JPH0630578B2

JPH0630578B2 - アルカリセルラ−ゼｋ

Info

Publication number: JPH0630578B2
Application number: JP25777686A
Authority: JP
Inventors: 進伊藤; 謙造小池; 裕一太田; 章武井; 暉公彦岡本
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1986-10-28
Filing date: 1986-10-28
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPS63109776A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なセルラーゼに関し、更に詳細にはアルカ
リ側に最適pHを有する新規酵素アルカリセルラーゼＫに
関する。

〔従来の技術〕

セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコース、
又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵
素反応を触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構
により、C₁酵素、C_x酵素とβ−グルコシダーゼ、或いは
エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナー
ゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素の総称と理
解されている。長年、セルラーゼ研究の歴史は専らバイ
オマス資源の有効利用を図る目的から進められてきてお
り、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレ
モニウム属、フミコーラ属などのカビの類にその供給源
を求めてきた。然るに、カビを含めて微生物起源のセル
ラーゼには、その構成酵素群の作用特異性や物理化学的
諸性質等の多様性が有り、その実態は未だ明確化された
とは言い難い。

最近、セルラーゼの新規な産業用途として、例えば、衣
料用洗浄剤組成物の添加成分としての用途が開発されつ
つある。しかしながら、自然界において微生物の産生す
るセルラーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎ
り、大部分がアルカリpHにおいて失活する不安定性を有
する、いわゆる酸性セルラーゼ（最適作用pHが４〜６）
であつて、衣料用洗浄剤組成物の要件である、アルカリ
側で最大活性を有し、且つ耐性を有する、いわゆるアル
カリセルラーゼの存在は極めて少ないのが実情である。

すなわち、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカ
リセルラーゼに関しては、好アルカリ性微生物起源のア
ルカリセルラーゼを生産する方法として、バチルス属に
属する細菌を培養して培地よりセルラーゼＡを採取する
方法（特公昭５０−2851 5号公報）、セルロモナス属に
属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ
301−Ａを生産する方法（特開昭５８−224686号公
報）、好アルカリ性バチルスNO.1139を培養してカルボ
キシメチルセルラーゼを生産する方法（Horikoshiら、
J.Gen.Microbiol.,131巻，3339頁（1985年））、及びス
トレプトマイセス属の種を用いてアルカリセルラーゼを
生産する方法（特開昭６１−19483号公報）が知られて
いるにすぎない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従つて、アルカリ側において至適pHを有し、衣料洗浄用
酵素としての機能を有するアルカリセルラーゼを新たに
提供することが要望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自
然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県芳
賀郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物が、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規なアル
カリセルラーゼを生産することを見出し、本発明を完成
した。

したがつて、本発明は新規酵素アルカリセルラーゼＫを
提供するものである。

本発明のアルカリセルラーゼＫを生産する上記微生物
は、次のような菌学的性状を示す。なお、以下において
菌株の分類に用いた培地は次の培地Ａ〜Ｘの２４種類で
あり、特にことわりの無い限り別滅菌した適当量の炭酸
ナトリウム（Na₂CO₃）を含有する。

