FI95481C - Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi - Google Patents
Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI95481C FI95481C FI904277A FI904277A FI95481C FI 95481 C FI95481 C FI 95481C FI 904277 A FI904277 A FI 904277A FI 904277 A FI904277 A FI 904277A FI 95481 C FI95481 C FI 95481C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- range
- medium
- pullulanase
- alkaline
- optimum
- Prior art date
Links
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title claims description 72
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 65
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 claims description 22
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 claims description 22
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 20
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 14
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 14
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 14
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 11
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 10
- IDQFMTPFABLANH-UHFFFAOYSA-L disodium 2-aminoacetic acid chloride hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].NCC(O)=O IDQFMTPFABLANH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 9
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 claims description 8
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 8
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 8
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 claims description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000344 soap Substances 0.000 claims description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 72
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 52
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 52
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 52
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- -1 sodium alkyl sulfate Chemical class 0.000 description 14
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 4
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N D-ribopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 2
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 2
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 description 1
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241001134780 Bacillus acidopullulyticus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- ZCLAHGAZPPEVDX-UHFFFAOYSA-N D-panose Natural products OC1C(O)C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC1COC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 ZCLAHGAZPPEVDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N Isomaltose Natural products OC[C@H]1O[C@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N O6-alpha-D-Galactopyranosyl-D-galactose Natural products OCC1OC(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C(O)C1O AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N UNPD130147 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N galactotriose Natural products OC[C@@H]1O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H](O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H](CO)[C@@H]3O)[C@@H]2O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N gentiobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N isomaltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N 0.000 description 1
- FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)C(O)O2)O)O1 FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 238000010412 laundry washing Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N malto-pentaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N maltopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZCLAHGAZPPEVDX-MQHGYYCBSA-N panose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@@H]1CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZCLAHGAZPPEVDX-MQHGYYCBSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 230000019086 sulfide ion homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
- C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
, 95481
Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi Tämä keksintö koskee uutta alkalista pullulanaasia, 5 tätä alkalista pullulanaasia tuottavaa mikro-organismia ja menetelmää kyseisen alkalisen pullulanaasin tuottamiseksi.
Pullulanaasi on entsyymi, joka hydrolysoi vain pullulaanin alfa-1,6-glykosidisidoksia tuottaen lopulta maltotrioosia. Pullulanaasin löysivät alunperin Aerobacter 10 aerogenes -sukuun kuuluvasta kannasta Bender ja Wallenfels v. 1961 (Biochem.Z. 334 (1961) 79). Vast'ikään on raportoitu erilaisista pullulanaasia tuottamaan kykenevistä mikro-organismeista. Näitä mikro-organismeja ovat esimerkiksi Bacillus sp. (J.Jpn.Soc.Starch Sei. 30 (1983) 200); 15 Bacillus acidopullulyticus (Agric.Biol.Chem. 52 (1984) 2293); Bacillus stearothermophilus (Eur.J.Appi.Microbiol. Biotechnol. 17 (1983) 24); Streptococcus mitis (Biochem.J. 108 (1968) 33); ja Lactobacillus (Denpun Kagaku 28 (1981) 72).
20 Tiedetään, että pullulanaasilla ei ainoastaan ole edeltävää aktiivisuutta pullulaanin suhteen, vaan myös hydrolyyttisiä aktiivisuuksia tärkkelyksen, glykogeenin, amylopektiinin sekä haarautuneiden oligosakkaridien, jotka muodostuvat näiden yhdisteiden osittain hajotessa, alfa-25 1,6-glykosidisidoksien suhteen. Tämän ominaisuuden ansios- » · « ta pullulanaasia kutsutaan "haaraumia katkovaksi entsyymiksi" .
Edelleen on todettu, että yhdistämällä pullulanaasi sekä endo-tyypin amylaasiin että ekso-tyypin amylaasiin 30 tärkkelyksestä voitiin saada runsas saanto glukoosia tai : malto-oligosakkarideja kuten maltoosia, maltotrioosia, maltotetraoosia, maltopentaoosia tai maltoheksaoosia. Tämä ominaisuus on viime aikoina saanut osakseen runsaasti huomiota .
2 95481
On olemassa raportti, jonka mukaan näillä ominaisuuksilla varustettua pullulanaasia käytettiin amylaasiin yhdistettynä lisäaineena astianpesuaineisssa ja pyykinpesuaineissa, jolloin parannettiin merkittävästi pesuaine-5 vaikutusta pääasiassa tärkkelyslikaa vastaan (JP-patent-tihakemus n:o 285 424/1988). Pullulanaasin muitakin käyttöjä näillä aloilla on odotettavissa.
Kuitenkin lähes kaikki luontaisesti esiintyvät pullulanaasit luokitellaan neutraaleiksi tai happamiksi 10 pullulanaaseiksi, joilla on maksimaalista ja stabiilia entsymaattista aktiivisuutta neutraaleissa tai happamissa olosuhteissa. On olemassa vain muutamia aikalisiä tai alkalista ympäristöä sietäviä pullulanaaseja, joiden stabiilisuus on parempi ja jotka osoittavat maksimiaktiivi-15 suutta alkalisella pH-alueella, jolla pyykinpesussa tai astianpesussa toimitaan. Alkalisella pullulanaasilla tarkoitetaan tässä pullulanaasia, jonka pH-optimi on alkalisella alueella. Alkalista ympäristöä sietävällä pullulanaasilla tarkoitetaan pullulanaasia, jonka pH-optimi on 20 neutraalista happamalla alueella, mutta jolla on aktiivisuuteensa optimi-pH:ssa nähden riittävästi aktiivisuutta alkalisellakin alueella samalla kun stabiilisuus pysyy hyvänä. Sanalla "neutraali" tarkoitetaan tässä pH-aluetta 6 - 8 ja sanalla "alkalinen" pH-aluetta ei alle 8.
25 Tähän mennessä ei tunneta yhtään menetelmää sen
• · I
paremmin alkalisten pullulanaasien kuin alkalista ympäristöä sietävien pullulanaasienkaan tuottamiseksi, lukuun ottamatta Horikoshin et ai. raporttia, jossa julkistetaan menetelmä alkalisten pullulanaasien tuottamiseksi vilje-30 lemällä Bacillus-sukuun kuuluvaa alkalofiilistä mikro-or-ganismia (Biochem.Biophys.Acta 397 (1975) 188), ja JP-pa-tenttijulkaisua n:o 27786/1978.
Horikoshin et ai. pullulanaasi on entsyymi, jonka optimi-pH on alkalisella alueella ja jonka substraatti-35 spesifisyys on laajempi kuin perinteisesti tunnetuilla 3 95481 pullulanaaseilla. Kuitenkin koska sen pH-optimi on heikosti alkalisella alueella pH:ssa 8 - 9, sitä ei voida käyttää pesuainekoostumuksissa. Lisäksi Horikoshin et ai. menetelmän huonona puolena on entsyymin alhainen tuotto.
5 Tämän tyyppinen menetelmä ei siksi sovellu teolliseen tuotantoon fermentoimalla. Näistä syistä johtuen on ollut toivottavaa saada kehitetyksi pullulanaaseja, joiden pH-optimi on korkeammalla alkalisella alueella.
