JPH0659215B2 - アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 - Google Patents
アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法Info
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- JPH0659215B2 JPH0659215B2 JP1226211A JP22621189A JPH0659215B2 JP H0659215 B2 JPH0659215 B2 JP H0659215B2 JP 1226211 A JP1226211 A JP 1226211A JP 22621189 A JP22621189 A JP 22621189A JP H0659215 B2 JPH0659215 B2 JP H0659215B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリプルラナーゼＺ−Ｉ、これを生
産する微生物及びアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの製造法
に関する。
産する微生物及びアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの製造法
に関する。
プルラナーゼは、プルラン分子中に存するα−１，６グ
ルコシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオース
を生成する酵素で、1961年BenderとWallenfels〔Bioche
m.Z.,３３４，７９(1961)〕により、アエロバクター
アエロゲネス(Aerobacter aerogenes)の一菌株から初め
て発見されたものである。近年、バチルス エスピー(B
acillus sp.)〔J.Jpn.Soc.Starch Sci.,３０，２００(1
983)、バチルス アシドプルリティクス(Bacillus acid
opullulyticus)〔Agric.Biol.Chem.,５２，2293(198
4)〕、バチルス ステアロサーモフィルス(Bacillus st
earothermophilus)〔Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechno
l.,１７，２４(1983)〕、ストレプトコッカス ミティ
ス(Streptococcus mitis)〔Biochem.J.,１０８，３３(1
968)〕、ラクトバチルス(Lactobacillus)〔澱粉科学，
２８，７２(1981)〕等の微生物がプルラナーゼを生産す
ることが報告されている。
ルコシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオース
を生成する酵素で、1961年BenderとWallenfels〔Bioche
m.Z.,３３４，７９(1961)〕により、アエロバクター
アエロゲネス(Aerobacter aerogenes)の一菌株から初め
て発見されたものである。近年、バチルス エスピー(B
acillus sp.)〔J.Jpn.Soc.Starch Sci.,３０，２００(1
983)、バチルス アシドプルリティクス(Bacillus acid
opullulyticus)〔Agric.Biol.Chem.,５２，2293(198
4)〕、バチルス ステアロサーモフィルス(Bacillus st
earothermophilus)〔Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechno
l.,１７，２４(1983)〕、ストレプトコッカス ミティ
ス(Streptococcus mitis)〔Biochem.J.,１０８，３３(1
968)〕、ラクトバチルス(Lactobacillus)〔澱粉科学，
２８，７２(1981)〕等の微生物がプルラナーゼを生産す
ることが報告されている。
また、プルラナーゼはプルランのみならず、澱粉、グリ
コーゲン、アミロペクチンやこれらの部分分解により生
じた分岐オリゴ糖中のα−１，６グルコシド結合に対し
ても水解活性を有することが知られており、「枝切り酵
素」と呼ばれている。
コーゲン、アミロペクチンやこれらの部分分解により生
じた分岐オリゴ糖中のα−１，６グルコシド結合に対し
ても水解活性を有することが知られており、「枝切り酵
素」と呼ばれている。
一方、プルラナーザは、エンド型アミラーザ及びエキソ
型アミラーザと併用することにより、澱粉からグルコー
スやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどのマ
ルトオリゴ糖を高収量で生産することも、見出されてお
り、近年注目されつつある。
型アミラーザと併用することにより、澱粉からグルコー
スやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどのマ
ルトオリゴ糖を高収量で生産することも、見出されてお
り、近年注目されつつある。
そこで、斯かるプルラナーゼの性質を利用して、プルラ
ナーゼをアミラーゼと共に食器用洗浄剤や衣料用洗浄剤
に配合する事により、主に澱粉汚れに対して洗浄力が飛
躍的に向上する事が明らかとなり、その利用が期待され
ている（特開昭63-285424号）。
ナーゼをアミラーゼと共に食器用洗浄剤や衣料用洗浄剤
に配合する事により、主に澱粉汚れに対して洗浄力が飛
躍的に向上する事が明らかとなり、その利用が期待され
ている（特開昭63-285424号）。
しかしながら、自然界に於いて従来見出されているプル
ラナーゼのほとんどが、中性及至酸性領域に於いて最大
且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性プル
ラナーゼに分類されるものであるため、食器用洗浄剤及
び衣料用洗浄剤組成物の必要条件である、アルカリ領域
において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有
するプルラナーゼ、所謂アルカリプルラナーゼ及びアル
カリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少ないのが実情
