JPH0655139B2

JPH0655139B2 - Ｃｍｃア−ゼ▲ｉｉ▼

Info

Publication number: JPH0655139B2
Application number: JP25777886A
Authority: JP
Inventors: 謙造小池; 進伊藤; 裕一太田; 克也尾崎; 暉公彦岡本
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1986-10-28
Filing date: 1986-10-28
Publication date: 1994-07-27
Anticipated expiration: 2009-07-27
Also published as: JPS63109778A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なＣＭＣアーゼに関し、更に詳細にはアル
カリ側に最適pHを有する新規酵素ＣＭＣアーゼIIに関す
る。

〔従来の技術〕

セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコース、
又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵
素反応を触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構
により、C₁酵素、C_x酵素とβ−グルコシダーゼ、或いは
エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナー
ゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素の総称と理
解されている。長年、セルラーゼ研究の歴史は専らバイ
オマス資源の有効利用を図る目的から進められてきてお
り、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレ
モニウム属、フミコーラ属などのカビの類にその供給源
を求めてきた。然るに、カビを含めて微生物起源のセル
ラーゼには、その構成酵素群の作用特異性や物理化学的
諸性質等の多様性が有り、その実態は未だ明確化された
とは言い難い。

上記セルラーゼのうち、カルボキシメチルセルロース
（ＣＭＣ）に対する作用、すなわちC_x酵素作用が特に高
いものをＣＭＣアーゼと称するが、最近、ＣＭＣアーゼ
を含むセルラーゼの新規な産業用途として、例えば、衣
料用洗浄剤組成物の添加成分としての用途が開発されつ
つある。しかしながら、自然界において微生物の産生す
るセルラーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎ
り、大部分がアルカリpHにおいて失活する不安定性を有
する、いわゆる酸性セルラーゼ（最適作用pHが４〜６）
であつて、衣料用洗浄剤組成物の要件である、アルカリ
側で最大活性を有し、且つ耐性を有する、いわゆるアル
カリセルラーゼの存在は極めて少ないのが実情である。

すなわち、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカ
リセルラーゼに関しては、好アルカリ性微生物起源のア
ルカリセルラーゼを生産する方法として、バチルス属に
属する細菌を培養して倍地よりセルラーゼＡを採取する
方法（特公昭５０−２８５１５号公報）、セルロモナス
属に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラ
ーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４６
８６号公報）、好アルカリ性バチルスNo.１１３９を培
養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法（Ho
rikoshiら、J.Gen.Microbiol.,１３１巻，３３３９頁
（１９８５年））、及びストレプトマイセス属の種を用
いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−
１９４８３号公報）が知られているにすぎない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従つて、アルカリ側において至適pHを有し、衣料洗浄用
酵素としての機能を有するアルカリセルラーゼを新たに
提供することが要望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自
然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県芳
賀郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物が、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規アルカ
リセルラーゼＫを生産すること及び該アルカリセルラー
ゼを更に精製するその主成分として新規なＣＭＣアーゼ
Ｉ及びIIが得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は新規酵素ＣＭＣアーゼIIを提供する
ものである。

本発明のＣＭＣアーゼIIの製造において用いられる微生
物は次のような菌学的性状を示す。なお、以下において
菌株の分類に用いた倍地は次の倍地１〜２４であり、特
にことわりの無い限り別滅菌した適当量の1.０重量％の
炭酸ナトリウム（Na₂CO₃）を含むものである。