使用した培地の組成（表示は重量％）：培地Ａ：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；バク
ト寒天，1.５；Na₂CO₃，1.０培地Ｂ：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；Na₂C
O₃，1.０培地Ｃ：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；食
塩，7.０；Na₂CO₃，1.０培地Ｄ：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；バク
トゼラチン，２0.０；Na₂CO₃，1.０培地Ｅ：バクトリトマスミルク，１0.５；Na₂CO₃，1.０培地Ｆ：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；KN
O₃，0.１；Na₂CO₃，1.０培地Ｇ：バクトペプトン，0.７；グルコース，0.５；食
塩，0.５；Na₂CO₃，1.０培地Ｈ：バクトペプトン，3.０；肉エキス，0.３；チオ
硫酸ナトリウム．0.００５；塩酸システイン，0.０２；
クエン酸鉄アンモニウム，0.０５；バクト寒天，0.５；
Na₂CO₃，1.０培地Ｉ：バクトペプトン，1.５；肉エキス，0.４；乳
糖，1.０；蔗糖，1.０；グルコース，1.０；食塩，0.
５；チオ硫酸ナトリウム，0.００８；亜硫酸ナトリウ
ム，0.０４；硫酸第一鉄．0.０２；フエノール・レツ
ド，0.００２；バクト寒天，1.５；Na₂CO₃，1.０培地Ｊ：バクトペプトン，1.５；酵母エキス，0.５；可
溶性澱粉，2.０；K₂HPO₄，0.１；バクト寒天，1.５；Mg
SO₄・7H₂O，0.０２；Na₂CO₃，1.０培地Ｋ：リン酸アンモニウム，0.１；塩化カリウム，0.
０２；酵母エキス，0.０５；MgSO₄・7H₂O，0.０２；糖
類，1.０（濾過滅菌）；Na₂CO₃，1.０培地Ｌ：リン酸−水素カリウム，0.１；リン酸二水素ア
ンモニウム，0.１；クエン酸ナトリウム，0.２；MgSO₄・
7H₂O，0.０３；食塩，0.５；ブロム・チモール・ブル
ー，0.００２４；バクト寒天，1.５；Na₂CO₃，1.０培地Ｍ：酵母エキス，0.０５；塩酸システイン，0.０
１；クエン酸ナトリウム，0.３；食塩，0.５；チオ硫酸
ナトリウム，0.００８；クエン酸鉄アンモニウム，0.０
４；グルコース，0.０２；リン酸二水素カリウム，0.１
５；フエノール・レツド，0.００１２；バクト寒天，
1.；Na₂CO₃，1.０培地Ｎ：リン酸アンモニウム，0.１；リン酸二水素カリ
ウム，0.０５；クエン酸ナトリウム，0.２；バクト寒
天，1.５；MgSO₄・7H₂O，0.０２；Na₂CO₃，1.０培地Ｏ：酵母エキス，0.０５；Na₂SO₄，0.１；KH₂PO₄，
0.１；グルコース，1.０；Na₂CO₃，1.０；無機窒素源，
適当量^＊＊硝酸ナトリウムは0.２５％、亜硝酸ナトリウムは0.２
０２５％，塩化アンモニウムは0.１５８％，リン酸アン
モニウムは0.１９５％（各々0.０４１２Ｎ％に相当）に
なるように加えた。

培地Ｐ：酵母エキス，0.０５；Na₂SO₄，0.１；KH₂PO₄，
0.１；グルコース，1.０；無機窒素源，適当量^＊＊；Ca
Cl₂・2H₂O，0.０５；MnSO₄・４〜6H₂O，0.００１；FeSO₄
・7H₂O，0.００１（濾過滅菌）；MgSO₄・7H₂O，0.０２
（濾過滅菌）；Na₂CO₃，1.０＊＊硝酸ナトリウムは0.２５％，亜硝酸ナトリウムは0.
２０２５％，塩化アンモニウムは0.１５８％，リン酸ア
ンモニウムは0.１９５％（各々0.０４１２Ｎ％に相当）
になるように加えた。

培地Ｑ：キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量；Na₂CO₃，1.０培地Ｒ：キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量；Na₂CO₃，1.０培地Ｓ：ポテトデキストロース寒天培地“栄研”（栄研
化学社製），指示量；Na₂CO₃，1.０培地Ｔ：バクトペプトン，0.２５；食塩，0.２５；酵母
エキス，0.２５；マンニツト，0.５；バクト寒天，2.
０；Na₂CO₃，1.０培地Ｕ：尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量；
Na₂CO₃，1.０培地Ｖ：バクトペプトン，0.１；食塩，0.５；KH₂PO₄，
0.２；酵母エキス，0.０５；グルコース，0.１；尿素，
2.０；フエノール・レツド，0.００１；Na₂CO₃，1.０培地Ｗ：バクトペプトン，0.５；酵母エキス，0.５；K₂
HPO₄，0.１；グルコース，1.０；MgSO₄・7H₂O，0.０２；
Na₂CO₃，1.０培地Ｘ：酵母エキス，0.５；グルコース，1.０；カゼイ
ン（ハーマーシユタイン，メルク社製），0.５；K₂HP
O₄，0.１；MgSO₄・7H₂O，0.０２；バクト寒天，1.５；Na
₂CO₃，1.０（菌学的性状）１．顕微鏡的観察結果菌体の大きさは、0.５〜1.２μｍ×1.５〜4.０μｍの桿
菌であり、菌体の一端に内生胞子（0.７〜1.２μｍ×1.
０〜2.０μｍ）を形成する。又、周鞭毛を有して運動性
があり、グラム染色では陽性を示した。