である。尚、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適pH
をアルカリ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プル
ラナーゼとは、至適pHは中性から酸性領域に有するが、
アルカリ領域に於いても至適pHに於ける活性に比較して
充分な活性を有し且つ安全性を保持するものを言う。ま
た、中性とはpH６〜８の範囲を言い、アルカリ性とはそ
れ以上のpH範囲を言う。
ラナーゼのほとんどが、中性及至酸性領域に於いて最大
且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性プル
ラナーゼに分類されるものであるため、食器用洗浄剤及
び衣料用洗浄剤組成物の必要条件である、アルカリ領域
において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有
するプルラナーゼ、所謂アルカリプルラナーゼ及びアル
カリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少ないのが実情
である。尚、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適pH
をアルカリ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プル
ラナーゼとは、至適pHは中性から酸性領域に有するが、
アルカリ領域に於いても至適pHに於ける活性に比較して
充分な活性を有し且つ安全性を保持するものを言う。ま
た、中性とはpH６〜８の範囲を言い、アルカリ性とはそ
れ以上のpH範囲を言う。
従来、知られているアルカリプルラナーゼ及びアルカリ
耐性プルラナーゼの生産方法としては、好アルカリ性バ
チルス属細菌の培養によってアルカリプルラナーゼを生
産する方法が堀越等により報告されているのみである
〔Biochem.Biophys.Acta,３９７，１８８(1975)，特公
昭53-27786号公報〕。
耐性プルラナーゼの生産方法としては、好アルカリ性バ
チルス属細菌の培養によってアルカリプルラナーゼを生
産する方法が堀越等により報告されているのみである
〔Biochem.Biophys.Acta,３９７，１８８(1975)，特公
昭53-27786号公報〕。
しかしながら、堀越らによって得られたプルラナーゼ
は、アルカリ領域に至適pHを有する酵素であり、従来知
られているプルラナーゼにより基質特異性が広い等の特
徴を有しているが、至適pHが８〜９と弱アルカリ領域に
あるため、洗浄剤組成物として使用するには適さないと
いう問題があった。また、酵素の生産性が悪いという欠
点も有しており、工業発酵生産に適うものではなかっ
た。そこで更に高アルカリ領域に至適pHを有するプルラ
ナーゼの開発が望まれていた。
は、アルカリ領域に至適pHを有する酵素であり、従来知
られているプルラナーゼにより基質特異性が広い等の特
徴を有しているが、至適pHが８〜９と弱アルカリ領域に
あるため、洗浄剤組成物として使用するには適さないと
いう問題があった。また、酵素の生産性が悪いという欠
点も有しており、工業発酵生産に適うものではなかっ
た。そこで更に高アルカリ領域に至適pHを有するプルラ
ナーゼの開発が望まれていた。
一般に、食器及び衣類の洗浄は中性から高アルカリ性の
広範なpH条件下で行われる為、高アルカリ性側に至適pH
を有し、且つ食器洗浄用並びに衣類洗浄用酵素としての
機能を有するアルカリプルラナーゼを生産する微生物を
自然界から探索し、取得することは極めて意義のあるこ
とである。
広範なpH条件下で行われる為、高アルカリ性側に至適pH
を有し、且つ食器洗浄用並びに衣類洗浄用酵素としての
機能を有するアルカリプルラナーゼを生産する微生物を
自然界から探索し、取得することは極めて意義のあるこ
とである。
斯かる実情において、本発明者は、アルカリプルラナー
ゼを生産する微生物を自然界に求め、鋭意探索を続けて
きたが、神奈川県横浜市の土壌より採取した好アルカリ
微生物の一種であるバチルス属に属する微生物のバチル
ス エスピー(Bacillus sp.)KSM-AP1876が、食器洗浄剤
組成物ならびに衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有
効な、新規なアルカリプルラナーゼＺ−Ｉを生産するこ
とを見出し、本発明を完成した。
ゼを生産する微生物を自然界に求め、鋭意探索を続けて
きたが、神奈川県横浜市の土壌より採取した好アルカリ
微生物の一種であるバチルス属に属する微生物のバチル
ス エスピー(Bacillus sp.)KSM-AP1876が、食器洗浄剤
組成物ならびに衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有
効な、新規なアルカリプルラナーゼＺ−Ｉを生産するこ
とを見出し、本発明を完成した。
したがって、本発明は新規なアルカリプルラナーゼＺ−
Ｉを提供するものである。
Ｉを提供するものである。
また本発明はこのアルカリプルラナーゼＺ−Ｉを生産す
る新規な微生物を提供するものである。更に本発明はア
ルカリプルラナーゼＺ−Ｉの製造法を提供するものであ
る。
る新規な微生物を提供するものである。更に本発明はア
ルカリプルラナーゼＺ−Ｉの製造法を提供するものであ
る。
本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉを生産する上記微
生物は、次のような菌学的性質を有する。尚、以下にお
いて菌株の分類に用いた培地は次の培地１〜２１の２１
種類であり、これらは何れも別滅菌した炭酸ナトリウム
(Na2CO3)を0.5重量％（以下、単に％という）含有す
る。
生物は、次のような菌学的性質を有する。尚、以下にお
いて菌株の分類に用いた培地は次の培地１〜２１の２１
種類であり、これらは何れも別滅菌した炭酸ナトリウム
(Na2CO3)を0.5重量％（以下、単に％という）含有す
る。
使用した培地の組成（表示は％）： 培地１．ニュートリエントブロス，0.8；寒天末（和光
純薬製），1.5 培地２．ニュートリエントブロス，0.8 培地３．ニュートリエントブロス，0.8；ゼラチン，20.