Astianpesua tai pyykinpesua suoritetaan tavalli-10 sesti laajalla pH-alueella neutraalista hyvin alkaliseen pH:hon. Tämän vuoksi olisi arvokasta löytää ja saada luontaisia mikro-organismeja, jotka tuottavat pullulanaaseja, joiden pH-optimi on hyvin alkalisella alueella ja jotka ovat käyttökelpoisia astianpesu- ja pyykinpesuai-15 neissa.
Vallitsevan tilanteen valossa esillä olevan keksinnön tekijät suorittivat laajoja tutkimuksia luontaisten mikro-organismien saamiseksi, jotka kykenevät tuottamaan alkalista pullulanaasia, jolloin he tuloksena tote-20 sivat, että uutta alkalista pullulanaasia, jonka pH-opti- mi on hyvin alkalisella alueella pH:ssa 9,5 - 11, voitiin saada viljelemällä Bacillus-sukuun kuuluvaa spesifistä mikro-organismia. Tämä havainto johti esillä olevan keksinnön päätökseen saattamiseen.
25 Täten tämän keksinnön päämäärä on antaa käyttöön uusi aikaiinen pullulanaasi, jolla on seuraavat entsymo-logiset ominaisuudet: (1) Vaikutus
Se hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia, jol-30 loin muodostuu maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, : amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten ha- “ joamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia.
(2) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue
Sen aktiivinen pH-alue on 4-12, jolloin optimi-35 pH-alue on 9,5 - 11.
, 95481 4 (3) Stabiilisuus pH:n suhteen
Se on stabiili pH-alueella 7 - 10 ja säilyttää 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden op-timi-pH-alueella, myös pH-alueella 6 - 11,5, käsiteltynä 5 45 °C:ssa 10 minuutin ajan.
(4) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Se on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 10 -60 °C, jolloin optimilämpötila on noin 55 °C.
(5) Stabiilisuus lämmön suhteen 10 Se on hyvin stabiili aina 45 °C:seen asti käsitel tynä 30 minuutin ajan 10 mM glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5).
(6) Molekyylipaino
Molekyylipaino on noin 110 000 +/- 10 000 mitattuna 15 geelisuodatusmenetelmällä valmistetta Bio-gel A 0,5m käyttäen.
Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön uusi puhdistettu alkalinen pullulanaasi Z-l, jolla on seuraavat entsymologiset ominaisuudet: 20 (1) Vaikutus
Se hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia, jolloin muodostuu maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten hajoamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia.
, 25 (2) Substraattispesifisyys • · <
Sillä on hydrolyyttistä aktiivisuutta sellaisten sokereiden alfa-1,6-glykosidisidoksien suhteen, joiden polymer isaatioaste on korkeampi kuin maltoosin.
(3) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue 30 Sen aktiivinen pH-alue on 5 - 11, jolloin optimi- .· pH-alue on 9,5 - 11.
• · (4) Stabiilisuus pH:n suhteen
Se on stabiili pH-alueella 8 - 10 ja säilyttää 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden op- 5 95481 timi-pH-alueella, myös pH-alueella 7 - 10,5, käsiteltynä 45 °C:ssa 10 minuutin ajan.
(5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Se on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 10 -5 60 °C, jolloin optimilämpötila on noin 50 °C.
(6) Stabiilisuus lämmön suhteen
Se on hyvin stabiili 40 °C:ssa käsiteltynä 30 minuutin ajan 10 mM glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5).
(7) Molekyylipaino 10 Molekyylipaino on noin 120 000 +/- 5 000 mitattuna elektroforeettisesti natriumdodesyylisulfaattia käyttäen.
(8) Metalli-ionien vaikutukset
Hg2+-, Cd2+-, Mn2*- ja Pb2+-ionit vaikuttavat siihen kielteisesti.
15 (9) Pesuaineiden vaikutus
Siihen eivät sanottavasti vaikuta pinta-aktiiviset aineet kuten lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (LAS), natriumalkyylisulfaatti (AS), natriumpolyoksiety-leenialkyylisulfaatti (ES), natrium-alfa-olefiinisulfo-20 naatti (AOS), natrium-alfa-sulfonoitu rasvahappoesteri (alfa-SFE), natriumalkyylisulfonaatti (SAS), natriumdode-syylisulfaatti (SDS), saippuat ja softanoli.
(10) Kelatoivien aineiden vaikutukset EDTA:11a, EGTA:11a, sitruunahapolla ja zeoliitilla 25 ei ole siihen sanottavaa vaikutusta.
> · · (11) Vastustuskyky proteaaseja vastaan
Se osoittaa voimakasta vastustuskykyä aikalisiä proteaaseja vastaan.
Esillä olevan keksinnön edelleen seuraava päämäärä 30 on antaa käyttöön Bacillus-sukuun kuuluva mikro-organismi, ; : joka kykenee tuottamaan alkalista pullulanaasia, jolla on edeltävät ominaisuudet.
Esillä olevan keksinnön seuraava päämäärä on antaa käyttöön menetelmä alkalisen pullulanaasin tuottamiseksi, 35 jolla on edeltävät ominaisuudet.
6 95481
Keksinnön muut päämäärät, ominaispiirteet ja edut ilmenevät selvemmin seuraavasta kuvauksesta.
Kuvion 1 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin suhteellinen aktiivisuus 5 reaktio-pH:n funktiona.
Kuvion 2 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin jäämäaktiivisuus pH:n funktiona.
Kuvion 3 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön 10 mukaisen alkalisen pullulanaasin suhteellinen aktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
Kuvion 4 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin jäämäaktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
15 Kuvion 5 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mu kaisen alkalisen pullulanaasin Z-l suhteellinen aktiivisuus reaktio-pH:n funktiona.
Kuvion 6 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l jäämäaktiivisuus pH:n 20 funktiona.
Kuvion 7 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l suhteellinen aktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
Kuvion 8 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön 25 mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l jäämäaktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
Kuvion 9 piirroksessa on esitetty tulokset tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l elektroforeesia josta.
30 Kuvion 10 piirroksessa on esitetty tulokset tämän .* keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l SDS-elek- troforeesiajosta.
Esillä olevan keksinnön mukaisille mikro-organismeille ei aseteta mitään muita rajoituksia, kuin että ne 35 kuuluvat Bacillus-sukuun ja kykenevät tuottamaan pullula- I im i nm m m : * 7 95481 naasia, jonka pH-optimi on 9,5 - 11. Tyypillisenä esimerkkinä esitetään alkalofiilinen mikro-organismi, Bacillus sp. KSM-AP1876, jonka kyseiset keksijät löysivät maaperästä alueella Yokahama-shi, Kanagawa-ken, Japani.
5 Seuraavaksi käsitellään Bacillus sp. KSM-AP1876:n, joka on yksi tämän keksinnön mukaisista mikro-organismeista, mykologisia ominaispiirteitä. Kannan luokittelemiseksi käytetään seuraavia, 21 eri lajia edustavia kasvualustoja (kasvualustat 1 - 21). Ne kaikki sisältävät 0,5 10 paino-% steriloitua natriumkarbonaattia (Na2C03).