分類用検定倍地の組成（表示は重量％）：培地１：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；バクト寒天，1.５培地２：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３培地３：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；食塩，7.０培地４：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；バクトゼラチン，２0.０培地５：バクトリトマスミルク，１0.５培地６：バクトペプトン，0.５；肉エキス，0.３；KNO₃，0.１培地７：バクトペプトン，0.７；グルコース，0.５；食塩，0.５培地８：バクトペプトン，3.０；肉エキス，0.３；チオ硫酸ナトリウム，0.００５；塩酸システイン，0.０２；クエン酸鉄アンモニウム， 0.０５；バクト寒天，0.５培地９：バクペプトン，1.５；肉エキス，0.４；乳糖，1.０；蔗糖，1.０；グルコース， 1.０；食塩，0.５；チオ硫酸ナトリウム， 0.００８；亜硫酸ナトリウム，0.０４；硫酸第一鉄，0.０２；フエノール・レツド， 0.００２；バクト寒天，1.５培地10：バクトペプトン，1.５；酵母エキス，0.５；可溶性澱粉，2.０；K₂HPO₄，0.１；バクト寒天，1.５；MgSO₄・７H₂O，0.０２培地11：リン酸アンモニウム，0.１；塩化カリウム， 0.０２；酵母エキス，0.０５；MgSO₄・７H₂O ，0.０２；糖類，1.０（濾過滅菌）培地12：リン酸一水素カリウム，0.１；リン酸二水素アンモニウム，0.１；クエン酸ナトリウム， 0.２；MgSO₄・７H₂O，0.０３；食塩，0.５；ブロム・チモール・ブルー，0.００２４；バクト寒天，1.５培地13：酵母エキス，0.０５；塩酸システイン， 0.０１；クエン酸ナトリウム，0.３；食塩， 0.５；チオ硫酸ナトリウム，0.008 ；クエン酸鉄アンモニウム，0.０４；グルコース，0.０２；リン酸二水素カリウ
ム， 0.１５；フエノール・レツド，0.００１２；バクト寒天，1.５培地14：リン酸アンモニウム，0.１；リン酸二水素カリウム，0.０５；クエン酸ナトリウム， 0.２；バクト寒天，1.５；MaSO₄・７H₂O ，0.０２培地15：酵母エキス，0.０５；Na₂SO₄，0.１；KH₂PO₄， 0.１；グルコース，1.０；無機窒素源，適当量^＊＊硝酸ナトリウムは0.２５％，亜硝酸ナトリウムは0.２０２５％，塩化アンモニウムは 0.１５８％，リン酸アンモニウムは0.195 ％（各々，0.０４１２Ｎ％に相当）になるように加えた。

培地16：酵母エキス，0.０５；Na₂SO₄，0.１；KH₂PO₄， 0.１；グルコース，1.０；無機窒素源，適当量^＊＊；CaCl₂・２H₂O，0.０５；MnSO₄・４〜６H₂O，0.００１；FeSO₄ ・７H₂O，0.００１（濾過滅菌）；MgSO₄・７H₂O，0.０２（濾過滅菌）＊＊硝酸ナトリウムは0.２５％，亜硝酸ナトリウムは0.２０２５％，塩化アンモニウムは 0.１５８％，リン酸アンモニウムは0.195％（各々0.０４１２Ｎ％に相当）になるように加えた。

培地17：キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量培地18：キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量培地19：ポテトデキストロース寒天培地“栄研” （栄研化学社製），指示量培地20：バクトペプトン，0.２５；食塩，0.２５；酵母エキス，0.２５；マンニツト，0.５；バクト寒天，2.０培地21：尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量培地22：バクトペプトン，0.１；食塩，0.５；KH₂PO₄， 0.２；酵母エキス，0.０５；グルコース， 0.１；尿素，2.０；フエノール・レツド， 0.００１培地23：バクトペプトン，0.５；酵母エキス，0.５；K₂ HPO₄，0.１；グルコース，1.０；KgSO₄ ・７H₂O，0.０２培地24：酵母エキス，0.５；グルコース，1.０；カゼイン（ハーマーシュータイン，メルク社製），0.５；K₂ HPO₄，0.１；MgSO₄・７H₂O， 0.０２；バクト寒天，1.５（菌学的性状） 1.顕微鏡的観察結果：菌体の大きさは、0.５×1.２μｍ×1.５〜4.０μｍの桿
菌であり、菌体の一端に内生胞子（0.７〜1.２μｍ×1.
０〜2.０μｍ）を作る。周鞭毛。運動性；陽性。グラム
染色；陽性。

