pHは、それぞれ4.5〜10.5及び6.8〜10であ
る（第２図）。５℃で放置すると、pH4〜11で少なくて
も一ケ月は安定である。
（５） 作用温度範囲及び作用至適温度 本酵素は低温で10℃、高温で65℃の広い範囲で作用す
るが、グリシン緩衝液（pH9）の下で20分間反応させた
時の作用至適温度は約40℃である（第３図）。
るが、グリシン緩衝液（pH9）の下で20分間反応させた
時の作用至適温度は約40℃である（第３図）。
（６） 熱安定性 グリシン緩衝液（pH9）の下で、各温度で20分間加熱
処理した結果、本酵素は約40℃では全く失活せず、60℃
で約50％、70℃で約25％の残存活性を有する（第４
図）。
処理した結果、本酵素は約40℃では全く失活せず、60℃
で約50％、70℃で約25％の残存活性を有する（第４
図）。
（７） 酵素活性測定法 CMCアーゼ活性 CMC（2.5％）0.2ml、0.5Mグリシン緩衝液（pH9.0）0.
1ml及び脱イオン水0.1mlからなる基質溶液に酵素液0.1m
lを加え、40℃、20分間反応させ、反応後、3,5−ジニト
ロ−サリチル酸（DNS）法にて還元糖の定量を行った。
すなわち、反応液0.5mlにDNS試薬1mlを加え、５分間100
℃で加熱発色させ、冷却後、4.5mlの脱イオン水を加え
て希釈し、これを波長535nmで比色定量した。酵素力価
は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコースに相
当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
1ml及び脱イオン水0.1mlからなる基質溶液に酵素液0.1m
lを加え、40℃、20分間反応させ、反応後、3,5−ジニト
ロ−サリチル酸（DNS）法にて還元糖の定量を行った。
すなわち、反応液0.5mlにDNS試薬1mlを加え、５分間100
℃で加熱発色させ、冷却後、4.5mlの脱イオン水を加え
て希釈し、これを波長535nmで比色定量した。酵素力価
は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコースに相
当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性 100μmolリン酸緩衝液（pH7.0）、0.1μmol p−ニト
ロフェニルセロビオシド（シグマ社）を含む反応液1.0m
l中に適当量の本酵素を30℃で作用させた後、1M Na2Co3
を0.3ml、脱イオン水を1.7ml順次加え、遊離するｐ−ニ
トロフェノールを400nmで比色定量した。この条件で１
分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵
素量を１単位とした。
ロフェニルセロビオシド（シグマ社）を含む反応液1.0m
l中に適当量の本酵素を30℃で作用させた後、1M Na2Co3
を0.3ml、脱イオン水を1.7ml順次加え、遊離するｐ−ニ
トロフェノールを400nmで比色定量した。この条件で１
分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵
素量を１単位とした。
アビセラーゼ及びFPアーゼ活性 アビセル（メルク社）又は塊状にした幅0.5cm、長さ5
cmの濾紙片（セルラーゼ活性度検定用濾紙、東洋No.51
−特）20mgを水0.8mlに加えたもの、0.5Mグリシン緩衝
液（pH9.0）0.4ml、及び脱イオン水0.4mlからなる基質
溶液に酵素液0.4mlを加え、40℃で20分間反応させた。
この反応液を、のCMCアーゼ活性の測定と同様に操作
してアビラーゼ及びFPアーゼ活性を測定した。この条件
で１分間にグルコース換算で１μmolの還元糖を遊離さ
せる酵素量を１単位とした。
cmの濾紙片（セルラーゼ活性度検定用濾紙、東洋No.51
−特）20mgを水0.8mlに加えたもの、0.5Mグリシン緩衝
液（pH9.0）0.4ml、及び脱イオン水0.4mlからなる基質
溶液に酵素液0.4mlを加え、40℃で20分間反応させた。
この反応液を、のCMCアーゼ活性の測定と同様に操作
してアビラーゼ及びFPアーゼ活性を測定した。この条件
で１分間にグルコース換算で１μmolの還元糖を遊離さ
せる酵素量を１単位とした。
その他の活性は、に準じて測定した。
蛋白定量法は、バイオ・ラド プロテイン アッセ
イ キット（バイオ・ラド社）を用いて、牛血清アルビ
ミンを標準蛋白として算出した。
イ キット（バイオ・ラド社）を用いて、牛血清アルビ
ミンを標準蛋白として算出した。
（８） キレート剤の影響 洗浄剤用酵素として、その反応組成物であるビルダー
の中でキレート剤に対する耐性は最も重要な因子であ
る。アルカリセルラーゼをEDTA（0.5mM）、EGTA（0.5m
M）、NTA（0.5mM）、ゼオライト（0.05％）、トリポリ
リン酸（0.05％）で前処理した後、残存活性を測定した
ところ、全く阻害は認められない。
の中でキレート剤に対する耐性は最も重要な因子であ
る。アルカリセルラーゼをEDTA（0.5mM）、EGTA（0.5m
M）、NTA（0.5mM）、ゼオライト（0.05％）、トリポリ