２．各種培地における生育状態肉汁寒天培地（培地Ａ）集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平状である。
又、集落の色調は白色乃至黄色の半透明であり、光沢が
ある。

肉汁液体培地（培地Ｂ）生育し、混濁する。培地を中性pHにすると、ほとんど生
育しない。

７％食塩肉汁液体培地（培地Ｃ）生育し、混濁する。

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地Ｄ）生育しない。

リトマスミルク培地（培地Ｅ）ミルクの凝固、ペプトン化は認められず、又培地Ｄがア
ルカリ性のため、リトマスの変色も認められなかつた。

３．生理学的性質硝酸塩の還元及び脱窒反応硝酸還元するが、脱窒反応は認められない（培地Ｆ）。

ＭＲテスト（培地Ｇ）培地がアルカリ性のため、メチルレツドの変化は認めら
れず、判定できなかつた。

ＶＰテスト（培地Ｇ）陽性。

インドールの生成（培地Ｈ）インドール産生試験用濾紙（「ニツサン」，日水製薬社
製）に対する反応、コバツクの試薬に対する呈色のいず
れに対しても陰性であり、実際上、陰性といえる。

硫化水素の生成（培地Ｉ）陰性。

澱粉の加水分解平板寒天培地、培地Ｊ、を４Ｎ塩酸で酸性にしても通常
のヨウ素反応による検出法では陰性といえる。又、液体
培地Ｋにおいても可溶性澱粉の資化性は認められない。

クエン酸の利用培地Ｋ；クエン酸を利用する。

コーサ（シモンズ）のクエン酸寒天平板培地（培地
Ｌ）；生育せず。培地Ｌから寒天を除き0.０５％の酵母
エキスを加えた液体培地では、クエン酸の資化が認めら
れる。

クリステンセンの寒天平板培地（培地Ｍ）；生育する
が、アルカリ性のためフエノールレツドの変化なし。

培地Ｎ；クエン酸を利用しない。培地Ｎから寒天を除き
0.０５％の酵母エキスを加えた液体培地では、クエン酸
の資化が認められる。

無機窒素源の利用培地Ｏ；硝酸、亜硝酸、アンモニアのいずれも陰性から
微弱であり、実質上資化性は認められない。

培地Ｐ；微量金属塩類を含有する本培地では、硝酸と亜
硝酸は旺盛に資化される。一方、塩化アンモニウムの利
用性は微弱であるが、リン酸アンモニウムは利用する。

色素の生成キングＡ培地（培地Ｑ）では生育せず。

キングＢ培地（培地Ｒ）では淡黄色を呈するが、螢光性
はなかつた。又、ポテトデキストロース寒天培地（培地
Ｓ）とマンニツト酵母エキス寒天培地（培地Ｔ）では生
育するが、色素の生成は認められなかつた。

ウレアーゼ培地Ｕ；生育せず。培地Ｕからフエノール・レツドを除
き、本菌を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を
確認したが、陰性。

培地Ｖ（クリステンセンの尿素培地に酵母エキスを添
加）；培地からフエノール・レツドを除き、本菌を培養
後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確認したが、陰
性。又、細胞毒性を予測して、培地Ｖの尿素濃度を0.
１，0.２，0.５，1.０，2.０％と変化させて試験した
が、ウレアーゼ活性は陰性であつた。

オキシダーゼ陽性、陰性はつきりせず。

カタラーゼ陽性生育の範囲（培地Ｗ）生育温度範囲は２０〜４５℃にあり、生育最適温度範囲
は２９〜３７℃であつた。

生育のpH範囲を調べる目的で、培地ＷのNa₂CO₃の濃度を
変えて培地の初発pHを変えて試験したところ、生育pH範
囲は８〜１１にあり、生育最適pH範囲は9.５〜１0.２で
あつた。一方、K₂CO₃で培地のpHを調整すると、生育量
は著しく少なく、生育至適pHは、約９であつた。

酸素に対する態度好気的Ｏ−Ｆテストアルカリ性のため変色せず。好気のみ生育する。

糖類の利用性（培地Ｋ）利用できる炭素源：Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハロース、Ｄ−
マンニツト、イノシツト、グリセリン利用できない炭素源：Ｄ−ガラクトース、乳糖、Ｄ−ソ
ルビツト、デンプン、デキストリン、ラフイノースカゼインの加水分解（培地Ｘ）寒天平板培地Ｘに、菌を生育せしめ、３０％トリクロロ
酢酸を流し込んで判定したが、菌体周囲に透明帯を形成
せず、カゼインの分解性は陰性と判定した。