2.各種培地における生育状態：肉汁寒天培地（培地１）集落の形状は円形で、集落の表面は扁平状である。又、
集落の色調は白色乃至黄色の半透明であり、光沢があ
る。

肉汁液体培地（培地２）生育し、混濁する。

７％食塩肉汁液体培地（培地３）生育し、混濁する。

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地４）生育しない。

リトマスミルク培地（培地５）ミルクの凝固、ペプトン化；陰性。又、培地５がアルカ
リ性のため、リトマスの変色も認められなかつた。

3.生理学的性質：硝酸塩の還元及び脱窒反応硝酸還元：陽性、脱窒反応；陰性（培地６）。

ＭＲテスト（培地７）培地がアルカリ性のため、メチルレツドの変化は認めら
れず、判定不能。

ＶＰテスト（培地７）陽性。

インドールの生成（培地８）インドール産生試験用濾紙（「ニツサン」，日水製薬社
製）に対する反応、コバツクの試薬に対する呈色のいず
れに対しても陰性。

硫化水素の生成（培地９）陰性。

澱粉の加水分解平板寒天培地、培地１０、を４Ｎ塩酸で酸性にしても通
常のヨウ素反応による検出法では陰性といえる。液体培
地１１において、可溶性澱粉の資化性は陰性。

クエン酸の利用性培地１１；陽性。

培地１２（コーサ（シモンズ）のクエン酸寒天平板培
地）；陰性。培地１２から寒天を除き、0.０５％の酵母
エキスを加えた液体培地では、陽性。

培地１３（クリステンセンの寒天平板培地）；陽性。但
し、アルカリ性のためフエノールレツドの変化なし。

培地１４；陰性（生育せず）。培地１４から寒天を除き
0.０５％の酵母エキスを加えた液体培地では、陽性。

無機窒素源の利用培地１５：硝酸、亜硝酸、アンモニアのいずれも陰性か
らぎ陽性。

培地１６；微量金属塩類を含有する本培地では、硝酸と
亜硝酸に関し陽性。塩化アンモニウム；ぎ陽性。リン酸
アンモニウム；陽性。

色素の生成キングＡ培地（培地１７）では生育せず、判定不能。

キングＢ培地（培地１８）では淡黄色（螢光性無し）。
ポテトデキストロース寒天培地（培地１９）とマンニツ
ト酵母エキス寒天培地（培地２０）では生育するが、色
素の生成は陰性。

ウレアーゼ培地２１；成育せず。培地２１からフエノール・レツド
を除き、本菌を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生
成を確認したが、陰性。

培地２２（クリステンセンの尿素培地に酵母エキスを添
加）；培地からフエノール・レツドを除き、本菌を培養
後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確１したが、陰
性。又、細胞毒性を予測して、培地２２の尿素濃度を0.
１，0.２，0.５，1.０，2.０％と変化させて試験した
が、陰性。

オキシダーゼ陽性、陰性はつきりせず。

カタラーゼ陽性。

生育の範囲（培地２３）生育温度範囲は２０〜４５℃、生育最適温度範囲は２９
〜３７℃。生育のpH範囲を調べる目的で、Na₂CO₃により
初発pHを変えて試験したところ、生育pH範囲は８〜１
１、生育最適pH範囲は9.５〜１0.２であつた。一方、K₂
CO₃でpHを調整すると、生育量は著しく少なく、生育至
適pHは、約９であつた。

酸素に対する態度好気的。

Ｏ−Ｆテストアルカリ性のため変色せず。好気のみ生育する。

糖類の利用性（培地１１）利用できる炭素源：Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハロース、Ｄ−
マンニツト、イノシツト、グリセリン利用できない炭素源：Ｄ−ガラクトース、乳糖、Ｄ−ソ
ルビツト、デンプン、デキストリン、ラフイノースカゼインの加水分解（培地２４）寒天平板培地２４に菌を生育せしめ、３０％トリクロロ
酢酸を流し込んで判定したが、菌体周囲に透明帯を形成
せず、陰性。

栄養要求性ビオチン（又はデスチオビオチン）。

以上の菌学的性質について、バージーズ・マニユアル・
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー（Berge
y′ｓMannual of Determinative Bacteriology）第８版
を参照した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス
（Bacillus）属の一種であると認められる。しかし、本
菌株が中性pHでは成育できず、専ら高アルカリpHで良好
な生育を示すことから、細菌、掘越と秋葉（“Alkaliph
ilic Microorganism”，Japan Scientific Society Pre
ss(Tokyo)，１９８２年刊）の主張する、いわゆる好ア
ルカリ性（alkalophilic）微生物として暫定的に、従来
の中性で生育するバチルスと区別される。

