JPH0632612B2

JPH0632612B2 - アルカリセルラ−ゼ製造法

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Publication number: JPH0632612B2
Application number: JP25938186A
Authority: JP
Inventors: 進伊藤; 裕一太田; 資通四方; 章武井; 暉公彦岡本
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1986-10-30
Filing date: 1986-10-30
Publication date: 1994-05-02
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPS63112981A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、アルカリセルラーゼの製造法に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコース、
又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵
素反応を触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構
により、Ｃ₁酵素、Ｃ_x酵素とβ−グルコシダーゼ、或い
はエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナー
ゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素の総称と理
解されている。長年、セルラーゼ研究の歴史は専らバイ
オマス資源の有効利用を図る目的から進められてきてお
り、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレ
モニウム属、フミコーラ属などのカビの類にその供給源
を求めてきた。

最近、セルラーゼの新規な産業的用途として、例えば、
衣料用洗浄剤組成物としての用途が開発されつつある。
しかしながら、自然界において微生物の産生するセルラ
ーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎり、大部分
がアルカリpHにおいて失活する不安定性を有する、いわ
ゆる酸性セルラーゼ（最適作用pHが４〜６）であつて、
衣料用洗浄剤組成物としては不適当なものである。また
一方、アルカリ側で最大活性を有し、且つ耐性を有す
る、いわゆるアルカリセルラーゼについてもその探索が
おこなわれているが、その存在は極めて少ないのが実情
である。

すなわち、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカ
リセルラーゼを産生する微生物及びこれを取得する方法
に関しては、好アルカリ性微生物起源のアルカリセルラ
ーゼを生産する方法として僅かに、バチルスに属する細
菌を培養して培地よりセルラーゼＡを採取する方法（特
公昭５０−２８５１５号公報）、セルロモナス属に属す
る細菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産
する方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、バチル
スNO.１１３９を培養してカルボキシメチルセルラーゼ
を生産する方法（Horikoshiら、ジヤーナルオブジ
エネラルマイクロバイオロジー，１３１巻，３３３９
頁（１９８５年））、及びストレプトマイセス属の種を
用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭６１
−１９４８３号公報）が知られているにすぎず、これに
最近本発明者が見出したバチルスエスピー KSM−６
３５株を用いるアルカリセルラーゼＫ、CMCアーゼＩ及
びCMCアーゼIIの製造方法を加えても十指に満たない報
告しか得られていない。

しかも、これらの方法に用いるほとんどの微生物のアル
カリセルラーゼの発酵生産性が不十分で、工業的に十分
満足のゆく高産生株は得られていなかつた。

すなわち、アルカリセルラーゼ生産菌、特にアルカリCM
Cアーゼ生産菌としてはバチルス属菌の酵素が大半を占
めるがこのうち、例えばバチルスエスピーＮ₁(FERM P
-1138)、Ｎ₂(FERM P-1139)、Ｎ₃(FERM P-1140)、および
Ｎ₄(FERM P-1141)のセルラーゼ生産能は培養（誘導）基
質としてカルボキシメチルセルロース（CMC）を用いて
最高値でも５６０単位／と推定される（特公昭５０−
２８５１５号）にすぎない。またバチルスエスピーＮ
₄の生産するセルラーゼについては、キヤナデイアン
ジヤーナルオブマイクロバイオロジー，３０巻，７
７４頁（１９８４）に記述が認められ、Ｎ₄株はCMCを炭
素源として、培養液中にいわゆる中性セルラーゼを生産
するがその生産性は低く、又、中性セルラーゼとアルカ
リセルラーゼが同時に生産されているという。更に最
近、福森ら（ジヤーナルオブジエネラルマイクロ
バイオロジー１３１巻，３３３９頁，１９８５年）はバ
チルスエスピー NO.１１３９の生産するアルカリセ
ルラーゼについて詳述しているが、本菌株の生産する当
該酵素の生産性は、基質炭素源（誘導物質）としてCMC
が最も良好であるが、たかだか８３０単位／を認めて
いるにすぎず、セロビオースでその約半分の生産性しか
ない。