リン酸（0.05％）で前処理した後、残存活性を測定した
ところ、全く阻害は認められない。
（９） プロテアーゼの影響 洗浄組成物として、プロテアーゼは洗浄力を向上せし
める作用がある。従って、プロテアーゼ入り洗浄剤にセ
ルラーゼを共存させて、更なる洗浄力の向上を求めるの
は当然である。このためには洗浄剤用セルラーゼがプロ
テアーゼで加水分解せず、活性が安定に保持される要件
をみたす必要がある。アルカリセルラーゼは実用されて
いる洗浄剤用プロテアーゼ（例えば、API−21、マクサ
ターゼ、アルカラーゼ等）や一般のプロテアーゼ（例え
ば、パパイン、トリプシン、プロナーゼ）に対して強力
な耐性を有している（第２表）。
める作用がある。従って、プロテアーゼ入り洗浄剤にセ
ルラーゼを共存させて、更なる洗浄力の向上を求めるの
は当然である。このためには洗浄剤用セルラーゼがプロ
テアーゼで加水分解せず、活性が安定に保持される要件
をみたす必要がある。アルカリセルラーゼは実用されて
いる洗浄剤用プロテアーゼ（例えば、API−21、マクサ
ターゼ、アルカラーゼ等）や一般のプロテアーゼ（例え
ば、パパイン、トリプシン、プロナーゼ）に対して強力
な耐性を有している（第２表）。
（10） 金属等の影響 適当な濃度の２価の金属イオン（Hg2+,Cu2+等）は阻
害効果を与える。モノヨード酢酸、パラマーキュリ安息
香酸によって若干の阻害を受ける。
害効果を与える。モノヨード酢酸、パラマーキュリ安息
香酸によって若干の阻害を受ける。
（11） 界面活性剤の影響 アルカリセルラーゼは0.5％の各種界面活性剤、例え
ば、綿状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（LA
S）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ES）、ポリ
オキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（E
S）、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（AOS）、α
−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム塩（α−SF
E）、アルキルスルホン酸ナトリウム（SAS）、ポリオキ
シエチレンセカンダリーアルキルエーテル、脂肪酸塩
（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキルアンモニウム
クロライド等の界面活性剤によって殆んど活性阻害は受
けない。
ば、綿状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（LA
S）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ES）、ポリ
オキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（E
S）、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（AOS）、α
−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム塩（α−SF
E）、アルキルスルホン酸ナトリウム（SAS）、ポリオキ
シエチレンセカンダリーアルキルエーテル、脂肪酸塩
（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキルアンモニウム
クロライド等の界面活性剤によって殆んど活性阻害は受
けない。
（12） 分子量 本発明のアルカリセルラーゼの分子量は、分子篩ゲル
クロマトグラフィーによれば、約３万、4.5万、９万、1
5万、18万、21万、24万または30万である。本発明にか
かる微生物は、このように分子量的に多成分性のアルカ
リセルラーゼを生産する。この分子量的多成分性は、
（ｉ）高分子量セルラーゼが分解されることによるもの
か、（ii）個々が異種蛋白であるか、（iii）低分子量
セルラーゼの会合によるものか、（iv）異種蛋白の会合
によるものかのいずれかによるものであると考えられ
る。本酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動的に単一な
CMCアーゼＩ（分子量145,000±10,000）とCMCアーゼII
（分子量170,000±20,000）（特願昭61−257777号およ
び特願昭61−257778号）を含有するが、通常のSDS電気
泳動を行うと第６図に示したように、更に30,000±2,00
0〜120,000±15,000の範囲に入る分子量の蛋白が多数階
段状（ladder）に染色される。一方、アルカリセルラー
ゼの標品をポリアクリルアミド電気泳動にかけた後、CM
Cとコンゴーレッドを含む寒天平板にレプリカさせる
と、CMCアーゼ活性部位は少なくとも５個以上の透明帯
として検出される（第７図）。第７図は、本発明のアル
カリセルラーゼの多成分性を示すものである。
クロマトグラフィーによれば、約３万、4.5万、９万、1
5万、18万、21万、24万または30万である。本発明にか