そして、本菌株の菌学的性質は、公知の好アルカリ性バ
チルスのいずれとも一致しないのでこれも新規菌株と判
断してバチルスエスピー KSM−６３５と命名し、微
工研菌寄第８８７２号として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した。

本発明のＣＭＣアーゼIIを収得するには、上記バチルス
エスピーＫＳＭ−６３５若しくはその変異株を培地
中で培養し、アルカリセルラーゼＫを得た後、これを通
常の酵素精製法に付し、分離、精製すれば良い。

アルカリセルラーゼＫの発酵生産にあたつては、適当な
培地を加熱等により殺菌後、バチルスエスピーＫＳ
Ｍ−６３５（ＦＥＲＭＰ−８８７２）を接種し、２２
℃〜４０℃、好ましくは２６℃〜３７℃で、１〜４日振
盪又は通気撹拌培養すれば良い。pHは８〜１１に調製す
ると良い結果が得られる。発酵生産培地がアルカリ性な
ので、時として発泡するが、適当な消泡剤を適宜添加す
ることによつて解消される。

アルカリセルラーゼＫ生産には、資化し得る窒素源と炭
素源を適宜組み合わせて培養培地に含有させれば良く、
殊に両栄養源を限定するものではない。例えば、窒素源
としては、無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニ
ウム、硝酸ソーダやコーングルテンミール、大豆粉、コ
ーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フアー
マメデイア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイ
プロ、アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー
粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレツクス及びアジ
プロン、ゼスト、アジツクスなどが挙げられる。又、炭
素源としては、籾殻、麩、濾紙、一般紙類、おが屑、な
どの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセ
ルロース（CMC）、アビセル、セルロース綿、キシラ
ン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、例えば、リボ
ース、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノ
ース、フラクトース、麦芽糖、シヨ糖、トレハロース、
マンニツト、イノシツト、グリセリンや資化し得る有機
酸、例えば酢酸、クエン酸などが挙げられる。すなわ
ち、これらの窒素源と炭素源を適宜組み合わせたいかな
る培地を使用しても良く、上述の栄養源を特に限定する
ものではない。その他、リン酸、Mg²⁺,Ca²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺,
Co²⁺,Na⁺,K⁺などの無機塩や、必要であれば、無機、有
機微量栄養源を含有する培地を適宜選択して使用され
る。

斯くして得られた培養物中からアルカリセルラーゼＫを
得るには、例えば、後記実施例に示す如く、一般の酵素
の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。

すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等によつて菌体
を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手段、
例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノー
ル、エタノール、イソプロパノール等）によつて蛋白を
沈澱させたり、又、限外濾過（例えばダイアフローメン
ブレンＹＣ、アミコン社製）により濃縮させてアルカリ
セルラーゼＫを得る。塩析法では例えば、硫安（３０〜
７０％飽和画分）、溶媒沈澱では例えば、７５％エタノ
ール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱
塩することによつてこれを凍結乾燥粉末とすることも可
能である。脱塩の方法としては透析又はセフアデツクス
Ｇ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用い
られる。

さらに、このアルカリセルラーゼＫからＣＭＣアーゼII
を得るには例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フイー、ＤＥＡＥ−セフアデツクス又はＤＥＡＲ−セル
ロース等のイオン交換クロマトグラフイー及びセフアデ
ツクスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフ
イーを適宜組み合わせて分別精製すれば良い。

斯くして得られたＣＭＣアーゼIIは、以下に示すような
性質を有する。

(1)作用本酵素は、カルボキシメチルセルロース（CMC）に作用
するC_x酵素活性を有する。しかしながら、更に、リン酸
膨潤セルロースにも作用し、作用特異性として結晶性セ
ルロース（セルロース綿）や結晶性の高いセルロースで
あるアビセルに作用する酵素（すなわちアビセラーゼ）
と濾紙崩壊活性（ＦＰアーゼ）などに代表されるC₁酵
素、セロビオースやセロオリゴ糖に作用するβ−グルコ
シダーゼ活性も有する。また、人工基質であるｐ−ニト
ロフエニルセロビオシドに対しても若干ながら作用して
ｐ−ニトロフエノールを遊離させる。