栄養要求性ビオチン（又はデスチオビオチン）を生育に必要とする
（第１表）。

以上の菌学的性質について、バージーズ・マニユアル・
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー（Berge
y′ｓ Mannual of Determinative Bacteriology）第８
版を参照した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス
（Bacillus）属の一種であると認められる。しかし、本
菌株が中性pHでは生育できず、専ら高アルカリpHで良好
な生育を示すことから、最近、掘越と秋葉（“Alkaloph
ilic Microorganism”，Japan Scientific Society Pre
ss(Tokyo),1982年刊）の主張する、いわゆる好アルカリ
性（alkalophilic）微生物として暫定的に、従来の中性
で生育するバチルスと区別される。

そして、本菌株の菌学的性質は、公知の好アルカリ性バ
チルスのいずれとも一致しないのでこれを新規菌株と判
断してバチルスエスピー KSM-635と命名し、微工研
菌寄第8872号として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託した。

上記の好アルカリ性バチルスエスピー KSM-635(FERM
P-8872）を使用したアルカリセルラーゼＫの製造は、
当該微生物はもとより、より高力価の当該酵素生産性を
有する各種突然変異株を上述の適当な培地に接種し、培
養することにより実施される。

アルカリセルラーゼＫの発酵生産にあたり、適当な培地
を加熱等により殺菌後、バチルスエスピー KSM-635
(FERM P-8872）を接種し、２２℃〜４０℃、好ましくは
２６℃〜３７℃で、１〜４日振盪又は通気攪拌培養すれ
ば良い。pHは８〜１１に調製すると良い結果が得られ
る。発酵生産培地がアルカリ性なので、時として発泡す
るが、適当な消泡剤を適宜添加することによつて解消さ
れる。

本発明のアルカリセルラーゼＫ生産には、資化し得る窒
素源と炭素源を適宜組み合わせて培養培地に含有させれ
は良く、特に両栄養源を限定するものではない。例え
ば、窒素源としては、無機態の硝安、硫安、塩安、リン
酸アンモニウム、更に硝酸ソーダやコーングルテンミー
ル、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母
エキス、フアーマメデイア、イワシミール、肉エキス、
ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンソイビーンミ
ール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレ
ツクス、アジプロン、ゼスト、アジツクスなどが挙げら
れる。又、炭素源としては、籾殻、麸、濾紙、一般紙
類、おが屑、などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カル
ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アビセル、セルロ
ース綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素
源、例えば、リボース、アラビノース、キシロース、グ
ルコース、マンノース、フラクトース、麦芽糖、シヨ
糖、トレハロース、マンニツト、イノシツト、グリセリ
ンや資化し得る有機酸、例えば、酢酸、クエン酸などが
挙げられる。いわば、ビオチン誘導体を含有する培地で
あれば、これらの窒素源と炭素源を適宜組み合わせたい
かなる培地を使用しても良く、上述の栄養源を特に限定
するものではない。その他、リン酸、Mg²⁺，Ca²⁺，M
n²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Na⁺，K⁺などの無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を含有する培地を適宜選択し
て使用される。

斯くして得られた培養物中から目的物質であるアルカリ
セルラーゼＫの収得は、例えば、後記実施例に示す如
く、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うこと
ができる。

すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等によつて菌体
を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手段、
例えば、塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法（メタノー
ル、エタノール、イソプロパノール等）によつて蛋白を
沈澱させたり、又限外濾過（例えばダイアフローメンブ
レンＹＣ、アミコン社製）により濃縮させてアルカリセ
ルラーゼＫを得る。塩析法では例えば、硫安（３０〜７
０％飽和画分）、溶媒沈澱では例えば、７５％エタノー
ル中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩
することによつてこれを凍結乾燥粉末とすることも可能
である。脱塩の方法としては透析又はセフアテツクス
Ｇ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いら
れる。さらに、酵素を精製するには例えば、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフイー、ＤＥＡＥ−セフアデツ
クス又はＤＥＡＥ−セルロース等のイオン交換クロマト
グラフイー及びセフアデツクスやバイオゲルのような分
子篩ゲルクロマトグラフイーを適宜組み合わせて分別精
製すれば良い。

斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼＫは、以
下に示すような物理化学的性質を有する。

(1)作用本酵素は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に作
用するC_x酵素活性を有する。しかしながら、更に、リン
酸膨潤セルロースにも作用し、作用特異性として結晶性
セルロース（セルロース綿）や結晶性の高いセルロース
であるアビセルに作用する酵素（すなわちアビセラー
ゼ）と濾紙崩壊活性（ＦＰアーゼ）などに代表されるC₁
酵素、セロビオースやセロオリゴ糖に作用するβ−グル
コシダーゼ活性も有する。また、人工基質であるｐ−ニ
トロフエニルセロビオシドに対しても若干ながら作用し
てｐ−ニトロフエノールを遊離させる。

(2)基質特異性アルカリセルラーゼＫは、キシラン、アミロース、デキ
ストリン、ペクチン、イヌリン、カードランに対し、分
解能力を有しない。アビセラーゼ、及びＦＰアーゼ活性
（C₁活性）は、ＣＭＣアーゼ活性の約0.３％であつた。
また、人工基質、ｐ−ニトロフエニルセロビオシド分解
活性は、その約1.５〜1.８％である（第２表）。

(3)作用pH及び至適作用pH 本酵素の作用pHは４〜１２、至適作用pHは大凡９〜１０
に認められる。なお、pH10.５付近にシヨルダを有する
（第１図）。

(4)安定pH pHの異なる緩衝液の下、４０℃で１０分間及び３０分間
放置した時の安定pHはそれぞれ、4.５〜１0.５及び6.８
〜１０である（第２図）。５℃で放置すると、pH４〜１
１で少なくても一ケ月は安定である。

(5)作用温度範囲及び作用至適温度本酵素は低温で１０℃、高温で６５℃の広い範囲で作用
するが、グリシン緩衝液（pH９）の下で２０分間反応さ
せた時の作用至適温度は約４０℃に認められる（第３
図）。

(6)熱安定性グリシン緩衝液（pH９）の下で、各温度で２０分間加熱
処理した結果、本酵素は約４０℃では全く失活せず、６
０℃で約５０％、７０℃で約２５％の残存活性を有する
（第４図）。

(7)酵素活性測定法ＣＭＣアーゼ活性ＣＭＣ（2.５％）0.２ｍ、0.５Ｍグリシン緩衝液（pH
9.０）0.１ｍ、及び脱イオン水0.１ｍからなる基質
溶液に酵素液0.１ｍを加え、４０℃、２０分間反応し
た。反応後、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−
dinitro-salicylicacid(DNS)）法にて還元糖の定量を行
つた。すなわち、反応液0.５ｍにＤＮＳ試薬１ｍを
加え、５分間１００℃で加熱発色させ、冷却後、4.５ｍ
の脱イオン水を加えて希釈した。これを波長５３５nm
で比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に
１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位とした。

ｐ−ニトロフエニルセロビオシド分解活性１００μmolリン酸緩衝液（pH7.０）、0.１μmolｐ−ニ
トロフエニルセロビオシド（シグマ社）を含む反応液1.
０ｍ中に適当量のＣＭＣアーゼを３０℃で作用させた
後、１ＭNa₂CO₃を0.３ｍ、脱イオン水を1.７ｍ順次
加え、遊離するｐ−ニトロフエノールを４００nmで比色
定量した。この条件で１分間に１μmolのｐ−ニトロフ
エノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

アビセラーゼ及びＦＰアーゼ活性ＣＭＣアーゼ活性測定用反応液２ｍ中、基質ＣＭＣに
代えて２０mgのアビセル（メルク社）、又は塊状にし
た、幅0.5cm、長さ５cmの濾紙片（セルラーゼ活性度検
定用濾紙、東洋NO.５１−特）を加え、アビセラーゼ及
びＦＰアーゼ活性を測定した。この条件で１分間にグル
コース換算で１μmolの還元糖を遊離させる酵素量を１
単位とした。