かる微生物は、このように分子量的に多成分性のアルカ
リセルラーゼを生産する。この分子量的多成分性は、
（ｉ）高分子量セルラーゼが分解されることによるもの
か、（ii）個々が異種蛋白であるか、（iii）低分子量
セルラーゼの会合によるものか、（iv）異種蛋白の会合
によるものかのいずれかによるものであると考えられ
る。本酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動的に単一な
CMCアーゼＩ（分子量145,000±10,000）とCMCアーゼII
（分子量170,000±20,000）（特願昭61−257777号およ
び特願昭61−257778号）を含有するが、通常のSDS電気
泳動を行うと第６図に示したように、更に30,000±2,00
0〜120,000±15,000の範囲に入る分子量の蛋白が多数階
段状（ladder）に染色される。一方、アルカリセルラー
ゼの標品をポリアクリルアミド電気泳動にかけた後、CM
Cとコンゴーレッドを含む寒天平板にレプリカさせる
と、CMCアーゼ活性部位は少なくとも５個以上の透明帯
として検出される（第７図）。第７図は、本発明のアル
カリセルラーゼの多成分性を示すものである。
上記した、本発明のアルカリセルラーゼの諸性質を公
知のセルラーゼと比較すれば次の通りである。
知のセルラーゼと比較すれば次の通りである。
本アルカリセルラーズは、高pH領域に最適pHを有する
ものであり、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペ
ルギルス属（西沢一俊）、「セルラーゼ」（東京南江
堂、昭和49年刊））、アクレモニウム属（特公昭59−16
6081号）、フミコーラ属（特公昭61−16316号）などに
代表されるカビの中性ないし酸性側に最適pHを有するセ
ルラーゼと区別される。
ものであり、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペ
ルギルス属（西沢一俊）、「セルラーゼ」（東京南江
堂、昭和49年刊））、アクレモニウム属（特公昭59−16
6081号）、フミコーラ属（特公昭61−16316号）などに
代表されるカビの中性ないし酸性側に最適pHを有するセ
ルラーゼと区別される。
また、特公昭50−28515号に開示のアルカリセルラー
ゼと比較した場合は、本アルカリセルラーゼが分子量的
に30万〜３万の少なくとも５種以上の多成分性を有する
ものであるのに対し、上記セルラーゼの分子量が1.5万
ないし３万、バチルスNo.1139のセルラーゼの分子量が
9.2万である点並びに他の物理化学的性質が異なる点に
おいて明らかに区別される。
ゼと比較した場合は、本アルカリセルラーゼが分子量的
に30万〜３万の少なくとも５種以上の多成分性を有する
ものであるのに対し、上記セルラーゼの分子量が1.5万
ないし３万、バチルスNo.1139のセルラーゼの分子量が
9.2万である点並びに他の物理化学的性質が異なる点に
おいて明らかに区別される。
本発明のアルカリセルラーゼは、pH11においても最適
pHの約75〜80％の相対活性を有しており、過去に研究さ
れたアルカリセルラーゼの中でも最もアルカリ側で充分
活性が発揮される酵素群であることがわかる。又、最適
PHが高アルカリ側に強く発揮されるにも拘らず、pH4前
後の強酸性側でも活性を有するという点でも特異的であ
る。このように広いpH領域において安定なセルラーゼは
従来存在しないものである。また、このものは低温でも
充分活性を発揮する特徴を有する。更に、界面活性剤及
びキレート剤や、各種プロテアーゼに対して強力な耐性
を併せ有するアルカリセルラーゼは本発明により初めて
提供されるものである。
pHの約75〜80％の相対活性を有しており、過去に研究さ
れたアルカリセルラーゼの中でも最もアルカリ側で充分
活性が発揮される酵素群であることがわかる。又、最適
PHが高アルカリ側に強く発揮されるにも拘らず、pH4前
後の強酸性側でも活性を有するという点でも特異的であ
る。このように広いpH領域において安定なセルラーゼは
従来存在しないものである。また、このものは低温でも
充分活性を発揮する特徴を有する。更に、界面活性剤及
びキレート剤や、各種プロテアーゼに対して強力な耐性
を併せ有するアルカリセルラーゼは本発明により初めて
提供されるものである。
したがって、本発明のアルカリセルラーゼは、衣料用
洗浄剤添加酵素を始め、バイオマスその他の用途に有効
に利用することができるものである。
洗浄剤添加酵素を始め、バイオマスその他の用途に有効
に利用することができるものである。
次に参考例及び実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。
明する。
参考例1. 栃木県芳賀郡市貝町の土壌1gを滅菌生理食塩水10mlに
懸濁し、80℃で30分間熱処理した。この熱処理液を適当
に希釈してマスタープレート〔肉エキス（オキソイド社
製）１％、バクトペプトン（ディフコ社製）１％、NaCl
1％、KH2PO4 0.1％、Na2CO3 0.5％、バクト寒天1.5
％〕に塗沫し30℃で３日間培養し、集落を形成させた。