このように、バチルス属細菌を用いてアルカリセルラー
ゼを生産する方法は通常CMC、あるいは木綿やアビセル
などの炭素源と有機窒素源及び／又は無機窒素源と微量
の金属塩及び無機塩を含む液体培地（通常Na₂CO₃等でpH
を８〜１０に調整）で培養することによりおこなわれて
いるが、その生産性は十分ではなかつた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはアルカリセルラーゼの生産性向上に関し、
特に発酵培地について鋭意研究を進めて来たが、今般、
炭素源としてキシランを含有する培地中でバチルス属に
属するアルカリセルラーゼ生産菌を培養することにより
アルカリセルラーゼ生産性が顕著に増大することを見い
出し本発明を完成した。

すなわち、本発明はバチルス属に属するアルカリセルラ
ーゼ生産菌をキシランを含有する培地で培養することを
特徴とするアルカリセルラーゼ製造法を提供するもので
ある。

本発明方法の実施は、バチルス属に属するアルカリセル
ラーゼ生産菌をキシランを含有する培地で培養し、以下
常法に従つてアルカリセルラーゼを分離・精製すること
によりおこなわれる。

本発明において用いられるバチルス属に属するアルカリ
セルラーゼ生産菌の例としては、例えばバチルスエス
ピーＮ₁(FERM P-1138)、バチルスエスピーＮ₂(FERM P
-1139)、バチルスエスピーＮ₃(FERM P-1140)及びバチ
ルスエスピーKSM−６３５(FERM P-8872)並びにこれら
の変異株等が挙げられる。このうち、特に好ましいもの
としては、バチルスエスピーKSM-635が挙げられる。
この微生物は、栃木県芳賀郡市貝町の土壌から分離取得
されたものであり、以下に示すような菌学的性状を有す
る。

（菌学的性状）１顕微鏡的観察結果菌体の大きさは、0.5〜1.2μｍ×1.5〜4.0μｍの桿菌で
あり、菌体の一端に内生胞子（0.7〜1.2μｍ×1.0〜2.0
μｍ）を形成する。又、周鞭毛を有して運動性があり、
グラム染色では陽性を示した。

２各種培地における生育状態（特にことわりの無い限り、以下において用いる培地
は、Na₂CO₃が１％添加されている）肉汁寒天培地集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平状である。
又、集落の色調は白色乃至黄色の半透明であり、光沢が
ある。

肉汁液体培地生育し、混濁する。培地を中性pHにすると、ほとんど生
育しない。

７％食塩肉汁液体培地生育し、混濁する。

肉汁ゼラチン穿刺培養生育しない。

リトマスミルク培地ミルクの凝固、ペプトン化は認められず、又培地がアル
カリ性のため、リトマスの変色も認められなかつた。

３生理学的性質硝酸塩の還元及び脱窒反応硝酸還元するが、脱窒反応は認められない。

ＭＲテスト培地がアルカリ性のため、メチルレツドの変化は認めら
れず、判定できなかつた。

ＶＰテスト陽性。

インドールの生成インドール産生試験用濾紙（「ニツサン」，日水製薬社
製）に対する反応、コバツクの試薬に対する呈色のいず
れに対しても陰性であり、実際上、陰性といえる。

硫化水素の生成陰性。

澱粉の加水分解平板寒天培地、培地Ａ、を４Ｎ塩酸で酸性にしても通常
のヨウ素反応による検出法では陰性といえる。又、液体
培地Ｂにおいても可溶性澱粉の資化性は認められない。

クエン酸の利用培地Ｂ；クエン酸を利用する。

コーサ（シモンズ）のクエン酸寒天平板培地；生育せ
ず。該培地から寒天を除き0.05％の酵母エキスを加えた
液体培地では、クエン酸の資化が認められる。

クリステンセンの寒天平板培地；生育するが、アルカリ
性のためフエノールレツドの変化なし。

培地Ｃ；クエン酸を利用しない。培地Ｃから寒天を除き
0.05％の酵母エキスを加えた液体培地では、クエン酸の
資化が認められる。

無機窒素源の利用培地Ｄ；硝酸、亜硝酸、アンモニアのいずれも陰性から
微弱であり、実質上資化性は認められない。

培地Ｅ；微量金属塩類を含有する本培地では、硝酸と亜
硝酸は旺盛に資化される。一方、塩化アンモニウムの利
用性は微弱であるが、リン酸アンモニウムは利用する。

色素の生成キングＡ培地では生育せず。

キングＢ培地では淡黄色を呈するが、螢光性はなかつ
た。又、ポテトデキストロース寒天培地とマンニツト酵
母エキス寒天培地では生育するが、色素の生成は認めら
れなかつた。