蛋白定量法は、バイオ・ラドプロテインアツセイ
キツト（バイオ・ラド社）を用いて、牛血清アルブミ
ンを標準蛋白として算出した。

(8)キレート剤の影響洗浄剤用酵素として、その反応組成物であるビルダーの
中でキレート剤に対する耐性は最も重要な因子である。
アルカリセルラーゼＫをＥＤＴＡ（0.５ｍＭ）、ＥＧＴ
Ａ（0.５ｍＭ）、ＮＴＡ（0.５ｍＭ）、トリポリリン酸
（５０mg／ｍ）で前処理した後、残存活性を測定した
ところ、全く阻害は認められない。

(9)プロテアーゼの影響洗浄組成物として、プロテアーゼは洗浄力を向上せしめ
る作用がある。従つて、プロテアーゼ入り洗浄剤にセル
ラーゼを共存させて、更なる洗浄力の向上を求めるのは
当然である。このことは洗浄剤用セルラーゼがプロテア
ーゼで加水分解せず、活性が安定に保持される要件を満
たす必要がある。アルカリセルラーゼＫは実用されてい
る洗浄剤用プロテアーゼ（例えば、ＡＰＩ−２１、マク
サターゼ、アルカラーゼ等）や一般のプロテアーゼ（例
えば、プロナーゼ）に対して強力な耐性を有している
（第３表）。

(10)金属等の影響適当な濃度の２価の金属イオン（Hg²⁺，Cu²⁺等）は阻害
効果を与える。モノヨード酢酸、パラマーキユリ安息香
酸によつて若干の阻害を受ける。

(11)界面活性剤の影響アルカリセルラーゼＫは各種界面活性剤、例えば、線状
アルキルベンゼスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、アル
キル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、ポリオキシエ
チレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、α
−オレフインスルホン酸ナトリウム（ＡＯＳ）、α−ス
ルフオン化脂肪酸エステルナトリウム塩（α−ＳＦ
Ｅ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）、ポリ
オキシエチレンセカンダリーアルキルエーテル、脂肪酸
塩（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキルアンモニウ
ムクロライド等の界面活性剤によつて殆んど活性阻害は
受けなかつた。

(12)分子量（ゲルクロマトグラフイー法） 180,000±10,000に最大ピークを有する（第５図）。

上記した、本発明のアルカリセルラーゼＫの諸性質を公
知のセルラーゼと比較すれば次の通りである。

本アルカリセルラーゼは、高pH領域に最適pHを有するも
のであり、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペル
ギルス属（西沢一俊、「セルラーゼ」（東京南江堂、昭
和４９年刊））、アクレモニウム属（特公昭５９−1660
81）、フミコーラ属（特公昭６１−16316）などに代表
されるカビの中性ないし酸性側に最適pHを有するセルラ
ーゼと区別されるものであることは明らかである。

また、特公昭５０−28515号に開示のアルカリセルラー
ゼと比較した場合は、本アルカリセルラーゼが分子量と
して１８万±１万に最大ピークを有するものであるのに
対し、上記セルラーゼの分子量が１．５万ないし３万、
バチルスNO.1139のセルラーゼの分子量が９．２万であ
る点並びに他の物理化学的性質が異なる点において明ら
かに区別される。

〔作用及び発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼＫは、pH１１においても最
適pHの約７５〜８０％の相対活性を有しており、過去に
研究されたアルカリセルラーゼの中でも最もアルカリ側
で充分活性が発揮される酵素群であることがわかる。
又、最適pHが高アルカリ側に強く発揮されるにも拘ら
ず、pH４前後の強酸性側でも活性を有するという点でも
特異的である。このように広いpH領域において安定なセ
ルラーゼは従来存在しないものである。また、このもの
は低温でも充分活性を発揮する特徴を有する。更に、界
面活性剤及びキレート剤や、各種プロテアーゼに対して
強力な耐性を併せ有するアルカリセルラーゼは本発明に
より初めて提供されるものである。

したがつて、本発明のアルカリセルラーゼＫは、衣料用
洗浄剤添加酵素を始め、バイオマスその他の用途に有効
に利用することができるものである。

〔実施例〕

次に参考例及び実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
する。

参考例１．栃木県芳賀郡市貝町の土壌１ｇを滅菌生理食塩水１０ｍ
に懸濁し、８０℃で３０分間熱処理した。この熱処理
液を適当に希釈してマスタープレート（肉エキス（オキ
ソイド社製）１％、バクトペプトン（デイフコ社製）１
％、NaCl１％、KH₂PO₄0.１％、Na₂CO₃0.５％、バクト寒
天1.５％）に塗沫し３０℃で３日間培養し、集落を形成
させた。レプリカ法により、マスタープレートと同じ組
成の培地に２％ＣＭＣを加えた滅菌寒天培地に移植し、
３０℃で３〜４日間培養して集落を形成させた後、コン
ゴーレツド色素溶液を流し込み、寒天が赤色化した中で
周囲が染色されない集落を検出した。当該する集落をマ
スタープレートから選出し、高力価ＣＭＣアーゼ生産菌
をスクリーニングした。