レプリカ法により、マスタープレートと同じ組成の培地
に２％CMCを加えた滅菌寒天培地に移植し、30℃で３〜
４日間培養して集落を形成させた後、コンゴ−レッド色
素溶液を流し込み、寒天が赤色化した中で周囲が染色さ
れない集落を検出した。当該する集落をマスタープレー
トから選出し、高力価CMCアーゼ生産菌をスクリーニン
グした。
懸濁し、80℃で30分間熱処理した。この熱処理液を適当
に希釈してマスタープレート〔肉エキス（オキソイド社
製）１％、バクトペプトン（ディフコ社製）１％、NaCl
1％、KH2PO4 0.1％、Na2CO3 0.5％、バクト寒天1.5
％〕に塗沫し30℃で３日間培養し、集落を形成させた。
レプリカ法により、マスタープレートと同じ組成の培地
に２％CMCを加えた滅菌寒天培地に移植し、30℃で３〜
４日間培養して集落を形成させた後、コンゴ−レッド色
素溶液を流し込み、寒天が赤色化した中で周囲が染色さ
れない集落を検出した。当該する集落をマスタープレー
トから選出し、高力価CMCアーゼ生産菌をスクリーニン
グした。
上述の手法により、本発明のバチルス エスピー KS
M−635（FERM BP−1485）を取得することができた。
M−635（FERM BP−1485）を取得することができた。
実施例1. バチルス エスピー KSM−635（FERM BP−1485）を
1.5％肉エキス、0.5％酵母エキス、１％CMC、0.1％KH2P
O4と0.75％Na2CO3からなる液体培地中で、34℃にて２日
間好気培養した。その培養上清液１に対して３の冷
エタノール（−10℃）を徐々に加えて蛋白沈澱を生じさ
せ、得られる沈澱物を最小量の滅菌脱イオン水に溶解
し、希酢酸で中和した後、流水に対して15時間透析し、
凍結乾燥粉末としてアルカリセルラーゼ9.8gを得た。
1.5％肉エキス、0.5％酵母エキス、１％CMC、0.1％KH2P
O4と0.75％Na2CO3からなる液体培地中で、34℃にて２日
間好気培養した。その培養上清液１に対して３の冷
エタノール（−10℃）を徐々に加えて蛋白沈澱を生じさ
せ、得られる沈澱物を最小量の滅菌脱イオン水に溶解
し、希酢酸で中和した後、流水に対して15時間透析し、
凍結乾燥粉末としてアルカリセルラーゼ9.8gを得た。
実施例2. CMC １％、ポリペプトン２％、KH2PO4 0.1％、酵母
エキス0.1％、Na2CO3 0.75％を含む培地100mlを500ml容
三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、バチルス エ
スピー KSM−635（FERM BP−1485）を接種し、30℃で
４日間振盪培養した。培養後、遠心分離により菌体を除
去した上清についてCMCアーゼ活性を測定した結果、3,1
00単位／であった。
エキス0.1％、Na2CO3 0.75％を含む培地100mlを500ml容
三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、バチルス エ
スピー KSM−635（FERM BP−1485）を接種し、30℃で
４日間振盪培養した。培養後、遠心分離により菌体を除
去した上清についてCMCアーゼ活性を測定した結果、3,1
00単位／であった。
この上清を実施例１と同様に処理してアルカリセルラ
ーゼ9.2gを得た。
ーゼ9.2gを得た。
実施例3. CMCを４％庶糖におきかえ、実施例２に従ってバチル
ス エスピー KSM−635（FERM BP−1485）を30℃で２
日間振盪培養する操作を４回行い、それぞれの培養液を
遠心分離して、上清標品Ｉ、II、III、IVを得た。あら
かじめ調製してあったセファクリルＳ−300のカラム
（1.0×115cm）を用い、これらの標品を個別にゲル濾過
（流速13ml×cm2・hr）し、溶出活性画分と分子量の相
関を観察した。標準蛋白として、フェリチン（分子量44
0,000），カタラーゼ（分子量232,000），アルドラーゼ
（分子量158,000），アルブミン（分子量67,000），オ
バルブミン（分子量43,000），キモトリフロシノーゲン
Ａ（分子量25,000），リボヌクレアーゼＡ（分子量13,7
00）を用いて、溶出量と分子量の関係を示す標準曲線を
作製した。その結果、第５図に示すようなアルカリセル
ラーゼの溶出プロフィールを得た。
ス エスピー KSM−635（FERM BP−1485）を30℃で２
日間振盪培養する操作を４回行い、それぞれの培養液を
遠心分離して、上清標品Ｉ、II、III、IVを得た。あら
かじめ調製してあったセファクリルＳ−300のカラム
（1.0×115cm）を用い、これらの標品を個別にゲル濾過
（流速13ml×cm2・hr）し、溶出活性画分と分子量の相
関を観察した。標準蛋白として、フェリチン（分子量44
0,000），カタラーゼ（分子量232,000），アルドラーゼ
（分子量158,000），アルブミン（分子量67,000），オ
バルブミン（分子量43,000），キモトリフロシノーゲン
Ａ（分子量25,000），リボヌクレアーゼＡ（分子量13,7
00）を用いて、溶出量と分子量の関係を示す標準曲線を
作製した。その結果、第５図に示すようなアルカリセル