ウレアーゼ培地Ｆ；生育せず。培地Ｆからフエノール・レツドを除
き、本菌を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を
確認したが、陰性。

培地Ｇ（クリステンセンの尿素培地に酵母エキスを添
加）；培地からフエノール・レツドを除き、本菌を培養
後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確認したが、陰
性。又、細胞毒性を予測して、培地Ｇの尿素濃度を0.1、
0.2、0.5、1.0、2.0％と変化させて試験したが、ウレアー
ゼ活性は陰性であつた。

オキシダーゼ陽性、陰性はつきりせず。

カタラーゼ陽性生育の範囲生育温度範囲は２０〜４５℃にあり、生育最適温度範囲
は２９〜３７℃であつた。生育のpH範囲を調べる目的
で、培地ＷのNa₂CO₃の濃度を変えて培地の初発pHを変え
て試験したところ、生育pH範囲は８〜１１にあり、生育
最適pH範囲は9.5〜10.2であつた。一方、K₂CO₃で培地の
pHを調整すると、生育量は著しく少なく、生育至適pH
は、約９であつた。

酸素に対する態度好気的Ｏ−Ｆテストアルカリ性のため変色せず。好気のみ生育する。

糖類の利用性利用できる炭素源；Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハロース、Ｄ−
マンニツト、イノシツト、グリセリン利用できない炭素源；Ｄ−ガラクトース、乳糖、Ｄ−ソ
ルビツト、デンプン、デキストリン、ラフイノースカゼインの加水分解寒天平板培地に、菌を生育せしめ、３０％トリクロロ酢
酸を流し込んで判定したが、菌体周囲に透明帯を形成せ
ず、カゼインの分解性は陰性と判定した。

栄養要求性ビオチン（又はデスチオビオチン）を生育に必要とす
る。

なお、上記のうち、記号の付された培地は次のものを示
す。

培地Ａ：バクトペプトン，1.5；酵母エキス，0.5；可溶
性澱粉，2.0；K₂HPO₄，0.1；バクト寒天，1.5；MgSO₄・
7H₂O，0.02；Na₂CO₃，1.0 培地Ｂ：リン酸アンモニウム，0.1；塩化カリウム，0.0
2；酵母エキス，0.05；MgSO₄・7H₂O，0.02；炭素源，1.
0（濾過滅菌）；Na₂CO₃，1.0 培地Ｃ：リン酸アンモニウム，0.1；リン酸二水素カリ
ウム，0.05；クエン酸ナトリウム，0.2；バクト寒天，
1.5；MgSO₄・7H₂O，0.02；Na₂CO₃，1.0 培地Ｄ：酵母エキス，0.05；Na₂SO₄，0.1；KH₂PO₄，0.
1；グルコース，1.0；Na₂CO₃，1.0；無機窒素源，適当
量^＊＊硝酸ナトリウムは0.25％，亜硝酸ナトリウムは0.2025
％，塩化アンモニウムは0.158％，リン酸アンモニウム
は0.195％（各々0.0412Ｎ％に相当）になるように加え
た。

培地Ｅ^*：酵母エキス，0.05；Na₂SO₄，0.1；KH₂PO₄，0.
1；グルコース，1.0；無機窒素源，適当量^**；CaCl₂・2
H₂O，0.05；MnSO₄・４〜6H₂O，0.001；FeSO₄・7H₂O，0.
001（濾過滅菌）；MgSO₄・7H₂O，0.02（濾過滅菌）；Na
₂CO₃，1.0 培地Ｆ：尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量；
Na₂CO₃，1.0 培地Ｇ：バクトペプトン，0.1；食塩，0.5；KH₂PO₄，0.
2；酵母エキス，0.05；グルコース，0.1；尿素，2.0；
フエノール・レツド，0.001；Na₂CO₃，1.0 ＊ことわりの無い限り、各成分は全て別滅菌した。

＊＊硝酸ナトリウムは0.25％，亜硝酸ナトリウムは0.20
25％，塩化アンモニウムは0.158％，リン酸アンモニウ
ムは0.195％（各々0.0412Ｎ％に相当）になるように加
えた。