Käytettyjen kasvualustojen koostumukset (paino-%):
Kasvualusta 1: ravinneliemi, 0,8; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical Co.), 1,5.
Kasvualusta 2: ravinneliemi, 0,8.
15 Kasvualusta 3: ravinneliemi, 0,8; gelatiini, 20,0; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5.
Kasvualusta 4: Bacto-lakmusmaito, 10,5.
Kasvualusta 5: ravinneliemi, 0,8; KN03, 0,1.
Kasvualusta 6: Bacto-peptoni, 0,7; NaCl, 0,5; glu-20 koosi, 0,5.
Kasvualusta 7: SIM-agar-alusta (valmistaja Eiken
Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 8: TSI-agar (valmistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
25 Kasvualusta 9: hiivauute, 0,5; Bacto-peptoni, 1,5; K2HP04, 0,1; MgS04.7H20, 0,02; liukoinen tärkkelys, 2,0; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemicals), 1,5.
Kasvualusta 10: Koserin kasvualusta (valmistaja
Eiken Kagaku), merkitty määrä.
30 Kasvualusta 11: Christensenin kasvualusta (valmis taja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 12: kasvualusta, joka sisältää seuraa-vat koostumukset (1) ja (2), joihin lisätään typpilähtei-tä, jotka koostuvat natriumnitraatista, natriumnitriitis-35 tä, ammoniumkloridista ja ammoniumfosfaatista vastaavasti 8 95481 määrinä 0,25 %, 0,2025 %, 0,158 % ja 0,195 % kasvualustassa; (1) hiivauute, 0,05; Na2S04, 0,1; KH2P04, 0,1; glukoosi , 1,0.
5 (2) hiivauute, 0,05; Na2S04, 0,1; KH2P04, 0,1; glukoosi, 1,0; CaCl2.2H20 , 0 , 05; MnS04.4-6H20, 0,01;
FeS04.7H20, 0,001; MgS04.7H20, 0,02.
Kasvualusta 13: King A -kasvualusta, "Eiken" (valmistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
10 Kasvualusta 14: King B -kasvualusta "Eiken" (val mistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 15: urea-kasvualusta "Eiken" (valmistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 16: sytokromioksidaasikoesuodatinpaperi 15 (valmistaja Nissui Pharmaceutical Co., Ltd).
Kasvualusta 17: vetyperoksidin 3-%:inen vesiliuos. Kasvualusta 18: Bacto-peptoni, 0,5; hiivauute, 0,5; K2HP04, 0,1; glukoosi, 1,0; MgS04.7H20, 0,02.
Kasvualusta 19: Bacto-peptoni, 2,7; NaCl, 5,5; 20 K2HP04, 0,3; glukoosi, 0,5; bromitymolisininen, 0,06; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5.
Kasvualusta 20: (NH4)2HP04, 0,1; KC1, 0,02;
MgS04.7H20, 0,02; hiivauute, 0,05; sokeri, 1,0.
Kasvualusta 21: kaseiini, 0,5; hiivauute, 0,5; 25 glukoosi, 1,0; K2HP04, 0,1; MgS04.7H20, 0,02; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5.
Mykologiset ominaisuudet (1) Tarkastelu mikroskoopissa
Solut ovat sauvoja, joiden koko on 1,0 - 2,2 mikro-30 m x 2,2 - 4,4 mikro-m, jolloin lähelle niiden päätä muodostuu ellipsin muotoinen bakteerinsisäinen itiö (0,8 - 1,0 mikro-m x 1,0 - 1,8 mikro-m). Niillä on värekarva ja ne ovat liikkuvia. Gram-värjäys on positiivinen. Happokestävyys: negatiivinen.
9 95481 (2) Kasvu eri kasvualustoissa (a) Ravinneliemi-agar-malja (kasvualusta 1)
Solut kasvavat hyvin. Pesäke on ympyrän muotoinen, ja sen pinta on tasainen ja sen äärialueet ovat sileät tai 5 aaltoilevat. Pesäke on väriltään maitomainen, puolittain läpinäkyvä ja kiiltävä.
(b) Ravinneliemi-agar-vinopintaviljelmä (kasvualusta 1)
Solut kykenevät kasvamaan. Pesäke on viuhkan muo-10 toinen, ja väriltään kiiltävän maitomainen sekä puolittain läpinäkyvä.
(c) Nestemäinen ravinneliemi (kasvualusta 2)
Solut kykenevät kasvamaan.
(d) Pistoviljelmä ravinneliemigelatiinissa (kasvu- 15 alusta 3)
Solut kasvavat hyvin. Gelatiinin nesteytymistä havaittavissa.
(e) Lakmus-maitokasvualusta (kasvualusta 4)
Maidon koaguloitumista tai peptonisaatiota ei ha- 20 väitä. Lakmusvärjäytymistä ei voida määrittää, koska kasvualusta on alkalinen.
(3) Fysiologiset ominaisuudet (a) Nitraatin pelkistys ja denitrifikaatio (kasvualusta 5) 25 Nitraatin pelkistys: positiivinen.
• · a
Denitrifikaatio: negatiivinen.
(b) MR-koe (kasvualusta 6)
Ei määritettävissä, koska kasvualusta on alkalinen.
(c) V-P-koe (kasvualusta 6) 30 Negatiivinen.
(d) Indolin tuotanto (kasvualusta 7) t «<
Negatiivinen.
(e) Rikkivedyn tuotanto (kasvualusta 8) Negatiivinen.
35 (f) Tärkkelyksen hydrolyysi (kasvualusta 9)
Positiivinen.
10 95481 (g) Sitruunahapon käyttö (kasvualusta 10, kasvualusta 11)
Negatiivinen Koserin kasvualustassa (kasvualusta 10) ja ei määritettävissä Christensenin kasvualustassa 5 (kasvualusta 11).
(h) Epäorgaanisten typpilähteiden käyttö (kasvualusta 12)
Nitraatti-, nitriitti- ja ammoniumsuolat tulevat kaikki käytetyiksi.
10 (i) Värjääntyminen (kasvualusta 13, kasvualusta 14)
Negatiivinen.
(j) Ureaasi (kasvualusta 15)
Negatiivinen.
(k) Oksidaasi (kasvualusta 16) 15 Ei määritettävissä.
(l) Katalaasi (kasvualusta 17)
Positiivinen.
(m) Kasvualue (kasvualusta 18)
Kasvulämpötila: 20 - 40 °C; 20 optimaalinen kasvulämpötila: 30 - 35 °C; kasvu-pH-alue: 7 - 10,5; optimi-pH: 10.
(n) Käyttäytyminen hapen suhteen Aerobi.
- 25 (o) O-F-koe (kasvualusta 19)
Ei määritettävissä, koska kasvualusta on alkalinen. Solut kykenevät kasvamaan vain aerobisissa olosuhteissa.