ラーゼの溶出プロフィールを得た。
実施例4. 実施例３と同様にして上清液Ａ、Ｂ、Ｃを得た。この
上清液A,B及びＣを12％ポリアクリルアミドゲル（7.3×
10.3cm）を用いてスラブ電気泳動（定電流20mA）を行っ
た後、ゲルを２％CMC、100mMグリシン−NaOH緩衝液（pH
9.0）及び500mM NaClを含む0.8％の寒天平板上にレプリ
カした。これを30℃で１時間保温した後、ゲルをはずし
た寒天平板をコンゴ−レッド法に従って1mg/mlコンゴ−
レッド水溶液で15分間染色し、更に1M NaCl水溶液で15
分間洗浄することによってセルラーゼのザイモグラムを
得た（第７図）。
上清液A,B及びＣを12％ポリアクリルアミドゲル（7.3×
10.3cm）を用いてスラブ電気泳動（定電流20mA）を行っ
た後、ゲルを２％CMC、100mMグリシン−NaOH緩衝液（pH
9.0）及び500mM NaClを含む0.8％の寒天平板上にレプリ
カした。これを30℃で１時間保温した後、ゲルをはずし
た寒天平板をコンゴ−レッド法に従って1mg/mlコンゴ−
レッド水溶液で15分間染色し、更に1M NaCl水溶液で15
分間洗浄することによってセルラーゼのザイモグラムを
得た（第７図）。
第１図は本発明アルカリセルラーゼの反応pHと相対活性
を示す図面、第２図は熱処理pHと残存活性の関係を示す
図面、第３図は本発明アルカリセルラーゼの反応温度と
相対活性の関係を示す図面、第４図は処理温度と相対活
性の関係を示す図面、第５図はセファクリルＳ−300ゲ
ルクロマトグラフィー法における分画と活性の関係を示
す図面、第６図はアルカリセルラーゼ成分のCMCアーゼ
ＩとCMCアーゼIIのSDS電気泳動の結果を示す図面、第７
図は本発明のアルカリセルラーゼをスラブ電気泳動した
後、CMCとコンゴ−レッドを含む寒天平板にレプリカし
て得られる透明帯を示す活性染色の図面である。
を示す図面、第２図は熱処理pHと残存活性の関係を示す
図面、第３図は本発明アルカリセルラーゼの反応温度と
相対活性の関係を示す図面、第４図は処理温度と相対活
性の関係を示す図面、第５図はセファクリルＳ−300ゲ
ルクロマトグラフィー法における分画と活性の関係を示
す図面、第６図はアルカリセルラーゼ成分のCMCアーゼ
ＩとCMCアーゼIIのSDS電気泳動の結果を示す図面、第７
図は本発明のアルカリセルラーゼをスラブ電気泳動した
後、CMCとコンゴ−レッドを含む寒天平板にレプリカし
て得られる透明帯を示す活性染色の図面である。
Claims (3)
- 【請求項１】次の物理化学的性質を有するアルカリセル
ラーゼ。 （１） 作用 カルボキシメチルセルロースに作用するCx酵素活性を有
するほか、弱いC1酵素活性、β−グルコシダーゼ活性を
有する。 （２） 基質特異性 カルボキシメチルセルロース、セルロース綿、アビセ
ル、濾紙、セロビオース及びｐ−ニトロフェニルセロビ
オシドに対して作用する。 （３） 作用pH及び至適pH 作用pHは４〜12、至適pHは９〜10である。 （４） 安定pH 40℃で10分間及び30分間放置した時の安定pHはそれぞ
れ、4.5〜10.5及び6.8〜10である。 （５） 作用温度範囲及び作用至適温度 10〜65℃の広い範囲で作用するが、作用至適温度は約40
℃である。 （６） キレート剤の影響 EDTA、EGTA、NTA、STPP及びゼオライトは活性を阻害し
ない。 （７） 界面活性剤の影響 綿状アルキルベンゼスルホン酸ナトリウム、アルキル硫
酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキル
硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン酸
ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウ
ム塩、アルキルスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチ
レンセカンダリーアルキルエーテル、脂肪酸ナトリウム
及びジメチルジアルキルアンモニウムクロライド等の界
面活性剤によって殆んど活性阻害は受けない。 （８） プロテアーゼの影響 プロテアーゼに対し、強い耐性を有する。 （９）分子量 分子篩ゲルクロマトグラフィーによる分子量は約３万、
4.5万、９万、21万、24万または30万である。 - 【請求項２】バチルス エスピー KSM−635の培養物よ
り分離取得されたものである特許請求の範囲第１項記載
のアルカリセルラーゼ。 - 【請求項３】バチルス属に属し、エンドセルラーゼ（CM
Case）活性として分子量的に多成分性を有するアルカリ
セルラーゼを生産する微生物を培養し、その培養物から
該アルカリセルラーゼを取得することを特徴とするエン
ドセルラーゼ（CMCase）活性として分子量的に多成分性
を有するアルカリセルラーゼの製造法。
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|---|---|---|---|
| JP63101678A JP2652871B2 (ja) | 1988-04-25 | 1988-04-25 | アルカリセルラーゼおよびその製造法 |