また、本発明方法において用いられる培地は、キシラン
を培地中に好ましくは0.1〜５重量％（以下単に％で示
す）、特に0.3〜１％含有する以外は特に制限はなく、
公知の他の成分、例えば窒素源、無機塩等を含有するこ
とができ、更に他の炭素源を配合することもできる。窒
素源の例としては、無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸
アンモニウム、更に硝酸ソーダやコーングルテンミー
ル、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母
エキス類、フアーマメデイア、イワシミール、肉エキ
ス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンソイビー
ンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミ
フレツクス、アジプロン、ゼスト、アジツクスなどが挙
げられる。無機塩の例としては、リン酸、Mg²⁺,Ca²⁺,Mn
²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Na⁺,K⁺を含む塩類が挙げられ、また、他
の炭素源の例としては、籾穀、麩、濾紙、一般紙類、お
が屑、などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシ
メチルセルロース（CMC）、アビセル、セルロース綿、
ペクチンに加え、資化し得る炭素源例えば、リボース、
アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハロース、マンニ
ツト、イノシツト、グリセリンや資化し得る有機酸、例
えば、酢酸、クエン酸などが挙げられる。

更に必要であれば、無機、有機微量栄養源を適宜選択し
て配合することができる。

本発明方法における好ましいアルカリセルラーゼの発酵
生産方法は次の通りである。すなわち、キシランを含有
する培地に、バチルス属に属するアルカリセルラーゼ生
産菌を接種し、公知の方法に従つて培養する。アルカリ
セルラーゼ生産菌としては、バチルス属に属する野生微
生物はもとより、これから導かれる、より高力価の当該
酵素生産性を有する各種変異株等が用いられる。また、
培養は一般に２２℃〜４０℃、好ましくは２６℃〜３７
℃で１〜４日振盪又は通気攪拌培養することによりおこ
なわれる。pHは８〜１１に調製すると良い結果が得られ
る。発酵生産培地がアルカリ性なので、時として発泡す
るが、適当な消泡剤を適宜添加することによつて解消さ
れる。

斯くして得られた培養物中から目的物質であるアルカリ
セルラーゼの収得は、例えば、後記実施例に示す如く、
一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことがで
きる。

すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等によつて菌体
を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手段、
例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノー
ル、エタノール、イソプロパノール等）によつて蛋白を
沈澱させたり、又、限外濾過（例えばダイアフローメン
ブレンYC、アミコン社製）により濃縮させてアルカリセ
ルラーゼを得る。塩析法では例えば、硫安（３０〜７０
％飽和画分）、溶媒沈澱では例えば、７５％エタノール
中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩す
ることによつてこれを凍結乾燥粉末とすることも可能で
ある。脱塩の方法としては透析又はセフアデツクスＧ−
２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いられ
る。さらに、酵素を精製するには例えば、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフイー、DEAE−セフアデツクス又
はDEAE−セルロース等のイオン交換クロマトグラフイー
及びセフアデツクスやバイオゲルのような分子篩ゲルク
ロマトグラフイーを適宜組み合わせて分別精製すれば良
い。

本発明方法は、アルカリセルラーゼ生産菌としてバチル
スエスピーKSM-635(FERM P-8872)を用いた場合に特に
優れた効果を得ることができる。

バチルスエスピーＫＳＭ−６３５を培養して得られる
アルカリセルラーゼＫは、以下に示すような物理化学的
性質を有する新規な酵素である。

(1)作用本酵素は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に作
用するＣ_x酵素活性を有する。しかしながら更に、リン
酸膨潤セルロースにも作用し、作用特異性として結晶性
セルロース（セルロース綿）や結晶性の高いセルロース
であるアビセルに作用する酵素（すなわちアビセラー
ゼ）と濾紙崩壊活性（ＦＰアーゼ）などに代表されるＣ
₁酵素、セロビオースやセロオリゴ糖に作用するβ−グ
ルコシダーゼ活性も有する。また、人工基質であるｐ−
ニトロフェニルセロビオシドに対しても若干ながら作用
してｐ−ニトロフェノールを遊離させる。

(2)基質特異性アルカリセルラーゼＫは、キシラン、アミロース、デキ
ストリン、ペクチン、イヌリン、カードランに対し、分
解能力を有しない。アビセラーゼ、及びＦＰアーゼ活性
（Ｃ₁活性）は、ＣＭＣアーゼ活性の約0.3％であった。
また、人工基質、ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解
活性は、その約1.5〜1.8％である（第１表）。