(p) Sokerin käyttö (kasvualusta 20) Käytettiin seuraavia sokereita: L-arabinoosi, D- 30 ksyloosi, D-glukoosi, D-mannoosi, D-fruktoosi, D-galak- .· toosi, maltoosi, sakkaroosi, laktoosi, trehaloosi, D-sor- « · bitoli, D-mannitoli, glyseroli, tärkkelys, salisiini, D-riboosi ja dekstriini.
(q) Kasvu natriumsuolaa sisältävässä kasvualustassa 35 (muunnos kasvualustasta 1) !i na i im 1.1 ! lii 11 95481
Solut kykenevät kasvamaan 5 %:n natriumkloridia läsnäollessa, mutta eivät 7 %:n natriumkloridia läsnäollessa.
(r) Kaseiinin hydrolyysi (kasvualusta 21) 5 Posiitiivinen.
Edeltävien mykologisten ominaispiirteiden nojalla esillä olevan keksinnön mukaista kantaa verrattiin julkaisuihin Bergeyn käsikirjaan "Determinative Bacteriology", osa 8, ja maatalousalan käsikirjaan "The Genus Bacillus", 10 Ruth, E. Gordon, n:o 427, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture Washington, D.C., 1973, ja se määritettiin Bacillus-sukuun, askosporisauvat, kuuluvaksi mikro-organismiksi. Kanta ei kasva neutraalilla alueella, mutta kykenee enimmäkseen kasvamaan hyvin alka-15 lisella alueella. Tämän seikan nojalla esillä olevan keksinnön mukainen kanta luokitellaan alkalofiiliseksi mikro-organismiksi, jonka tunnistivat Horikoshi ja Akiba, "Alka-lophilic Microorganism", Japan Scientific Society Press, Tokio, 1982. Esillä olevan keksinnön mukainen kanta eroaa 20 ryhmästä Bacillus-sukuun kuuluvia mikro-organismeja, jotka kykenevät kasvamaan neutraalilla alueella.
Esillä olevan keksinnön mukaisella kannalla on edeltävien ominaispiirteiden ohella mykologisia ominaispiirteitä, jotka poikkeavat minkään tunnetun alkalofiili-25 sen Bacilluksen ominaispiirteistä. Täten esillä olevan • · keksinnön mukainen kanta määriteltiin uudeksi kannaksi, ja nimettiin Bacillus sp. KSM-AP1876:ksi, joka talletettiin talletuslaitokseen the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, nimellä FERM 30 P-10887.
Esillä olevan keksinnön mukaista alkalista pullu-lanaasia voidaan tuottaa siirrostamalla esillä olevan keksinnön mukaisia mikro-organismeja ja viljelemällä niitä sitten tavanomaisten viljelymenetelmien mukaan. Edullises-35 ti kasvualustaan sisällytetään sopiva määrä hiili- ja typ- 12 95481 pilähteitä, joita mikro-organismi kykenee käyttämään. Hii li- ja typpilähteille ei aseteta mitään spesifisiä rajoituksia. Typpilähteinä mainittakoon orgaaniset typpilähteet kuten maissigluteenijauho, soijajauho, maissinliotusvesi, 5 kasaminohappo, hiivauute, farma-alusta, lihauute, tryp-toni, soitoni, hypro, "ajipower", soijajauho, puuvillan-siemenjauho, kultivaattori, ajipron, sitruunan kuoret ja vastaavat; ja epäorgaaniset typpilähteet kuten ammonium-sulfaatti, ammoniumnitraatti, ammoniumfosfaatti, ammonium-10 karbonaatti, natriumnitraatti, ammoniumasetaatti ja vastaavat. Esimerkkeinä hiililähteistä esitetään liukoinen tärkkelys, ei-liukoinen tärkkelys, amylopektiini, glyko-geeni, pullulaani, sekä näiden osittain hajotessa muodostuneet haarautuneet oligomeerit, ja käyttökelpoisia hiili-15 lähteitä ovat glukoosi, maltoosi, arabinoosi, ksyloosi, riboosi, mannoosi, fruktoosi, galaktoosi, sakkaroosi, laktoosi, trehaloosi, mannitoli, sorbitoli, glyseroli ja käyttökelpoiset orgaaniset hapot kuten etikkahappo ja vastaavat. Näiden hiili- ja typpilähteiden ohella kasvualus-20 taan voidaan lisätä tarpeen mukaan epäorgaanisia ioneja kuten fosfaatteja, magnesiumia, kalsiumia, mangaania, sinkkiä, kobolttia, natriumia, kaliumia ja vastaavia, muita orgaanisia tai epäorgaanisia mikroravinteita.
Esillä olevan keksinnön mukaista alkalista pullu- .. 25 lanaasia voidaan valmistaa viljelyliemestä käyttäen ta vanomaisia, yleisesti entsyymeille sopivia talteenotto- ja puhdistusmenetelmiä. Spesifisesti solut erotetaan viljely-liemestä käyttäen tavanomaisia kiinteä-neste-erotusmene-telmiä, joita ovat esimerkiksi sentrifugointi, suodatus, 30 tai vastaavat, raakaentsyymiliemen saamiseksi. Vaikka on • ‘ ' mahdollista käyttää näin saatua raakaentsyymilientä sei- • · .
laisenaan, entsyymejä voidaan niinikään käyttää puhdistettuina tarpeen mukaan suorittamalla erotus käyttäen erilaisia erotusmenetelmiä, joita ovat esim. suolaus, saostus, 35 ultrasuodatus, ja vastaavat, raakaentsyymin saamiseksi, 95481 13 minkä jälkeen tämä puhdistetaan ja kiteytetään tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Sopivia puhdistusmenetelmiä ovat esimerkiksi DEAE-selluloosa- (valmistaja Whatman Co.) adsorptio, DEAE-selluloosakromatografia, Sephacryl- (valmis-5 taja Pharmacia Co. ) kromatografia, DEAE Toyopeal - (valmistaja Tosoh) kromatografia ja butyyli-Toyopeal-kromato-grafia.
Seuraavaksi käsitellään uuden entsyymin, tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin, entsymologisia 10 ominaispiirteitä. Entsyymiaktiivisuudet mitattiin käyttäen seuraavia puskuriliuoksia (pitoisuus 50 mM kussakin) alla selostetun menetelmän mukaan.
Puskuriliuokset: pH 4 - 6: asetaattipuskuri 15 pH 6 - 8: fosfaattipuskuri pH 8 - 11: glysiini-NaCl-NaOH-puskuri pH 11 - 12: KCl-NaOH-puskuri.