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| MYPI89000494A MY103999A (en) | 1988-04-25 | 1989-04-17 | Alkaline cellulase and process for producing the same |
| PH38549A PH26879A (en) | 1988-04-25 | 1989-04-21 | Alkaline cellulase and process for producing the same |
| DK195689A DK195689A (da) | 1988-04-25 | 1989-04-24 | Alkalisk cellulase og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
| EP89107397A EP0339550B1 (en) | 1988-04-25 | 1989-04-24 | Alkaline cellulase and process for producing the same |
| ES89107397T ES2072872T3 (es) | 1988-04-25 | 1989-04-24 | Celulosa alcalina y procedimiento para producir la misma. |
| DE68921784T DE68921784T2 (de) | 1988-04-25 | 1989-04-24 | Alkalische Cellulase und Verfahren zu deren Herstellung. |
| HK155095A HK155095A (en) | 1988-04-25 | 1995-09-28 | Alkaline cellulase and process for producing the same |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63101678A JP2652871B2 (ja) | 1988-04-25 | 1988-04-25 | アルカリセルラーゼおよびその製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01273587A JPH01273587A (ja) | 1989-11-01 |
| JP2652871B2 true JP2652871B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=14307009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63101678A Expired - Fee Related JP2652871B2 (ja) | 1988-04-25 | 1988-04-25 | アルカリセルラーゼおよびその製造法 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2652871B2 (ja) |
| DE (1) | DE68921784T2 (ja) |
| DK (1) | DK195689A (ja) |
| ES (1) | ES2072872T3 (ja) |
| HK (1) | HK155095A (ja) |
| MY (1) | MY103999A (ja) |
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| US5320960A (en) * | 1992-04-03 | 1994-06-14 | Genencor International, Inc. | Method of preparing solution enriched in xylanase using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt |
| US5275944A (en) * | 1989-09-26 | 1994-01-04 | Midwest Research Institute | Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068 |
| US5688290A (en) * | 1989-10-19 | 1997-11-18 | Genencor International, Inc. | Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes |
| JPH0427386A (ja) * | 1990-05-24 | 1992-01-30 | Kao Corp | プロテアーゼ耐性セルラーゼ、これを産生する微生物及び該セルラーゼの製造法 |
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| US5328841A (en) * | 1990-10-05 | 1994-07-12 | Genencor International, Inc. | Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol |
| US5290474A (en) * | 1990-10-05 | 1994-03-01 | Genencor International, Inc. | Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp |
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| US5650322A (en) * | 1990-10-05 | 1997-07-22 | Genencor International, Inc. | Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases |
| DE69225454T2 (de) * | 1991-07-01 | 1998-10-01 | Ahc Inc | Bacillus Bakterium und dessen Verwendung |
| AU678356B2 (en) * | 1992-05-01 | 1997-05-29 | Genencor International, Inc. | Methods for treating cotton-containing fabrics with CBH I enriched cellulase |
| US5945327A (en) | 1992-07-02 | 1999-08-31 | Novo Nordisk A/S | DNA constructs and methods of producing cellulytic enzymes |
| DK87092D0 (da) * | 1992-07-02 | 1992-07-02 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
| WO1994001532A1 (en) * | 1992-07-02 | 1994-01-20 | Novo Nordisk A/S | ALKALOPHILIC BACILLUS sp. AC13 AND PROTEASE, XYLANASE, CELLULASE OBTAINABLE THEREFROM |
| EP0636740A4 (en) * | 1993-02-18 | 1995-08-30 | Meiji Seika Co | PREPARATION OF CELLULASE AND ITS USE FOR THE TREATMENT OF CELLULOSE FIBERS. |
| US5691295A (en) * | 1995-01-17 | 1997-11-25 | Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh | Detergent compositions |
| DE19515072A1 (de) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Cognis Bio Umwelt | Cellulasehaltiges Waschmittel |
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| DE19725508A1 (de) | 1997-06-17 | 1998-12-24 | Clariant Gmbh | Wasch- und Reinigungsmittel |
| JP3612414B2 (ja) * | 1997-11-21 | 2005-01-19 | 信越化学工業株式会社 | 衣類用洗剤組成物 |
| DE19914811A1 (de) | 1999-03-31 | 2000-10-05 | Henkel Kgaa | Enzym- und bleichaktivatorhaltige Wasch- und Reinigungsmittel |
| ATE357497T1 (de) | 2002-12-20 | 2007-04-15 | Henkel Kgaa | Bleichmittelhaltige wasch- oder reinigungsmittel |
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| CN114517169B (zh) * | 2022-03-11 | 2024-03-22 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一株链霉菌菌株sem-14及其衍生产品和应用 |
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- 1989-04-14 US US07/339,592 patent/US5045464A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|
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