(2)基質特異性本酵素はＣＭＣアーゼ活性を主活性とするが、その約0.
３％のアビセラーゼ及びＦＰアーゼ活性（C₁活性）を有
する。また、人工基質、ｐ−ニトロフエニルセロビオシ
ド分解活性は、その約1.５〜２０％であつた（第１
表）。一方、キシラン、アミロース、デキストリン、ペ
クチン、イヌリン、カードランに対し分解能力を有しな
かつた。

(3)作用pH及び至適pH 本酵素の作用pH範囲は、３〜１２であり、作用の強いpH
範囲は６〜１１．５である（第１図）。至適pHは約９．
５である。

なお、ｐ−ニトロフエニルセロビオシドに対する本酵素
の作用pH範囲は４〜１１であり、最適pHは約７であつ
た。

(4)pH安定性本酵素を各々のpHで３０℃、１時間保持した後の残存活
性を測定し、pH安定性を調べた。その結果、pH５から１
２で極めて安定で、失活しなかつた（第２図）。

(5)力価の測定法ＣＭＣアーゼ活性ＣＭＣ（2.５％）2.０ml、0.５Ｍグリシン緩衝液（pH9.
０）0.１ml、及び脱イオン水0.１mlからなる基質溶液に
酵素液0.１mlを加え、４０℃で２０分間反応した。反応
後、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-
salicylic acid(DNS))法にて還元糖の定量を行つた。す
なわち、反応液0.５mlにＤＮＳ試薬１mlを加え、５分
間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、4.５mlの脱イオ
ン水を加えて希釈した。これを波長535nmで比色定量し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｍolのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。

ｐ−ニトロフエニルセロビオシド分解活性１００μｍ
olリン酸緩衝液（pH7.０）、0.１μｍolｐ−ニトロフエ
ニルセロビオシド（シグマ社）を含む反応液1.０ml中に
適当量のＣＭＣアーゼを３０℃で作用させた後、１ＭNa
₂CO₃を0.３ml、脱イオン水を1.７ml順次加え、遊離する
ｐ−ニトロフエノールを４００nmで比色定量した。この
条件で１分間に１μｍolのｐ−ニトロフエノールを遊離
させる酵素量を１単位とした。

アビセラーゼ及びＦＰアーゼ活性反応液２ml中、ＣＭＣ反応液の基質ＣＭＣに代えて２０
mgのアビセル（メルク社）、又は塊状にした、幅0.５c
m、長さ５cmの濾紙片（セルラーゼ活性度検定用濾紙、
東洋No.５１−特）を加え、アビセラーゼ及びＦＰアー
ゼ活性を測定した。この条件で１分間にグルコース換算
で１μｍolの還元糖を遊離させる酵素量を１単位とし
た。

蛋白定量法バイオ・ラドプロテインアツセイキツト（バイオ
・ラド社）を用いて、牛血清アルブミンを標準蛋白とし
て算出した。

(6)作用温度及び至適温度ＣＭＣアーゼＩの作用温度範囲は、５〜５８℃である。
また至適温度範囲は１４〜４５℃である。なお、本酵素
の作用最適温度は３０〜４０℃である。また、本酵素
は、１５℃でも、最大活性を示す３０〜４０℃の場合の
約５０％活性を有する（第３図）。

(7)温度安定性本酵素は、４０℃、３０分間の加温処理によつても約７
５％残存活性を有する（グリシン緩衝液中；pH9.０）。

(8)金属の影響金属やイオンはＣＭＣの物理化学的性質、特に粘性等を
変えるので、本発明の酵素成分の活性を測定するにあた
り、ＣＭＣを基質とする場合、アルカリセルラーゼＫの
反応動力学的諸因子を正確に反映しないことは自明であ
る。そこで、本酵素がｐ−ニトロフエニルセロビオシド
分解活性を有することを指標として、その酵素活性に及
ぼす金属の影響を調べた。この結果、Zn²⁺,Co²⁺,Ni²⁺,C
u²⁺,Hg²⁺,Ca²⁺は、活性を阻害した。一方、適当な濃度
のMg²⁺,Mn²⁺,Ca²⁺,Ba²⁺,Fe²⁺,Li⁺,K⁺,Na⁺は、本酵素の
1.１〜2.４倍の活性化をならしめた。