0；寒天末（和光純薬製），1.5 培地４．バクトリトマスミルク，10.5 培地５．ニュートリエントブロス，0.8；KNO3，0.1 培地６．バクトペプトン，0.7；NaCl，0.5；ブドウ糖，
0.5 培地７．SIM寒天培地（栄研化学製），指示量 培地８．TSI寒天培地（栄研化学製），指示量 培地９．酵母エキス，0.5；バクトペプトン，1.5；K2HP
O4，0.1；MgSO4・7H2O，0.02；可溶性澱粉，2.0；寒天末
（和光純薬製），1.5 培地10．コーサー培地（栄研化学製），指示量 培地11．クリステンセン培地（栄研化学製），指示量 培地12．酵母エキス，0.05；Na2SO4，0.1；KH2PO4，
0.1；ブドウ糖，1.0 酵母エキス，0.05；Na2SO4，0.1；KH2PO4，0.1；ブド
ウ糖，1.0；CaCl2・2H2O，0.05；MnSO4，４〜６H2O，0.0
1；FeSO4・7H2O，0.001；MgSO4・7H2O，0.02 窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、
塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞれ0.
25％、0.2025％、0.158％、0.195％となるように上記
及びの培地に加えて用いた。
純薬製），1.5 培地２．ニュートリエントブロス，0.8 培地３．ニュートリエントブロス，0.8；ゼラチン，20.
0；寒天末（和光純薬製），1.5 培地４．バクトリトマスミルク，10.5 培地５．ニュートリエントブロス，0.8；KNO3，0.1 培地６．バクトペプトン，0.7；NaCl，0.5；ブドウ糖，
0.5 培地７．SIM寒天培地（栄研化学製），指示量 培地８．TSI寒天培地（栄研化学製），指示量 培地９．酵母エキス，0.5；バクトペプトン，1.5；K2HP
O4，0.1；MgSO4・7H2O，0.02；可溶性澱粉，2.0；寒天末
（和光純薬製），1.5 培地10．コーサー培地（栄研化学製），指示量 培地11．クリステンセン培地（栄研化学製），指示量 培地12．酵母エキス，0.05；Na2SO4，0.1；KH2PO4，
0.1；ブドウ糖，1.0 酵母エキス，0.05；Na2SO4，0.1；KH2PO4，0.1；ブド
ウ糖，1.0；CaCl2・2H2O，0.05；MnSO4，４〜６H2O，0.0
1；FeSO4・7H2O，0.001；MgSO4・7H2O，0.02 窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、
塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞれ0.
25％、0.2025％、0.158％、0.195％となるように上記
及びの培地に加えて用いた。
培地13．キングＡ培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地14．キングＢ培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地15．尿素培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地16．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬製） 培地17．３％過酸化水素水 培地18．バクトペプトン，0.5；酵母エキス，0.5；K2HP
O4，0.1；ブドウ糖，1.0；MgSO4・7H2O，0.02 培地19．バクトペプトン，2.7；NaCl，5.5；K2HPO4，0.
3；ブドウ糖，0.5；ブロモチモールブルー，0.06；寒天
末（和光純薬製），1.5 培地20．(NH4)2HPO4，0.1；KCl，0.02；MgSO4・7H2O，0.
02；酵母エキス，0.05；糖，1.0 培地21．カゼイン，0.5；酵母エキス，0.5；ブドウ糖，
1.0；K2HPO4，0.1；MgSO4・7H2O，0.02；寒天末（和光純
薬製），1.5 （菌学的性質） (a)顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、1.0〜2.2μｍ×2.2〜4.4μｍの桿菌で
あり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（0.8〜1.0μｍ×
1.0〜1.8μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。グ
ラム染色は不定。抗酸性はない。
製薬製） 培地17．３％過酸化水素水 培地18．バクトペプトン，0.5；酵母エキス，0.5；K2HP
O4，0.1；ブドウ糖，1.0；MgSO4・7H2O，0.02 培地19．バクトペプトン，2.7；NaCl，5.5；K2HPO4，0.
3；ブドウ糖，0.5；ブロモチモールブルー，0.06；寒天
末（和光純薬製），1.5 培地20．(NH4)2HPO4，0.1；KCl，0.02；MgSO4・7H2O，0.