(3)作用pH及び至適作用pH 本酵素の作用pHは４〜１２、至適作用pHは大凡９〜１０
に認められる。なお、pH10.5付近にショルダを有する。

(4)安定pH pHの異なる緩衝液の下、４０℃で１０分間及び３０分間
放置した時の安定pHはそれぞれ、4.5〜10.5及び6.8〜１
０である。

５℃で放置すると、pH４〜１１で少なくても一ケ月は安
定である。

(5)作用温度範囲及び作用至適温度本酵素は低温で１０℃、高温で６５℃の広い範囲で作用
するが、グリシン緩衝液(pH9)の下で２０分間反応させ
た時の作用至適温度は約４０℃に認められる。

(6)熱安定性グリシン緩衝液(pH9)の下で、各温度で２０分間加熱処
理した結果、本酵素は約４０℃では全く失活せず、６０
℃で約５０％、７０℃で約２５％の残存活性を有する。

(7)酵素活性測定法ＣＭＣアーゼ活性ＣＭＣ(2.5％)0.2ml、0.5Mグリシン緩衝液(pH9.0)0.1m
l、及び脱イオン水0.1mlからなる基質溶液に酵素液0.1m
lを加え、４０℃、２０分間反応した。反応後、３，５
−ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic
acid（ＤＮＳ））法にて還元糖の定量を行った。すなわ
ち、反応液0.5mlにＤＮＳ試薬１mlを加え、５分間１０
０℃で加熱発色させ、冷却後、4.5mlの脱イオン水を加
えて希釈した。これを波長５３５nmで比色定量した。酵
素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコー
スに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性１００μmo
lリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1μmolｐ−ニトロフェニルセ
ロビオシド（シグマ社）を含む反応液1.0ml中に適当量
のＣＭＣアーゼを３０℃で作用させた後、1M Na₂CO₃を
0.3ml、脱イオン水を1.7ml順次加え、遊離するｐ−ニト
ロフェノールを４００nmで比色定量した。この条件で１
分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵
素量を１単位とした。

アビセラーゼ及びＦＰアーゼ活性ＣＭＣアーゼ活性測定用反応液２ml中、基質ＣＭＣに代
えて２０mgのアビセル（メルク社）又は塊状にした、幅
0.5cm、長さ５cmの濾紙片（セルラーゼ活性度検定用濾
紙、東洋NO.５１−特）を加え、アビラーゼ及びＦＰア
ーゼ活性を測定した。この条件で１分間にグルコース換
算で１μmolの還元糖を遊離させる酵素量を１単位とし
た。

蛋白定量法は、バイオ・ラドプロテインアッセイ
キット（バイオ・ラド社）を用いて、牛血清アルブミ
ンを標準蛋白として算出した。

(8)キレート剤の影響洗浄用酵素として、その反応組成物であるビルダーの中
でキレート剤に対する耐性は最も重要な因子である。ア
ルカリセルラーゼＫをＥＤＴＡ(0.5mM)、ＥＧＴＡ(0.5m
M)、ＮＴＡ(0.5mM)、トリポリリン酸（５０mg／ml）で
前処理した後、残存活性を測定したところ、全く阻害は
認められない。

(9)プロテアーゼの影響洗浄組成物として、プロテアーゼは洗浄力を向上せしめ
る作用がある。従つて、プロテアーゼ入り洗浄剤にセル
ラーゼを共存させて、更なる洗浄力の向上を求めるのは
当然である。このことは洗浄剤用セルラーゼがプロテア
ーゼで加水分解せず活性が安定に保持される要件を満た
す必要があるアルカリセルラーゼＫは実用されている洗
浄剤用プロテアーゼ（例えば、ＡＰＩ−２１、マクサタ
ーゼ、アルカラーゼ等）や一般のプロテアーゼ（例え
ば、プロナーゼ）に対して強力な耐性を有している（第
２表）。

(10)金属等の影響適当な濃度の２価の金属イオン(Hg²⁺,Cu²⁺等）は阻害効
果を与える。モノヨード酢酸、パラマーキュリ安息香酸
によって若干の阻害を受ける。

(11)界面活性剤の影響アルカリセルラーゼＫは各種界面活性剤、例えば、線状
アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、ア
ルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、ポリオキシ
エチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、
α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（ＡＯＳ）、α−
スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム塩（α−ＳＦ
Ｅ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）、ポリ
オキシエチレンセカンダリーアルキルエーテル、脂肪酸
塩（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキルアンモニウ
ムクロライド等の界面活性剤によって殆ど活性阻害は受
けなかった。