上述の手法により、本発明のバチルスエスピー KSM-
635(FERM P-8872）を取得することができた。

実施例１．バチルスエスピー KSM-635(FERM P-8872）を1.５％
肉エキス、0.５％酵母エキス、１％ＣＭＣ、0.１％KH₂P
O₄と0.７５％Na₂CO₃からなる液体培地中、３４℃で２日
間好気培養した。その培養上清液１に対して３の冷
エタノール（−１０℃）を徐々に加えて蛋白沈澱を生じ
させ、得られる沈澱物を最小量の滅菌脱イオン水に溶解
し、希酢酸で中和した後、流水に対して１５時間透析
し、凍結乾燥粉末としてアルカリセルラーゼＫ9.８ｇを
得た。

実施例２．ＣＭＣ１％、ポリペプトン２％、KH₂PO₄0.１％、酵母エ
キス0.１％、Na₂CO₃0.７５％を含む培地（pH8.４〜8.
６）１００ｍを５００ｍ容三角フラスコに入れ、常
法により殺菌後、バチルスエスピー KSM-635(FERM P
-8872）を接種し、３０℃で４日間振盪培養した。培養
後、遠心分離により菌体を除去した上清についてＣＭＣ
アーゼ活性を測定した結果、3,100単位／であつた。

この上清を実施例１と同様に処理してアルカリセルラー
ゼＫ9.２ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明アルカリセルラーゼＫの反応pHと相対
活性を示す図面、第２図は熱処理pHと残存活性の関係を
示す図面である。第３図は、本発明アルカリセルラーゼＫの反応温度と相
対活性の関係を示す図面、第４図は処理温度と相対活性
の関係を示す図面である。第５図は、ゲルクロマトグレフイー法における分画と活
性の関係を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡本暉公彦埼玉県越谷市七左町１−229−８ (56)参考文献特公昭50−28515（ＪＰ，Ｂ２)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の物理化学的性質を有するアルカリセル
ラーゼＫ。 (1)作用カルボキシメチルセルロースに作用するC_x酵素活性を有
するほか、弱いC₁酵素活性、β−グルコシダーゼ活性を
有する。 (2)基質特異性カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、アビ
セル、セロビオース及びｐ−ニトロフエニルセロビオシ
ドに対して作用する。 (3)作用pH及び至適pH 作用pHは４〜１２、至適pHは９〜１０である。 (4)安定pH ４０℃で１０分間及び３０分間放置した時の安定pHはそ
れぞれ、4.５〜１0.５及び6.８〜１０である（第２
図）。 (5)作用温度範囲及び作用至適温度１０〜６５℃の広い範囲で作用するが、作用至適温度は
約４０℃に認められる（第３図）。 (6)キレート剤の影響 EDTA、EGTA、NTA、STPP及びゼオライトは活性を阻害し
ない。 (7)界面活性剤の影響線状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（LAS）、
アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ES）、ポリオキシ
エチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（ES）、α
−オレフインスルホン酸ナトリウム（AOS）、α−スル
フオン化脂肪酸エステルナトリウム塩（α−SFE）、ア
ルキルスルホン酸ナトリウム（SAS）、ポリオキシエチ
レンセカンダリーアルキルエーテル、脂肪酸塩（ナトリ
ウム塩）及びジメチルジアルキルアンモニウムクロライ
ド等の界面活性剤によつて殆んど活性阻害を受けない。 (8)プロテアーゼの影響プロテアーゼに対し、強い耐性を有する。 (9)分子量（ゲルクロマトグラフイー法） 180,000±10,000に最大ピークを有する（第５図）。
【請求項２】バチルスエスピー KSM-635の培養物よ
り分離取得されたものである特許請求の範囲第１項記載
のアルカリセルラーゼＫ。