02；酵母エキス，0.05；糖，1.0 培地21．カゼイン，0.5；酵母エキス，0.5；ブドウ糖，
1.0；K2HPO4，0.1；MgSO4・7H2O，0.02；寒天末（和光純
薬製），1.5 （菌学的性質） (a)顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、1.0〜2.2μｍ×2.2〜4.4μｍの桿菌で
あり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（0.8〜1.0μｍ×
1.0〜1.8μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。グ
ラム染色は不定。抗酸性はない。
(b)各種培地に於ける生育状態 肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円
滑、周縁は円滑又は波状である。又集落の色調は乳白色
半透明で光沢がある。
滑、周縁は円滑又は波状である。又集落の色調は乳白色
半透明で光沢がある。
肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色半透
明である。
明である。
肉汁液体培養（培地２） 生育する。
肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。
リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。リトマスの
変色は培地がアルカリ性のため判定できない。
変色は培地がアルカリ性のため判定できない。
(c)生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。
MRテスト（培地６） 培地がアルカリ性のため判定できない。
VPテスト（培地６） 陰性。
インドールの生成（培地７） 陰性。
硫化水素の生成（培地８） 陰性。
澱粉の加水分解（培地９） 陽性。
クエン酸の利用 コーサー培地（培地１０）で陰性。クリステンセン培地
（培地１１）では陽性か陰性か判定できない。
（培地１１）では陽性か陰性か判定できない。
無機窒素源の利用（培地１２） 硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。
色素の生成（培地１３，１４） 陰性。
ウレアーゼ（培地１５） 陰性。
オキシダーゼ（培地１６） 陽性、陰性のどちらとも判断できない。
カタラーゼ培地（培地１７） 陽性。
生育の範囲（培地１８） 生育の温度範囲は２０〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３５℃であった。
０〜３５℃であった。
生育のpH範囲はpH７〜10.5、生育最適pHはpH１０であっ
た。
た。
酸素に対する態度 好気的。
O-Fテスト（培地１９） アルカリ性のため変色は判定できない。
好気状態でのみ生育する。
糖の利用性（培地２０） L-アラビノース、D-キシロース、D-グルコース、D-マン
ノース、D-フラクトース、D-ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、グリセリン、デンプン、サリシン、D-リボース及び
デキストリンを利用する。
ノース、D-フラクトース、D-ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、グリセリン、デンプン、サリシン、D-リボース及び
デキストリンを利用する。
食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） 食塩濃度が５％では生育するが、７％で生育できない。
カゼインの分解（培地２１） 陽性。
以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー(Bergey's Mannual of Determinative Bacteriolog
y)第８版及びザ・ジーナス・バチルス（“The Genus Ba
cillus"Ruth,B.Gordon,Agriculture Handbook No.４２
７，Agricultural Research Service,U.S.Department o
f Agriculture Washington D.C.,(1973))を参照し、比
較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス(B
acillus)属の一種であると認められる。しかし、本菌株
は中性領域では生育できず、専ら高アルカリ領域で良好
な生育を示すことから、最近、HorikoshiとAkiba("Alka
lophilic Microorganism",Japan Scientific Society P
ress(Tokyo),1982 年刊）の主張している、所謂好アル
カリ性 (Alkalophilic)微生物に属し、暫定的に従来の中性で生
育するバチルス属細菌とは区別される。
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー(Bergey's Mannual of Determinative Bacteriolog
y)第８版及びザ・ジーナス・バチルス（“The Genus Ba
cillus"Ruth,B.Gordon,Agriculture Handbook No.４２
７，Agricultural Research Service,U.S.Department o
f Agriculture Washington D.C.,(1973))を参照し、比
較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス(B
acillus)属の一種であると認められる。しかし、本菌株
は中性領域では生育できず、専ら高アルカリ領域で良好
な生育を示すことから、最近、HorikoshiとAkiba("Alka
lophilic Microorganism",Japan Scientific Society P
ress(Tokyo),1982 年刊）の主張している、所謂好アル
カリ性 (Alkalophilic)微生物に属し、暫定的に従来の中性で生
育するバチルス属細菌とは区別される。
更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス エスピー KSM-AP1876と命名し、微工研
菌寄第10887号(FERM P-10887)として通産省工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した。
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス エスピー KSM-AP1876と命名し、微工研
菌寄第10887号(FERM P-10887)として通産省工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した。
上記の本発明微生物を用いて本発明のアルカリプルラナ
ーゼＺ−Ｉを得るには、培地に微生物を接種し、常法に
従って培養すればよい。また、培地中には、資化し得る
炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ま
しい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例
えば、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆
粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、
ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、
ハイプロ、アジパワー、ソイビーンミール、綿実油粕、
カルチベーター、アジプロン、ゼストなどの有機窒素源
及び硫酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、酢酸ア
ンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭素源と
しては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解により生じ
た分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグリ
コース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボ
ース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽
糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビ
ット、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば酢酸など
が挙げられる。またその他、りん酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、
ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。
ーゼＺ−Ｉを得るには、培地に微生物を接種し、常法に
従って培養すればよい。また、培地中には、資化し得る
炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ま
しい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例
えば、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆
粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、
ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、
ハイプロ、アジパワー、ソイビーンミール、綿実油粕、