(9)キレートの影響本酵素はキレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴ
Ａ、ＴＰＳＳ及びゼオライトによつて何ら阻害を受けな
かつた。

(10)糖類の影響 (8)と同様にｐ−ニトロフエニルセロビオシドを本酵素
の基質として、各種糖類の影響を調べた。セロビオース
は、両酵素成分を阻害し、生成物阻害（product inhibi
tion）の型式を示したが、他の２糖類、例えば乳糖、麦
芽糖は、無影響であつた。単糖であるグルコサミン、Ｎ
−アセチルグルコサミン、リボース、アラビノース、ソ
ルボース、キシロース、果糖、ガラクトース、グルコー
ス、その誘導体である３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコー
ス、α−メチル−β−Ｄ−グルコース、α−メチル−Ｄ
−グルコシド、α−メチル−β−マンノシド、２−デオ
キシグルコースあるいは、その他の糖類、例えばラムノ
ースなども何ら活性を阻害しなかつた。

(11)塩濃度の影響反応緩衝液としてリン酸緩衝液、バイシン（BICINE-N
a）緩衝液、トリス−塩酸緩衝液を用い、イオン強度調
節剤として、食塩（０〜250nM）を用いて、ｐ−ニトロ
フエニルセロビオシド分解活性を指標として、ＣＭＣア
ーゼIIに対するイオン強度の効果を調べた。この結果、
イオン強度と酵素活性の間には促進、阻害等の関係は認
められなかつた。

(12)界面活性剤の影響線状アルキルベンゼスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、
アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＡＳ）、ポリオキ
シエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（Ｅ
Ｓ）、α−オレフインスルホン酸ナトリウム（ＡＯ
Ｓ）、α−スルフオン化脂肪酸エステルナトリウム塩
（α−ＳＦＥ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡ
Ｓ）、ポリオキシエチレンセカンダリ−アルキルエーテ
ル、脂肪酸塩（ナトリウム塩）、ジメチルジアルキルア
ンモニウムクロライド及びタウロコール酸によつて殆ん
ど活性は阻害されなかつた。

(13)分子量ゲルクロマトグラフイー（トヨパール５５Ｓ；東洋曹
達）を用いて測定した分子量は、１７0,０００±２0.０００であつた。

(14)ＵＶ吸収スペクトル本酵素をバイシン（BICINE）−ナトリウム緩衝液に溶解
してＵＶ吸収スペクトルを測定した結果、約２８０nmに
最大吸収を有し、微分吸収スペクトラムを調べることに
よつて２９０nmにおける肩吸収の存在が示された（第５
図）。

(15)糖の検出精製した本酵素蛋白をフエノール硫酸法で発色試験した
ところ480nmに最大吸収を有した。本結果は、本酵素が
糖を含有することを示す。アルデイトール・酢酸法を用
いてガスクロマトグラフイーにて糖を検出し、構成糖と
してＮ−アセチルグルコサミンを含むことが認められ
た。本酵素は1.３〜4.０重量％の当該糖成分を含有する
ことが判明した。

(16)プロテアーゼ耐性洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ（昭和電工）、マク
サターザ（ギスト社）、及びアルカラーゼ（ノボ社）を
本酵素と共存させ、（0.０００２〜0.１重量％）、１５
℃、１２時間プリインキユベーシヨン処理標品の残存活
性を測定したところ、全く失活は認められず、本酵素が
プロテアーゼに対して強い耐性を有することがわかつた
（第２表）。

上記した、本発明のＣＭＣアーゼIIの諸性質を公知のセ
ルラーゼと比較すれば次の通りである。

本酵素は、高pH領域に最適pHを有するものであり、トリ
コデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属（西沢
一俊、「セルラーゼ」（東京南江堂、昭和４９年
刊））、アクレモニウム属（特公昭５９−１６６０８
１）、フミコーラ属（特公昭６１−１６３１６）などに
代表されるカビの中性ないし酸性側に最適pHを有するセ
ルラーゼと区別されるものであることは明らかである。