Entsyymiaktiivisuuden mittaus: 0,1 ml entsyymiliuosta lisättiin 0,9 ml:aan kutakin 20 substraattiliuosta, joka koostui kulloisestakin pullulaa-nia sisältävästä (loppupitoisuus reaktiosysteemissä: 0,25 % w/v) puskuriliuoksesta, ja seoksen annettiin reagoida 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Reaktion jälkeen määritettiin kvantitatiivisesti pelkistävät sokerit käyttäen 3,5-dinit-25 rosalisyylihappo- (DNS-) menettelyä. Spesifisesti 1,0 ml DNS-reagenssia lisättiin 1,0 ml:aan reaktioseosta, joka kuumennettiin sitten 100 °C:seen värin kehittämiseksi. Seoksen jäähdyttyä siihen lisättiin 4,0 ml deionisoitua vettä. Tällä seoksella suoritettiin kolorimetrinen kvanti-30 tatiivinen analyysi 535 nm:n aallonpituudella. Entsyymiaktiivisuuden yhdeksi yksiköksi (1 U) määriteltiin se määrä entsyymiä, joka vapautti yhden mikromoolin (1 mikro-m) pelkistävää sokeria kuten glukoosia minuutissa vakiomääri-tysolosuhteissa.
14 95481
Epäpuhtaan alkalisen pullulanaasln entsymologinen karakterisointi (1) Vaikutus
Entsyymi hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia 5 tuottaen maltotrioosia, ja kuten esitetty taulukossa 1, hydrolysoi tärkkelyksen, amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten hajoamistuotteiden, alfa-1,6-glykosi-disidoksia.
Taulukko 1 10 Substraatti Pitoisuus Suhteellinen aktiivisuus (%) pullulaani 1 x 10'5 100 glykogeeni (osteri-) 1 x 10'6 1 glykogeeni (kaniininmaksa-) 1 x 10'6 6 15 amylopektiini 1 x 10'8 55 (2) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue
Sen aktiivinen pH-alue on 4 - 12, ja optimi-pH-alue on 9,5 - 11, ja se säilyttää 50 %:n tai sitä korkeamman 20 suhteellisen aktiivisuuden optimi-pH-alueella, myös pH:ssa 8,5 - 11,5.
Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitattiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 25 10 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 7 - 8), glysii- ni-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 10,5) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12).
Kunkin reaktion annettiin kestää 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tulokset on esitetty kuviossa 1.
(3) Stabiilisuus pH:n suhteen 30 Entsyymi on stabiili pH-alueella 7 - 10 ja se säi- .· ' lyttää 50 %:n tai sitä korkeamman suhteellisen aktiivisuu- • · ' den optimi-pH-alueella, myös pH:ssa 6 - 11,5.
Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitattiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) 35 pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 10 15 95481 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 7 - 8), glysiini-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 10,5) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12). Kunkin reaktion annettiin kestää 45 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tulokset on esitetty kuviossa 2.
5 (4) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Entsyymi toimii laajalla lämpötila-alueella 10 -60 °C, ja optimilämpötila on 55 °C (katso kuvio 3).
(5) Stabiilisuus lämmön suhteen
Mitattiin entsyymin jäämäaktiivisuus, sen jälkeen 10 kun sitä oli käsitelty lämmöllä eri lämpötiloissa 30 minuutin ajan glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5). Tämän keksinnön mukainen entsyymi menettää aktiivisuuttaan tuskin lainkaan 45 °C:ssa, ja sen jäämäaktiivisuus on noin 50 % jopa 52 °C:ssa (katso kuvio 4).
15 (6) Molekyylipaino
Esillä olevan keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino mitattiin käyttäen geelisuodatusmenetelmää ja valmistetta Bio-gel A 0,5m. Tämän keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino on noin 110 000 +/- 10 000.
20 (7) Metalli-ionien vaikutus
Hg21-, Pb21- ja Cd2+-ionien (kutakin 1 mM) lisäyksellä on kielteinen vaikutus ja Mn2+-ionien (1 mM) lisäyksellä on lievä kielteinen vaikutus.
(8) Pinta-aktiivisten aineiden vaikutukset 25 Pinta-aktiivisia aineita, kuten lineaarinen alkyy- libentseenisulfonaatti (LAS), natriumalkyylisulfaatti (AS), natriumpolyoksietyleenialkyylisulfaatti (ES), nat-rium-alfa-olefiinisulfonaatti (AOS), natrium-alfa-sulfo-noitu rasvahappoesteri (alfa-SFE), natriumalkyylisulfo-30 naatti (SAS), natriumdodesyylisulfaatti (SDS), saippuat ja • softanoli, testattiin 0,05 paino-%:n pitoisuutena 40 °C:ssa 15 minuutin ajan, jolloin varmistui, ettei näillä ollut mitään kielteisiä vaikutuksia entsymaattisiin aktiivisuuksiin .
1β 95481
Id (9) Kelatoivien aineiden vaikutus
Kelatoivilla aineilla, kuten EDTA (10 mM), EGTA
(10 mM), sitruunahappo (0,05 paino-%) ja zeoliitti (0,05 paino-%), ei ollut kielteisiä vaikutuksia entsyymiaktiivi-5 suuksiin.
(10) Proteaasin vastustuskyky
Aktiivisuuksia mitattiin alkalisen proteaasin, kuten API-21:n (Showa Denko), Maxatase (IBIS) ja Sabinase, Alkalase ja Esperase (Novo), läsnäollessa määränä 0,2 10 AU/litra, jolloin varmistui, että tämän keksinnön mukai sella entsyymillä oli hyvä vastustuskyky kaikkia näitä proteaaseja vastaan.
Puhdistetun alkalisen pullulanaasin Z-l entsymolo-giset ominaisuudet 15 (1) Vaikutus
Entsyymi hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia tuottaen maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, amy-lopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten hajoamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia.
20 (2) Substraattispesifisyys
Entsyymillä on hydrolyyttistä aktiivisuutta sellaisten sokereiden alfa-1,6-glykosidisidoksen suhteen, joiden polymerisaatioaste on korkeampi kuin maltoosin, kuten esitetty taulukossa 2.
• · 1 ?l itl-i i t -ι-at i k • · 17 95481
Taulukko 2
Substraatti Pitoisuus Suhteellinen (M) aktiivisuus (%) pullulaani 1 x 10'5 100 5 glykogeeni (osteri-) 1 x 10'6 0,2 glykogeeni (kaniininmaksa-) 1 x 10‘6 0,0 amylopektiini 1 x 10'8 6,1 amyloosi 1 x 10'8 0,0 maltoosi 1 x 10'2 0,0 10 maltotrioosi 1 x 10*2 0,0 panoosi 1 x 10‘2 0,0 isomaltoosi 1 x 10"2 0,0 isomaltotrioosi 1 x 10‘2 0,0 gentiobioosi 1 x 10"2 0,0 15 (3) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue
Entsyymin aktiivinen pH-alue on 5 - 11, ja optimi-pH-alue on 9,5 - 11.
Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitat-20 tiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 10 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 6 - 8,5), glysiini-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 11) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12). Kunkin reaktion annettiin kestää 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tu-25 lokset on esitetty kuviossa 5.
(4) Stabiilisuus pH:n suhteen
Entsyymi on stabiili pH-alueella 8 - 10 ja se säilyttää 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden optimi-pH-alueella, myös pH-alueella 7 - 10,5.
30 Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitat tiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 10 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 6 - 8,5), glysiini-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 11) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12). Kunkin 18 95481 reaktion annettiin kestää 45 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tulokset on esitetty kuviossa 6.