カルチベーター、アジプロン、ゼストなどの有機窒素源
及び硫酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、酢酸ア
ンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭素源と
しては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解により生じ
た分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグリ
コース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボ
ース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽
糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビ
ット、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば酢酸など
が挙げられる。またその他、りん酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、
ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。
斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リプルラナーゼＺ−Ｉの採取及び精製は、一般の酵素の
採取及び精製の手順に準じて行うことができる。即ち、
遠心分離または濾過等の通常の固液分離手段により菌体
を培養液から除去すれば、粗酵素液を得ることができ
る。この粗酵素液は、そのまま使用することもできる
が、必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結
晶化することにより精製酵素として使用することも可能
である。
リプルラナーゼＺ−Ｉの採取及び精製は、一般の酵素の
採取及び精製の手順に準じて行うことができる。即ち、
遠心分離または濾過等の通常の固液分離手段により菌体
を培養液から除去すれば、粗酵素液を得ることができ
る。この粗酵素液は、そのまま使用することもできる
が、必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結
晶化することにより精製酵素として使用することも可能
である。
以下、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの精製法の
一例を挙げ、更に詳しく説明する。
一例を挙げ、更に詳しく説明する。
アルカリ性バチルス属細菌KSM-AP1876株を１％プルラ
ン、0.2％ トリプトン、0.1％ 酵母エキス、0.03％
KH2PO4、0.02％ CaCl2・2H2O、0.1％ (NH4)2SO4、0.00
1％ FeSO4・7H2O、0.0001％ MnCl2・4H2O、0.02％ MgS
O4・7H2O及び0.5％炭酸ナトリウムを含む培地で、３０℃
にて３日間好気的に振盪培養し、得られる培養液から菌
体を除き、上澄液を得る。次いで、該上澄液にDEAE−セ
ルロース粉末を加え、上澄液中のプルラナーゼを完全に
DEAE−セルロースに吸着させる。次いで、１０mMトリス
−塩酸緩衝液（pH８）で樹脂を洗浄した後、0.6Mの食塩
を含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）で酵素を溶出
する。更に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）に対し
て透析濃縮後、同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロース
DE５２に吸着させ、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）
を用いて０〜１Ｍの食塩の濃度勾配により溶出し、その
活性画分を集め、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を
用いて濃縮した後、0.1M食塩を含む１０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH８）を用いて一夜透析する。これを濃縮し、
次いで透析後、0.1M食塩を含む１０mMトリス−塩酸緩衝
液（pH８）で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム
に吸着後、0.1M食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性
画分を集め、更にDEAE トヨパール650Sカラムに吸着さ
せる。吸着した酵素を、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
８）中、0.1〜1Mの食塩の濃度勾配により溶出し、その
活性画分を集める。集められた活性画分を、限外濾過膜
を用いて濃縮した後、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）で平衡化したブチル ト
ヨパール650Sカラムに吸着させ、１０mMトリス−塩酸緩
衝液（pH８）を用いて２〜０Ｍの硫酸アンモニウムの濃
度勾配により溶出し、その活性画分を集める。集められ
た活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後、１０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH８）を用いて一夜透析する。斯
くして得られる精製酵素はポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度１５％）及びソジウムドデシル硫酸(SD
S)電気泳動で単一のバンドを与え、活性収率は約４％で
あった。
ン、0.2％ トリプトン、0.1％ 酵母エキス、0.03％
KH2PO4、0.02％ CaCl2・2H2O、0.1％ (NH4)2SO4、0.00
1％ FeSO4・7H2O、0.0001％ MnCl2・4H2O、0.02％ MgS
O4・7H2O及び0.5％炭酸ナトリウムを含む培地で、３０℃
にて３日間好気的に振盪培養し、得られる培養液から菌
体を除き、上澄液を得る。次いで、該上澄液にDEAE−セ
ルロース粉末を加え、上澄液中のプルラナーゼを完全に
DEAE−セルロースに吸着させる。次いで、１０mMトリス
−塩酸緩衝液（pH８）で樹脂を洗浄した後、0.6Mの食塩
を含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）で酵素を溶出
する。更に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）に対し
て透析濃縮後、同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロース
DE５２に吸着させ、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）
を用いて０〜１Ｍの食塩の濃度勾配により溶出し、その
活性画分を集め、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を
用いて濃縮した後、0.1M食塩を含む１０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH８）を用いて一夜透析する。これを濃縮し、
次いで透析後、0.1M食塩を含む１０mMトリス−塩酸緩衝
液（pH８）で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム
に吸着後、0.1M食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性
画分を集め、更にDEAE トヨパール650Sカラムに吸着さ
せる。吸着した酵素を、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
８）中、0.1〜1Mの食塩の濃度勾配により溶出し、その
活性画分を集める。集められた活性画分を、限外濾過膜
を用いて濃縮した後、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）で平衡化したブチル ト
ヨパール650Sカラムに吸着させ、１０mMトリス−塩酸緩
衝液（pH８）を用いて２〜０Ｍの硫酸アンモニウムの濃
度勾配により溶出し、その活性画分を集める。集められ
た活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後、１０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH８）を用いて一夜透析する。斯
くして得られる精製酵素はポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度１５％）及びソジウムドデシル硫酸(SD
S)電気泳動で単一のバンドを与え、活性収率は約４％で
あった。
斯くして得られる、本発明アルカリプルラナーゼＺ−Ｉ
の酵素化学的諸性質について、以下に説明する。
の酵素化学的諸性質について、以下に説明する。
尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々１０mM宛）を用
い、以下の方法に従って行った。
い、以下の方法に従って行った。
pH４〜６ 酢酸緩衝液 pH６〜８ リン酸緩衝液 pH８〜１１ グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液 pH１１〜１２ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法： 各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は0.