また、特公昭５０−２８５１５号に開示のセルラーゼ及
びJ.Gen.Microbiol１３１巻、3339頁（１９８５）に報
告されたセルラーゼと比較した場合は、本アルカリセル
ラーゼが分子量１７0,０００±２0,０００であるのに対
し、特公昭５０−２８５１５号のアルカリセルラーゼの
分子量が１5,０００ないし３0,０００であり、バチルス
No.１１３９の分子量が９2,０００である点並びに本願
ＣＭＣアーゼIIの反応動力学的諸性質や、これが糖を構
成成分として含む点において明らかに区別される。

〔作用及び発明の効果〕

本発明のＣＭＣアーゼIIは、pH１１においても最適pHの
約70％の相対活性を有しており、過去に研究されたアル
カリセルラーゼの中でも最もアルカリ側で充分活性が発
揮される酵素群であることがわかる。又、最適pHが高ア
ルカリ側に強く発揮されるにも拘らず、pH３前後の強酸
性側でも活性を有するという点でも特異的である。この
ように広いpH領域において活性を有し、かつ安定なセル
ラーゼは従来存在しないものである。また、比較的低温
下（１０℃前後）でも充分活性を有し、界面活性側、キ
レート剤や各種プロテアーゼに対する強力な耐性を合せ
持つセルラーゼも従来知られておらず、本発明によつて
初めて見出されたものである。

したがつて、本発明のＣＭＣアーゼIIは、低温洗浄にお
いても強力な洗浄効果を発現する、衣料用洗浄剤添加酵
素を始め、バイオマスその他の用途に有効に利用するこ
とができるものである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１栃木県芳賀郡市貝町の土壌を滅菌生理食塩水に懸濁し、
８０℃で３０分間熱処理した。この熱処理液を適当に希
釈してマスタープレート（１％肉エキス（オキソイド社
製）、１％バクトペプトン（デイフコ社製）、１％NaC
l、0.１％KH₂PO₄、0.５％Na₂CO₃（別滅菌）、1.５％バ
クト寒天）に塗沫し３０℃で３日間培養し、集落を形成
させた。レプリカ法により、２％ＣＭＣ含有マスタープ
レートに移植し、再度集落を形成させた後、コンゴーレ
ツド色素溶液を流し込み、周囲が透明になる集落を検出
した。当該する集落をマスタープレートから選出し、高
力価ＣＭＣアーゼ生産菌をスクリーニングした。

上述の手法により、本発明のバチルスエスピーＫＳ
Ｍ−６３５（ＦＥＲＭＰ−８８７２）を取得した。

実施例２バチルスエスピーＫＳＭ６３５−（FERMＰ−８８７
２）を1.５％肉エキス、0.５％酵母エキス、１％ＣＭ
Ｃ、0.１％KH₂PO₄と0.７５％Na₂CO₃からなる液体培地
中、３４℃で２日間好気培養した。その培養上清液１
に対して３の冷エタノール（−１０℃）を徐々に加え
て蛋白沈澱を生じさせ、得られる沈澱物を最小量の滅菌
脱イオン水に溶解し、希酢酸で中和した後、流水に対し
て１５時間透析し、凍結乾燥して酵素粉末8.２ｇを得
た。得られた乾燥粉末中の各種酵素活性は第３表に示し
た通りであつた。

実施例３実施例２において、バクトペプトンに代えて魚肉エキス
1.５％添加した培地にバチルスエスピーＫＳＭ−６
３５（FERMＰ−８８７２）を接種し、３０℃で３日間振
盪培養した。培養後、遠心分離した上清液についてＣＭ
Ｃアーゼ活性を測定した結果、3,２００単位／であつ
た。