(5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Entsyymi on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 5 10-60 °C, ja optimilämpötila on 50 °C (katso kuvio 7).
(6) Stabiilisuus lämmön suhteen
Mitattiin entsyymin jäämäaktiivisuus, sen jälkeen kun sitä oli käsitelty lämmöllä eri lämpötiloissa 30 minuutin ajan glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5). Tämän 10 keksinnön mukainen entsyymi menettää aktiivisuuttaan tuskin lainkaan 40 °C:ssa, ja sen jäämäaktiivisuus on noin 50 % jopa 50 °C:ssa (katso kuvio 8).
(7) Molekyylipaino
Esillä olevan keksinnön mukaisen entsyymin mole-15 kyylipaino mitattiin käyttäen SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia (7,5-%:inen geeli). Tämän keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino on noin 120 000 +/- 5 000.
(8) Metalli-ionien vaikutus
Hg2*-, Cd2*- ja Mn2*-ionien (kutakin 1 mM) lisäyksel-20 lä on kielteinen vaikutus ja Pb2*-ionien (1 mM) lisäyksellä on lievä kielteinen vaikutus.
(9) Pinta-aktiivisten aineiden vaikutukset
Pinta-aktiivisia aineita, kuten lineaarinen alkyy- libentseenisulfonaatti (LAS), natriumalkyylisulfaatti . 25 (AS), natriumpolyoksietyleenialkyylisulfaatti (ES), nat- rium-alfa-olefiinisulfonaatti (AOS), natrium-alfa-sulfo-noitu rasvahappoesteri (alfa-SFE), natriumalkyylisulfo-naatti (SAS), natriumdodesyylisulfaatti (SDS), saippuat ja softanoli, testattiin 0,05 paino-%:n pitoisuutena 40 °C:ssa 30 15 minuutin ajan, jolloin varmistui, ettei näillä ollut mitään kielteisiä vaikutuksia entsymaattisiin aktiivisuuksiin.
(10) Kelatoivien aineiden vaikutus
Kelatoivilla aineilla, kuten EDTA (10 mM), EGTA (10 35 mM), sitruunahappo (0,05 paino-%) ja zeoliitti (0,05 pai- 19 95481 no-%), ei ollut kielteisiä vaikutuksia entsyymiaktiivisuuksiin.
(11) Proteaasin vastustuskyky
Aktiivisuuksia mitattiin alkalisen proteaasin, 5 esimerkiksi API-21:n (Showa Denko), Maxatase (IBIS), Sa-binase, Alkalase ja Esperase (Novo), läsnäollessa määränä 0,2 AU/litra, jolloin varmistui, että tämän keksinnön mukaisella entsyymillä oli hyvä vastustuskyky kaikkia näitä proteaaseja vastaan.
10 Esillä olevan keksinnön mukaisen alkalisen pullu- lanaasin optimi-pH-alue (pH 9,5 - 11) on korkeampi kuin tavanomaisten aikalisien pullulanaasien ja se osoittaa erinomaista stabiilisuutta laajemmalla pH-alueella. Sen optimilämpötila on yli 50 °C ja se on lämmön suhteen sta-15 biili aina 40 °C:seen saakka. Edelleen esillä olevan keksinnön mukaisella alkalisella pullulanaasilla on voimakas vastustuskyky lähes kaikkia pesuaine-ainesosia vastaan, kuten pinta-aktiivisia aineita, kelatoivia aineita, pesuaineproteaaseja ja vastaavia vastaan. Täten esillä 20 olevan keksinnön mukaista entsyymiä voidaan edullisesti käyttää pesuaine-ainesosana. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaista entsyymiä voidaan käyttää monenlaisten oligosakkaridien tuottamiseksi ja myös yhdessä alfa-amy-laasin kanssa erilaisten monosakkaridien tuottamiseksi.
25 Esillä olevan keksinnön mukaisella entsyymillä on täten huomattavaa merkitystä teollisilla aloilla.
Keksinnön muita ominaispiirteitä ilmenee seuraa-vista mallisuoritusmuotojen kuvauksista, jotka esitetään keksinnön havainnollistamiseksi ja joiden tarkoituksena ei 30 ole sen rajaaminen.
Esimerkki 1
Lusikallinen maata (noin 0,5 g) seudulta Yoko-hamashi, Kanagawa-ken, Japani, lietettiin steriloituun suolaliuokseen, minkä jälkeen seosta käsiteltiin lämmöllä 35 80 °C:ssa 15 minuutin ajan. Lämmöllä käsitellystä seoksesta 20 95481 saatua supernatanttia laimennettiin sopivasti, minkä jälkeen se panostettiin eristys-agar-kasvualustaan (kasvualusta A) ja viljeltiin 30 °C:ssa 3 päivän ajan pesäkkeiden kasvattamiseksi. Pesäkkeet, jotka muodostivat läpinä-5 kyviä vyöhykkeitä äärialueilleen pullulaanin liukenemisen johdosta, otettiin talteen pullulanaasia tuottavien kantojen saamiseksi. Näitä kantoja siirrostettiin nestemäiseen kasvualustaan B ja ravistelukasvatettiin 30 °C:ssa 3 päivän ajan. Viljelyn päätyttyä viljelyliemi sentrifugoi-10 tiin supernatantin erottamiseksi. Supernatantin pullula-naasiaktiivisuus mitattiin pH:ssa 10 alkalista pullulanaasia tuottavien kantojen valitsemiseksi. Näin saatiin kanta Bacillus sp. KSM-AP1876 (FERM P 10887).
15 paino-%
Kasvualusta A: pullulaani 0,8 värillinen pullulaani 0,2 polypeptoni 0,2 hiivauute 0,1 20 KH2P04 0,03 ( nh4 ) 2S04 0,1
MgS04.7H20 0,02
CaCl2.2H20 0,02
FeS04.7H20 0,001 25 MnCl2.4H20 0,0001 • · agar 1,5 il nrr m» m « m i 21 95481
Na2C03___O, 5 pH: 10,0 paino-%
Kasvualusta B: pullulaani 1,0 5 tryptoni 0,2 hiivauute 0,1 KH2P04 0,03 (NH4)2S04 0,1
MgS04.7H20 0,02 10 CaCl2.2H20 0,02
FeS04.7H20 0,001
MnCl2.4H20 0,0001
Na2C03 _0^_5_ pH: 10,0 15
Esimerkki 2
Alkalista pullulanaasia tuottavaa kantaa Bacillus sp. KSM-AP1876 siirrostettiin esimerkin 1 mukaiseen nestemäiseen kasvualustaan B, ja ravistelukasvatettiin 20 30 °C:ssa 3 päivän ajan. Viljelyn päätyttyä solut poistet tiin sentrifugoimalla raakapullulanaasivalmisteen saamiseksi. Raakaentsyymiä käsiteltiin tavanomaisen menetelmän mukaan etanoli-kuivajauheen valmistamiseksi. Tulokseksi saadun pullulanaasientsyymin tuotannosta varmistuttiin 25 kuten esitetty taulukossa 3. Entsyymiaktiivisuus mitattiin pH:ssa 9.