25％）を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1mlを加
え、４０℃で、３０分間反応させた。反応後、３、５−
ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic ac
id(DNS)）法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応
液1.0mlにDNS試薬1.0mlを加え、５分間、１００℃で加
熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈
し、波長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１分
間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する
酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
25％）を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1mlを加
え、４０℃で、３０分間反応させた。反応後、３、５−
ジニトロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic ac
id(DNS)）法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応
液1.0mlにDNS試薬1.0mlを加え、５分間、１００℃で加
熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈
し、波長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１分
間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する
酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
（酵素化学的諸性質） 作用 プルランのα−１，６グルコシド結合を分解してマルト
トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
ルコシド結合も加水分解する。
トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
ルコシド結合も加水分解する。
基質特異性 本酵素は表１に示す如く、α−１，６グルコシド結合で
分岐した枝分かれ糖のうち、マルトース以上の重合度を
有する枝分かれ構造を加水分解する。
分岐した枝分かれ糖のうち、マルトース以上の重合度を
有する枝分かれ構造を加水分解する。
以下余白 作用pH及び至適pH 作用pHをpH５〜１１の範囲に有し、至適pHをpH9.5〜１
１の範囲に有する。
１の範囲に有する。
尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を0.25％プルラン、
１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、リン酸緩衝液（pH６〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜１１）および塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH１１〜１２）の反応系を用い、４０℃３０分間
反応させて測定した結果を第１図に示す。
１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、リン酸緩衝液（pH６〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜１１）および塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH１１〜１２）の反応系を用い、４０℃３０分間
反応させて測定した結果を第１図に示す。
pH安定性 pH８〜１０で極めて安定であり、pH７〜10.5に於いても
約５０％以上の活性を維持する。
約５０％以上の活性を維持する。
尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を0.25％プルラン、
１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、リン酸緩衝液（pH６〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜１１）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１１〜１２）の反応系を用い、４５℃で１０分間
反応させて測定した結果を第２図に示す。
１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、リン酸緩衝液（pH６〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜１１）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１１〜１２）の反応系を用い、４５℃で１０分間
反応させて測定した結果を第２図に示す。
作用温度範囲及び最適温度 １０〜６０℃の広範囲で作用し、その最適作用温度は約
５０℃に認められる（第３図）。
５０℃に認められる（第３図）。
温度安定性 本酵素についてpH9.5の条件で温度を変化させ、各温度
で３０分間処理することにより失活の条件を調べると４
０℃までは極めて安定であり、また、５０℃に於いても
約５０％以上の残存活性を有する（第４図）。
で３０分間処理することにより失活の条件を調べると４
０℃までは極めて安定であり、また、５０℃に於いても
約５０％以上の残存活性を有する（第４図）。
分子量 SDS電気泳動法（ゲル濃度7.5％）による分子量は120,00
0±5,000である。
0±5,000である。
金属イオンの影響 １mMのHg2+、Cd2+及びMn2+で強く阻害され、Pb2+で若干
阻害された。
阻害された。
界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アリキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエレンアルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフォ
ン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナト
リウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、SDS、石鹸
及びソフタノール等の各種界面活性剤の0.05％溶液で４
０℃にて１５分間処理しても殆ど活性阻害を受けない。
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエレンアルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフォ
ン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナト
リウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、SDS、石鹸
及びソフタノール等の各種界面活性剤の0.05％溶液で４
０℃にて１５分間処理しても殆ど活性阻害を受けない。
キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA（１０mM）、EGTA（１０mM）、ク
エン酸（0.05％）及びゼオライト（0.05％）は殆ど活性
を阻害しない。
エン酸（0.05％）及びゼオライト（0.05％）は殆ど活性
を阻害しない。
プロテアーゼ耐性 API−２１（昭和電工製）、マクサターゼ（IBIS製）、
サビナーゼ、アルカラーゼ、エスペラーゼ（ノボ製）等
のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共存（0.2AU/
）させても、何れのプロテアーゼに対しても強い耐性
を有する。
サビナーゼ、アルカラーゼ、エスペラーゼ（ノボ製）等
のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共存（0.2AU/
）させても、何れのプロテアーゼに対しても強い耐性
を有する。
本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉは、従来のプルラ
ナーゼに比較して高アルカリ性側（pH9.5〜１１）に至
適pHを有し、且つ広いpH範囲に於いて極めて安定であ
る。また、至適温度も５０℃であり、熱安定性も４０℃
まで極めて安定である。更に、界面活性剤、キレート