(12)分子量（ゲルクロマトグラフィー法） 180,000±10,000に最大ピークを有する。

上記したアルカリセルラーゼＫの諸性質を公知のセルラ
ーゼと比較すれば次の通りである。

アルカリセルラーゼＫは、高pH領域に最適pHを有するも
のであり、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペル
ギルス属（西沢一俊、「セルラーゼ」（東京南江堂、昭
和４９年刊））、アクレモニウム属（特公昭59-166081
号）、フミコーラ属（特公昭61-16316号）などに代表さ
れるカビの酸性側に最適pHを有するセルラーゼと区別さ
れるものであることは明らかである。

また、特公昭50-28515号に開示のアルカリセルラーゼと
比較した場合は、本アルカリセルラーゼが分子量として
１８万±１万に最大ピークを有するものであるのに対
し、上記セルラーゼの分子量が1.5万ないし３万、バチ
ルスNO.１１３９のセルラーゼの分子量が9.2万である点
並びに他の物理化学的性質が異なる点において明らかに
区別される。

〔作用〕

キシランが、特にアルカリセルラーゼ生産性に効果を示
す理由については、現在のところ明らかではないが、キ
シラン自体あるいはキシラン中に含有される、ある種の
構造がアルカリ性バチルス属セルラーゼ遺伝子に対し
て、誘導物質（インデユーサー）として作用することに
よるものと考えられる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。な
お、以下の実施例における酵素の活性測定は次の方法に
従つておこなつた。

活性測定法： CMC（2.5％）0.2ml、0.5Ｍグリシン緩衝液（pH9.0）0.1
ml、及び脱イオン水0.1mlからなる基質溶液に酵素液0.1
mlを加え、４０℃、２０分間反応した。反応後、３，５
−ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic
acid(DNS)）法にて還元糖の定量を行つた。すなわち、
反応液0.5mlにDNS試薬１mlを加え、５分間１００℃で加
熱発色させ、冷却後、4.5mlの脱イオン水を加えて希釈
した。これを波長５３５nmで比色定量した。酵素力価
は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコースに相
当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

実施例１以下に示す基本培地組成に各添加物を加えて調製した培
地にバチルスエスピーKSM−６３５（FERM P-8872）を
接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養終了後、遠
心分離して上澄液を得、この中のアルカリセルラーゼ量
（アルカリCMCアーゼ）をグリシン緩衝液中（pH9.0）で
測定した。この結果を第３表に示す。

（基本組成）肉エキス（和光純薬（株））1.5％、酵母エキス（デイ
フコ社）0.5％、KH₂PO₄0.1％、Na₂CO₃0.75％（別滅
菌）。

（結果）実施例２肉エキス1.5％、酵母エキス0.5％、Na₂CO₃１％（別滅
菌）、グルコース0.4％及びキシラン0.6％を含む培地に
バチルスエスピーKSM-635(FERM P-8872)を接種し、２
日間振盪培養後遠心分離して上澄液を得た。この上澄液
中のアルカリセルラーゼＫ量（CMCアーゼ活性として）
をグリシン緩衝液中（pH9.0）で測定したところ、5,200
単位／の高生産性を示した。

実施例３ハイプロ２％、味液２％、グルコース0.3％、KH₂PO₄0.1
％、Na₂CO₃１％（別滅菌）、キシラン１％を含む培地に
バチルスエスピーKSM-635(FERM P-8872)を接種し、３
０℃で３日間振盪培養した。培養物を遠心分離した後、
得られた上澄液についてアルカリセルラーゼＫの生産量
をグリシン緩衝液中（pH9.0）で測定した。この結果、C
MCアーゼ活性として6,620単位／培地の高生産性を得
た。

〔発明の効果〕

叙上の如く、本発明方法によればアルカリセルラーゼの
生産量が2.5〜３倍増加するので、本発明は衣料洗浄剤
添加用アルカリセルラーゼの生産方法として有利なもの
である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス属に属するアルカリセルラーゼ生
産菌をキシランを含有する培地で培養することを特徴と
するアルカリセルラーゼ製造法。
【請求項２】アルカリセルラーゼ生産菌がバチルスエ
スピーKSM-635（微工研菌寄第8872号）である特許請求
の範囲第１項記載のアルカリセルラーゼ製造法。