Taulukko 3
Kanta Enstyymimäärä litrassa Entsyymin 30 kasvualustaa (g) aktiivisuus (U/g) KSM-AP1876 0,2 1,870 ψ ·
Esimerkki 3
Alkalista pullulanaasia tuottavaa kantaa Bacillus 35 sp. KSM-AP1876 siirrostettiin kasvualustaan, jonka koos- 22 95481 tumus oli sama kuin esimerkin 1 mukaisen nestemäisen kasvualustan B, lukuun ottamatta, että pullulaanin asemesta lisättiin 1 % maltoosia ja ravistelukasvatettiin 30 °C:ssa 2-3 päivän ajan. Viljelmä sentrifugoitiin ja supernatan-5 tista mitattiin pullulanaasiaktiivisuus, joksi saatiin 211 U/litra viljelylientä.
Esimerkki 4
Esimerkissä 2 valmistettuun raakaentsyymiin lisättiin DEAE-selluloosajauhetta, ja raakaentsyymin sisältämä 10 pullulanaasi adsorboitiin täysin DEAE-selluloosaan. Hartsi pestiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8), minkä jälkeen entsyymi eluoitiin käyttäen 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8), joka sisälsi pitoisuuden 0,6 M natriumkloridia.
10 mM Tris-HCl-puskurierää, johon entsyymi eluoitiin, 15 dialysoitiin puskurin konsentroimiseksi. Sitten entsyymi adsorboitiin DEAE-selluloosa-DE52-hartsiin, jota tasapai-noitettiin puskurilla ja eluoitiin 10 mM Tris-HCl-pusku-rilla (pH 8), joka sisälsi natriumkloridigradientin 0 -1 M, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Aktiiviset 20 fraktiot konsentroitiin käyttäen ultrasuodatuskalvoa (erotuskyky 10 kDa), minkä jälkeen niitä dialysoitiin yön yli 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8) vastaan, joka käsitti pitoisuuden 0,1 M natriumkloridia. Kun eluaattia oli konsentroitu ja dialysoitu, se adsorboitiin Sephacryl S-200 -ko-. 25 lonniin, jota tasapainoitettiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8), joka käsitti pitoisuuden 0,1 M natriumkloridia. Entsyymi eluoitiin 10 mM Tris-HCl-puskuriin, joka käsitti pitoisuuden 0,1 M natriumkloridia, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi, jotka sitten adsorboitiin DEAE Toyopeal 650S 30 -kolonniin. Adsorboitu entsyymi eluoitiin käyttäen 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8), joka käsitti natriumkloridigradientin 0 - 1 M, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Aktiiviset fraktiot konsentroitiin ultrasuodatuskalvoa käyttäen, minkä jälkeen ne adsorboitiin butyyli-Toyopeal 35 650S -kolonniin, jota tasapainoitettiin 10 mM Tris-HCl- 23 95481 puskurilla, joka käsitti pitoisuuden 2 M ammoniumsulfaat-tia. Kolonnia eluoitiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8), joka käsitti anunoniumsulfaattigradientin 2 - 0 M, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Aktiivisia fraktioita 5 konsentroitiin ultrasuodatuskalvoa käyttäen ja dialysoi-tiin yön yli 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8) vastaan puhtaan alkalinen pullulanaasi Z-l -entsyymin saamiseksi. Puhdistetulla entsyymillä suoritettiin polyakryyliamidi-geelielektroforeesiajo (geelin pitoisuus: 15 %) Davisin 10 menetelmän mukaan (Davis, D.J., Ann.N.Y. Acad.Sci. 121 (1964) 404), minkä jälkeen ajotulos värjättiin Coomassie Brilliant Blue -värillä sen varmistamiseksi, että entsyymi antoi vain yhden nauhan (katso kuvio 9). Aktiivisen entsyymin saanto oli noin 4 %.
15 Esimerkki 5
Esimerkissä 4 saadulla alkalinen pullulanaasi Zl:llä suoritettiin SDS-elektroforeesiajo tavanomaisen menetelmän mukaan, jolloin entsyymin molekyylipainoksi varmistui 120 000 +/- 5 000.
20 Kuten on ilmeistä, edeltävien oppien valossa esillä olevan keksinnön monenlaiset modifikaatiot ja muunnokset ovat mahdollisia. Sen vuoksi tulee huomata, että oheisten patenttivaatimuksien puitteissa keksintö voidaan toteuttaa toisinkin kuin tässä spesifisesti kuvattu. 1 <.
Claims (7)
- 24 95481
- 1. Oleellisesti puhdistettu alkalinen pullulanaasi Z-l, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ent-5 symologiset ominaispiirteet: (1) Vaikutus Se hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia, jolloin muodostuu maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten ha-10 joamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia; (2) Substraattispesifisyys Sillä on hydrolyyttistä aktiivisuutta sellaisten sokereiden alfa-1,6-glykosidisidoksien suhteen, joiden po-lymerisaatioaste on korkeampi kuin maltoosin; 15 (3) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue Sen aktiivinen pH-alue on 5-11, jolloin optimi-pH-alue on 9,5 - 11; (4) Stabiilisuus pH:n suhteen Se on stabiili pH-alueella 8 - 10 ja säilyttää 20 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden op- timi-pH-alueella, myös pH-alueella 7 - 10,5, käsiteltynä 45 °C:ssa 10 minuutin ajan; (5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila Se on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 10 -. 25 60 °C, jolloin optimilämpötila on noin 50 °C; (6) Stabiilisuus lämmön suhteen Se on hyvin stabiili 40 °C:ssa käsiteltynä 30 minuutin ajan 10 mM glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5); (7) Molekyylipaino
- 30 Molekyylipaino on noin 120 000 ± 5 000 mitattuna . elektroforeettisesti natriumdodekyylisulfaattia käyttäen; (8) Metalli-ionien vaikutukset Hg2+-, Cd2+-, Mn21- ja Pb21-ionit vaikuttavat siihen kielteisesti; I Itt.L Ui lii luit „ 98481 (9) Pesuaineiden vaikutus Siihen eivät sanottavasti vaikuta pinta-aktiiviset aineet kuten LAS, AS, ES, AOS, alfa-SFE, SAS, SDS, saippuat ja softanoli; 5 (10) Kelatoivien aineiden vaikutukset EDTA:11a, EGTA:11a, sitruunahapolla ja zeoliitilla ei ole siihen sanottavaa vaikutusta; (11) Vastustuskyky proteaaseja vastaan Se osoittaa voimakasta vastustuskykyä aikalisiä 10 proteaaseja vastaan; ja (12) Se on saatavissa viljelemällä Bacillus sp. KSM-AP1876, joka on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology numereolla FERM BP-3049.
- 2. Alkalista pullulanaasia tuottava mikro-organis mi, tunnettu siitä, että se on nimeltään Bacillus sp. KSM-AP1876 ja on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, numerolla FERM BP-3049.
- 3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen alkali- sen pullulanaasin Z-l tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään Bacillus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia, joka kykenee tuottamaan mainittua alkalista pullulanaasia, minkä jälkeen alkalinen pullulanaasi otetaan 25 talteen kasvualustasta.