剤、洗剤用プロテアーゼ等の洗浄剤配合成分によっても
殆ど阻害を受けない。従って、本酵素は洗浄剤組成物の
配合成分として、有利に使用することができるものであ
り、工業的に極めて大きな意義を有するものである。
ナーゼに比較して高アルカリ性側（pH9.5〜１１）に至
適pHを有し、且つ広いpH範囲に於いて極めて安定であ
る。また、至適温度も５０℃であり、熱安定性も４０℃
まで極めて安定である。更に、界面活性剤、キレート
剤、洗剤用プロテアーゼ等の洗浄剤配合成分によっても
殆ど阻害を受けない。従って、本酵素は洗浄剤組成物の
配合成分として、有利に使用することができるものであ
り、工業的に極めて大きな意義を有するものである。
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する。
参考例１ 神奈川県横浜市の土壌薬匙一杯（約0.5ｇ）、滅菌生理
食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した。この熱
処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培地
Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養
し、集落を形成させた。集落の周囲にプルランの溶解に
基づく透明帯を形成するものを選出し、プルラナーゼ生
産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地に接
種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離
した上清液についてプルラナーゼ活性を、pH１０にて測
定し、アルカリプルラナーゼ生産菌をスクリーニングし
た。
食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した。この熱
処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培地
Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養
し、集落を形成させた。集落の周囲にプルランの溶解に
基づく透明帯を形成するものを選出し、プルラナーゼ生
産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地に接
種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離
した上清液についてプルラナーゼ活性を、pH１０にて測
定し、アルカリプルラナーゼ生産菌をスクリーニングし
た。
上述の方法により、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−
Ｉ生産菌バチルス エスピーKSM-AP1876(FERM P-10887)
を取得することが出来た。
Ｉ生産菌バチルス エスピーKSM-AP1876(FERM P-10887)
を取得することが出来た。
培地Ａ プルラン 0.8％ 着色プルラン 0.2％ ポリペプトン 0.2％ 酵母エキス 0.1％ KH2PO4 0.03％ (NH4)2SO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ CaCl2・2H2O 0.02％ FeSO4・7H2O 0.001％ MnCl2・4H2O 0.0001％ 寒天 1.5％Na2CO3 0.5％ pH10.0 培地Ｂ プルラン １％ トリプトン 0.2％ 酵母エキス 0.1％ KH2PO4 0.03％ (NH4)2SO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ CaCl2・2H2O 0.02％ FeSO4・7H2O 0.001％ MnCl2・4H2O 0.0001％Na2CO3 0.5％ pH10.0 実施例１ アルカリプルラナーゼＺ−Ｉ生産菌、バチルスエスピー
KSM-AP1876株を参考例１の液体培地Ｂに接種し、３０
℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離して
除き、粗プルラナーゼ酵素液とした。更に、通常の方法
に従って、エタノール乾燥粉末とし、以下の表２に示す
粗酵素標品を得た。（酵素活性はpH９に於ける測定値で
ある。） 実施例２ 参考例１の液体培地Ｂに於いて、プルランに代えてマル
トースを１％添加した培地に、アルカリプルラナーゼＺ
−Ｉ生産菌、バチルス エスピー KSM-AP1876株を接種
し、３０℃で２乃至３日間振盪培養した。遠心分離上清
についてプルラナーゼ活性を測定した結果、培養液１
あたり、２１１Ｕの活性を有してした。
KSM-AP1876株を参考例１の液体培地Ｂに接種し、３０
℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離して
除き、粗プルラナーゼ酵素液とした。更に、通常の方法
に従って、エタノール乾燥粉末とし、以下の表２に示す
粗酵素標品を得た。（酵素活性はpH９に於ける測定値で
ある。） 実施例２ 参考例１の液体培地Ｂに於いて、プルランに代えてマル
トースを１％添加した培地に、アルカリプルラナーゼＺ
−Ｉ生産菌、バチルス エスピー KSM-AP1876株を接種
し、３０℃で２乃至３日間振盪培養した。遠心分離上清
についてプルラナーゼ活性を測定した結果、培養液１
あたり、２１１Ｕの活性を有してした。
実施例３ 実施例１で得られた粗酵素液について、DEAEセルロー
ス吸着、DEAE セルロース（ワットマン社製）クロマ
トグラフィー、セファクリル（ファルマシア社製）ク
ロマトグラフィー、DEAE トヨパール（東洋曹達社
製）クロマトグラフィー、ブチル トヨパール（東洋
曹達社製）クロマトグラフィーをすることによって精製
を行い、アルカリプルラナーゼＺ−Ｉを得た。
ス吸着、DEAE セルロース（ワットマン社製）クロマ
トグラフィー、セファクリル（ファルマシア社製）ク
ロマトグラフィー、DEAE トヨパール（東洋曹達社
製）クロマトグラフィー、ブチル トヨパール（東洋
曹達社製）クロマトグラフィーをすることによって精製
を行い、アルカリプルラナーゼＺ−Ｉを得た。
得られたアルカリプルラナーゼＺ−Ｉについてデービス
(Davis D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,１２１，４０４(196
4))の方法に従って電気泳動を行った後、コマシー・ブ
リリアント・ブルーで染色した単一のバンドを与える事
を確認した（第５図）。
(Davis D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,１２１，４０４(196
4))の方法に従って電気泳動を行った後、コマシー・ブ
リリアント・ブルーで染色した単一のバンドを与える事
を確認した（第５図）。
実施例４ 実施例３で得られたアルカリプルラナーゼＺ−Ｉについ
て、常法に従ってSDS電気泳動を行った（第６図）。こ
の結果から、本酵素の分子量は120,000±5,000であっ
た。
て、常法に従ってSDS電気泳動を行った（第６図）。こ
の結果から、本酵素の分子量は120,000±5,000であっ
た。
第１図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの反応
pHと相対活性との関係を示す図面である。第２図は、本
発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの処理pHと残存活性
との関係を示す図面である。 第３図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの反応
温度（pH9.5）と相対活性との関係を示す図面である。 第４図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの処理
温度（pH9.5）と残存活性との関係を示す図面である。 第５図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの電気
泳動の結果を示す図面である。 第６図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−ＩのSDS
電気泳動の結果を示す図面である。
pHと相対活性との関係を示す図面である。第２図は、本
発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの処理pHと残存活性
との関係を示す図面である。 第３図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの反応
温度（pH9.5）と相対活性との関係を示す図面である。 第４図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの処理