実施例４実施例３で得られた培養上清１について、以下の手順
に従つて精製をおこない、ＣＭＣアーゼIIを得た。ス
トレプトマイシン処理、硫安分画（３０〜７５％飽和
沈澱画分）、分取高速液体クロマトグラフイー（例え
ば、ＳＷ３０００Ｇカラム）東洋曹達））、ＤＥＡ
Ｅ−トヨパール（東洋曹達）クロマトグラフイー、ヒ
ドロキシアパタイト（生化学工業）クロマトグラフイ
ー、そして再度、ＤＥＡＥ−トヨパールクロマトグラ
フイーを行うことによつて精製される。精製の第６段階
でNaClの直線濃度勾配による溶出（0.25 M NaClから0.3
5Ｍ NaCl）をおこなうと、溶出速度の順にＣＭＣアー
ゼＩとＣＭＣアーゼIIが溶出され、１５mgのＣＭＣアー
ゼIIが分離、取得された。得られたＣＭＣアーゼIIにつ
いてデービス（Davis D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,１２１
巻，４０４頁（１９６４年））の方法に従つて電気泳動
を行つた後、コマシー・ブリリアント・ブルーで染色し
て単一のバンドを与えることを確認した。

実施例５実施例４で得たＣＭＣアーゼＩ及びIIについて、常法に
従いソデイウム・ドデシル・サルフエート電気泳動をお
こなつた。この結果を第６図に示す。この結果から、Ｃ
ＭＣアーゼＩ及びIIは最低分子量３0,０００±2,０００
から最高分子量12,000±１5,０００の各分子種の会合体
であることが認められ、本発明のＣＭＣアーゼＩ及びＣ
ＭＣアーゼIIは、最低分子量３0,０００±2,０００の酵
素蛋白が何らかの物理化学的相互作用により強固に会合
したものと判断される。本発明のＣＭＣアーゼIIの主蛋
白種は、分子量95,000〜120,000である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＣＭＣアーゼIIの反応pHと相対活性
の関係を示す図面である。第２図は、本発明のＣＭＣアーゼIIの処理pHの残存活性
を関係を示す図面である。第３図は、本発明のＣＭＣアーゼIIの反応温度（pH9.
０）と相対活性の関係を示す図面である。第４図は、本発明のＣＭＣアーゼIIの処理温度（pH9.
0）と残存活性の関係を示す図面である。第５図は、本発明のＣＭＣアーゼIIのＵＶ吸収を示す図
面である。第６図は、本発明のＣＭＣアーゼＩ及びIIのソデイウム
・ドデシル・サルフエート電気泳動の結果を示す図面で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡本暉公彦埼玉県越谷市七左町１−229−８

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の物理化学的性質を有するＣＭＣアーゼ
II。 (1)作用カルボキシメチルセルロースに作用するＣ_ｘ酵素活性の
ほか、弱いＣ_１酵素活性、β−グルコシダーゼ活性を有
する。 (2)基質特異性カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、アビ
セル、セロビオース及びｐ−ニトロフェニルセロビオシ
ドに対して作用する。 (3)作用pH及び至適pH 作用pHは３〜12.5であり、至適pHは約9.5である。 (4)pH安定性 30℃で１時間保持した場合、pH５〜12で失活しない。 (5)作用温度及び至適温度作用温度は、５〜58℃、至適温度は14〜45℃である。 (6)キレート剤の影響ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＳＴＰＰ及びゼオライト
は活性を阻害しない。 (7)界面活性剤の影響線状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡ
Ｓ）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＡＳ）、ポ
リオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩
（ＥＳ）、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（ＡＯ
Ｓ）、α−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム塩
（α−ＳＦＥ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡ
Ｓ）、ポリオキシエチレンセカンダリーアルキルエーテ
ル、脂肪酸塩（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキル
アンモニウムクロライドは活性を阻害しない。 (8)プロテアーゼ耐性プロテアーゼに対して強力な耐性を有する。 (9)分子量（ゲルクロマトグラフィー法による）ＣＭＣアーゼIIの分子量は170,000±20,000である。 (10)ＵＶ吸収スペクトル２８０nmに最大吸収を有し、また２９０nmに肩吸収を有
する。
【請求項２】バチルスエスピーＫＳＭ−６３５の培
養物より分離取得されたものである特許請求の範囲第１
項記載のＣＭＣアーゼII。