- 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä alkali-sen pullulanaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismia nimeltä Bacillus sp. KSM-AP1876, joka on talletettu talletuslaitokseen Fermentation
- 30 Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, numerolla FERM BP-3049; minkä jälkeen alkalinen ' pullulanaasi otetaan talteen kasvualustasta. 95481
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1226211A JPH0659215B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 |
| JP1226210A JPH0387176A (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼ、これを産生する微生物及びアルカリプルラナーゼの製造法 |
| JP22621189 | 1989-08-31 | ||
| JP22621089 | 1989-08-31 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI904277A0 FI904277A0 (fi) | 1990-08-30 |
| FI95481B FI95481B (fi) | 1995-10-31 |
| FI95481C true FI95481C (fi) | 1996-02-12 |
Family
ID=26527056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI904277A FI95481C (fi) | 1989-08-31 | 1990-08-30 | Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5147795A (fi) |
| EP (1) | EP0415397B1 (fi) |
| CA (1) | CA2024194C (fi) |
| DE (1) | DE69013446T2 (fi) |
| DK (1) | DK0415397T3 (fi) |
| ES (1) | ES2065449T3 (fi) |
| FI (1) | FI95481C (fi) |
| HK (1) | HK154695A (fi) |
| NO (1) | NO180642C (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1050579B1 (en) * | 1990-04-05 | 2006-04-26 | Kao Corporation | Detergent composition |
| JPH05236958A (ja) * | 1992-02-28 | 1993-09-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 新規イソアミラーゼ及びその製造法 |
| US6509183B1 (en) * | 1993-02-25 | 2003-01-21 | Kao Corporation | DNA fragment containing gene for alkaline pullulanase |
| CA2316191A1 (en) * | 1997-12-22 | 1999-07-01 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions containing a neopullulanase |
| WO2007022597A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Protech Research Pty Ltd | Extracting and purifying limit dextrinases |
| CN101974543B (zh) * | 2010-08-18 | 2012-05-23 | 江南大学 | 一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用 |
| US10130587B2 (en) | 2011-01-11 | 2018-11-20 | Capsugel Belgium Nv | Hard capsules |
| CA3059529A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| EP4585211A2 (en) | 2017-04-14 | 2025-07-16 | Capsugel Belgium NV | Pullulan capsules |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1517752C3 (de) * | 1966-02-05 | 1974-10-24 | Farbwerke Hoechst Ag, Vormals Meister Lucius & Bruening, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von Pullulanase |
| US3806419A (en) * | 1968-11-13 | 1974-04-23 | Cpc International Inc | Preparing pullulanase enzyme |
| US3963575A (en) * | 1974-02-25 | 1976-06-15 | A. E. Staley Manufacturing Company | Producing pullulanase with organisms having a superior capacity to elaborate pullulanase |
| US4318989A (en) * | 1979-06-07 | 1982-03-09 | Lifeline Products, Inc. | Starch-degrading enzymes from Cladosporium resinae |
| US4734364A (en) * | 1983-05-20 | 1988-03-29 | Miller Brewing Company | Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice |
| JPS60186282A (ja) * | 1984-03-07 | 1985-09-21 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規な耐熱性プルラナ−ゼ |
| US4628031A (en) * | 1984-09-18 | 1986-12-09 | Michigan Biotechnology Institute | Thermostable starch converting enzymes |
| US4612287A (en) * | 1985-05-23 | 1986-09-16 | Cpc International Inc. | Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids |
| US4628028A (en) * | 1985-05-23 | 1986-12-09 | Cpc International Inc. | Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production |
| JPS6336780A (ja) * | 1986-07-31 | 1988-02-17 | Res Dev Corp Of Japan | 新規なプルラン分解酵素およびその製法 |
| JPH062071B2 (ja) * | 1986-08-08 | 1994-01-12 | 新技術事業団 | 糖類の製造法 |
| FI81112C (fi) * | 1986-08-27 | 1990-09-10 | Alko Ab Oy | Amylas av ny typ. |
-
1990
- 1990-08-29 CA CA002024194A patent/CA2024194C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-29 DK DK90116597.7T patent/DK0415397T3/da active
- 1990-08-29 DE DE69013446T patent/DE69013446T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-29 ES ES90116597T patent/ES2065449T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-29 EP EP90116597A patent/EP0415397B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 FI FI904277A patent/FI95481C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-08-30 US US07/575,434 patent/US5147795A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 NO NO903801A patent/NO180642C/no unknown
-
1995
- 1995-09-28 HK HK154695A patent/HK154695A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO903801D0 (no) | 1990-08-30 |
| DK0415397T3 (da) | 1995-04-03 |
| FI904277A0 (fi) | 1990-08-30 |
| CA2024194C (en) | 1999-05-04 |
| EP0415397A1 (en) | 1991-03-06 |
| DE69013446T2 (de) | 1995-05-24 |
| NO903801L (no) | 1991-03-01 |
| HK154695A (en) | 1995-10-06 |
| US5147795A (en) | 1992-09-15 |
| NO180642B (no) | 1997-02-10 |
| FI95481B (fi) | 1995-10-31 |
| NO180642C (no) | 1997-05-21 |
| EP0415397B1 (en) | 1994-10-19 |
| ES2065449T3 (es) | 1995-02-16 |
| CA2024194A1 (en) | 1991-03-01 |
| DE69013446D1 (de) | 1994-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2652871B2 (ja) | アルカリセルラーゼおよびその製造法 | |
| EP0269977B1 (en) | Alkaline cellulases and microorganisms capable of producing same | |
| EP0458162B1 (en) | Proteinase-resistant cellulase, micro-organism producing the same and process for producing the same | |
| JPH01502079A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| EP0495401A1 (en) | Novel alkaline proteinase and process for producing the same | |
| EP1050579B1 (en) | Detergent composition | |
| FI95481C (fi) | Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi | |
| US5147796A (en) | Alkaline pullulanase Y having α-amylase activity | |
| FI95482B (fi) | Uusi emäksinen pullulanaasi Y, jolla on -amylaasiaktiivisuutta, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen valmistamiseksi | |
| WO1993012224A1 (en) | Carboxymethylcellulases and bacillus strains producing same | |
| JPH0630578B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼｋ | |
| JP2676453B2 (ja) | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 | |
| JP3000309B2 (ja) | カルボキシメチルセルラーゼ及びこれを生産する微生物 | |
| JP3000310B2 (ja) | カルボキシメチルセルラーゼ及びこれを生産する微生物 | |
| JP2866460B2 (ja) | 多糖類の糖化方法 | |
| JPH0632606B2 (ja) | 新規微生物 | |
| JPH09206073A (ja) | アルカリα−アミラーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリα−アミラーゼの製造法 | |
| JPH0632612B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼ製造法 | |
| JPH0659215B2 (ja) | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 | |
| JPH0655138B2 (ja) | Ｃｍｃア−ゼ▲ｉ▼ | |
| JPH0655139B2 (ja) | Ｃｍｃア−ゼ▲ｉｉ▼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: KAO CORPORATION |