温度（pH9.5）と残存活性との関係を示す図面である。 第５図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの電気
泳動の結果を示す図面である。 第６図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−ＩのSDS
電気泳動の結果を示す図面である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (3)
- 【請求項１】次の酵素化学的性質を有するアルカリプル
ラナーゼＺ−Ｉ。 1)作用 プルランのα−１，６グルコシド結合を分解してマルト
トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
ルコシド結合を加水分解する。 2)基質特異性 α−１，６グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有
する糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分か
れ構造を加水分解する。 3)作用pH及び至適pH 作用pHはpH５〜１１の範囲であり、至適pHは9.5〜１１
の範囲である。 4)pH安定性 pH８から１０の範囲で極めて安定であり、pH７〜10.5の
範囲に於いても、５０％以上の相対活性を有する（４５
℃、１０分間処理による）。 5)作用温度範囲及び最適温度 １０〜６０℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約５
０℃である。 6)温度安定性 ４０℃までは極めて安定である（pH9.5の１０mMグリシ
ン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間処理に
よる）。 7)分子量 ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は120,00
0±5,000である。 8)金属イオンの影響 Hg2+，Cd2+，Mn2+及びPb2+で阻害される。 9)界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソジウム
ドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤に
よって殆ど活性阻害を受けない。 10)キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸及びゼオライトで殆ど活性阻害を
受けない。 11)プロテアーゼ耐性 アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。 - 【請求項２】請求項１記載のアルカリプルラナーゼＺ−
Ｉを生産する能力を有し、微工研菌寄第10887号として
寄託されたバチルス エスピー KSM-AP1876。 - 【請求項３】バチルス属に属するアルカリプルラナーゼ
Ｚ−Ｉ生産菌を培養し、その培養物から請求項１記載の
アルカリプルラナーゼＺ−Ｉを採取することを特徴とす
るアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの製造法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1226211A JPH0659215B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 |
| DK90116597.7T DK0415397T3 (da) | 1989-08-31 | 1990-08-29 | Alkalisk pullulanase samt mikroorganisme og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
| ES90116597T ES2065449T3 (es) | 1989-08-31 | 1990-08-29 | Pullulanasa alcalina, microorganismo que la produce y procedimiento para producirla. |
| EP90116597A EP0415397B1 (en) | 1989-08-31 | 1990-08-29 | Alkaline pullulanase, microorganism producing the same, and process for producing the same |
| DE69013446T DE69013446T2 (de) | 1989-08-31 | 1990-08-29 | Alkalische Pullulanase, Mikroorganismus der sie produziert und Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms. |
| CA002024194A CA2024194C (en) | 1989-08-31 | 1990-08-29 | Alkaline pullulanase, microorganism producing the same, and process for producing the same |
| FI904277A FI95481C (fi) | 1989-08-31 | 1990-08-30 | Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi |
| US07/575,434 US5147795A (en) | 1989-08-31 | 1990-08-30 | Alkaline pullulanase from bacillus sp. ferm p-10887 |
| NO903801A NO180642C (no) | 1989-08-31 | 1990-08-30 | Alkalipullulanase og renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme som produserer denne |
| HK154695A HK154695A (en) | 1989-08-31 | 1995-09-28 | Alkaline pullulanase microorganism producing the same and process for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1226211A JPH0659215B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0387177A JPH0387177A (ja) | 1991-04-11 |
| JPH0659215B2 true JPH0659215B2 (ja) | 1994-08-10 |
Family
ID=16841640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1226211A Expired - Fee Related JPH0659215B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 |
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Families Citing this family (1)
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| US20090260783A1 (en) * | 2006-03-06 | 2009-10-22 | Tokyo University Of Science Educational Foundation | Boil Cooling Method, Boil Cooling Apparatus, Flow Channel Structure and Applied Product Thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH01226210A (ja) * | 1988-03-04 | 1989-09-08 | Sony Corp | フィルタの設計方法 |
-
1989
- 1989-08-31 JP JP1226211A patent/JPH0659215B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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| JPH01226210A (ja) * | 1988-03-04 | 1989-09-08 | Sony Corp | フィルタの設計方法 |
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