FI95481B - Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi - Google Patents
Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI95481B FI95481B FI904277A FI904277A FI95481B FI 95481 B FI95481 B FI 95481B FI 904277 A FI904277 A FI 904277A FI 904277 A FI904277 A FI 904277A FI 95481 B FI95481 B FI 95481B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- range
- pullulanase
- medium
- alkaline
- optimum
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
- C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
, 95481
Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi Tämä keksintö koskee uutta alkalista pullulanaasia, 5 tätä alkalista pullulanaasia tuottavaa mikro-organismia ja menetelmää kyseisen alkalisen pullulanaasin tuottamiseksi.
Pullulanaasi on entsyymi, joka hydrolysoi vain pullulaanin alfa-1,6-glykosidisidoksia tuottaen lopulta maltotrioosia. Pullulanaasin löysivät alunperin Aerobacter 10 aerogenes -sukuun kuuluvasta kannasta Bender ja Wallenfels v. 1961 (Biochem.Z. 334 (1961) 79). Vast'ikään on raportoitu erilaisista pullulanaasia tuottamaan kykenevistä mikro-organismeista. Näitä mikro-organismeja ovat esimerkiksi Bacillus sp. (J.Jpn.Soc.Starch Sei. 30 (1983) 200); 15 Bacillus acidopullulyticus (Agric.Biol.Chem. 52 (1984) 2293); Bacillus stearothermophilus (Eur.J.Appi.Microbiol. Biotechnol. 17 (1983) 24); Streptococcus mitis (Biochem.J. 108 (1968) 33); ja Lactobacillus (Denpun Kagaku 28 (1981) 72).
20 Tiedetään, että pullulanaasilla ei ainoastaan ole edeltävää aktiivisuutta pullulaanin suhteen, vaan myös hydrolyyttisiä aktiivisuuksia tärkkelyksen, glykogeenin, amylopektiinin sekä haarautuneiden oligosakkaridien, jotka muodostuvat näiden yhdisteiden osittain hajotessa, alfa-25 1,6-glykosidisidoksien suhteen. Tämän ominaisuuden ansios- • · « ta pullulanaasia kutsutaan "haaraumia katkovaksi entsyymiksi" .
Edelleen on todettu, että yhdistämällä pullulanaasi sekä endo-tyypin amylaasiin että ekso-tyypin amylaasiin 30 tärkkelyksestä voitiin saada runsas saanto glukoosia tai : malto-oligosakkarideja kuten maltoosia, maltotrioosia, maltotetraoosia, maltopentaoosia tai maltoheksaoosia. Tämä ominaisuus on viime aikoina saanut osakseen runsaasti huomiota .
95481 2
On olemassa raportti, jonka mukaan näillä ominaisuuksilla varustettua pullulanaasia käytettiin amylaasiin yhdistettynä lisäaineena astianpesuaineisssa ja pyykinpesuaineissa, jolloin parannettiin merkittävästi pesuaine-5 vaikutusta pääasiassa tärkkelyslikaa vastaan (JP-patent-tihakemus n:o 285 424/1988). Pullulanaasin muitakin käyttöjä näillä aloilla on odotettavissa.
Kuitenkin lähes kaikki luontaisesti esiintyvät pullulanaasit luokitellaan neutraaleiksi tai happamiksi 10 pullulanaaseiksi, joilla on maksimaalista ja stabiilia entsymaattista aktiivisuutta neutraaleissa tai happamissa olosuhteissa. On olemassa vain muutamia aikalisiä tai alkalista ympäristöä sietäviä pullulanaaseja, joiden stabiilisuus on parempi ja jotka osoittavat maksimiaktiivi-15 suutta alkalisella pH-alueella, jolla pyykinpesussa tai astianpesussa toimitaan. Alkalisella pullulanaasilla tarkoitetaan tässä pullulanaasia, jonka pH-optimi on alkalisella alueella. Alkalista ympäristöä sietävällä pullulanaasilla tarkoitetaan pullulanaasia, jonka pH-optimi on 20 neutraalista happamalla alueella, mutta jolla on aktiivisuuteensa optimi-pH:ssa nähden riittävästi aktiivisuutta alkalisellakin alueella samalla kun stabiilisuus pysyy hyvänä. Sanalla "neutraali" tarkoitetaan tässä pH-aluetta 6 - 8 ja sanalla "alkalinen" pH-aluetta ei alle 8.
25 Tähän mennessä ei tunneta yhtään menetelmää sen
« · I
paremmin alkalisten pullulanaasien kuin alkalista ympäristöä sietävien pullulanaasienkaan tuottamiseksi, lukuun ottamatta Horikoshin et ai. raporttia, jossa julkistetaan menetelmä alkalisten pullulanaasien tuottamiseksi vilje-30 lemällä Bacillus-sukuun kuuluvaa alkalofiilistä mikro-or-: ganismia (Biochem.Biophys.Acta 397 (1975) 188), ja JP-pa- tenttijulkaisua n:o 27786/1978.
Horikoshin et ai. pullulanaasi on entsyymi, jonka optimi-pH on alkalisella alueella ja jonka substraatti-35 spesifisyys on laajempi kuin perinteisesti tunnetuilla 3 95481 pullulanaaseilla. Kuitenkin koska sen pH-optimi on heikosti alkalisella alueella pH:ssa 8-9, sitä ei voida käyttää pesuainekoostumuksissa. Lisäksi Horikoshin et ai. menetelmän huonona puolena on entsyymin alhainen tuotto.
5 Tämän tyyppinen menetelmä ei siksi sovellu teolliseen tuotantoon fermentoimalla. Näistä syistä johtuen on ollut toivottavaa saada kehitetyksi pullulanaaseja, joiden pH-optimi on korkeammalla alkalisella alueella.
Astianpesua tai pyykinpesua suoritetaan tavalli-10 sesti laajalla pH-alueella neutraalista hyvin alkaliseen pH:hon. Tämän vuoksi olisi arvokasta löytää ja saada luontaisia mikro-organismeja, jotka tuottavat pullulanaaseja, joiden pH-optimi on hyvin alkalisella alueella ja jotka ovat käyttökelpoisia astianpesu- ja pyykinpesuai- 15 neissa.
Vallitsevan tilanteen valossa esillä olevan keksinnön tekijät suorittivat laajoja tutkimuksia luontaisten mikro-organismien saamiseksi, jotka kykenevät tuottamaan alkalista pullulanaasia, jolloin he tuloksena tote-20 sivat, että uutta alkalista pullulanaasia, jonka pH-opti- mi on hyvin alkalisella alueella pH:ssa 9,5 - 11, voitiin saada viljelemällä Bacillus-sukuun kuuluvaa spesifistä mikro-organismia. Tämä havainto johti esillä olevan keksinnön päätökseen saattamiseen.
25 Täten tämän keksinnön päämäärä on antaa käyttöön • · , uusi alkalinen pullulanaasi, jolla on seuraavat entsymo- logiset ominaisuudet: (1) Vaikutus
Se hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia, jol-30 loin muodostuu maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, : amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten ha- “ joamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia.
(2) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue
Sen aktiivinen pH-alue on 4 - 12, jolloin optimi-35 pH-alue on 9,5 - 11.
. 95481 4 (3) Stabiilisuus pH:n suhteen
Se on stabiili pH-alueella 7 - 10 ja säilyttää 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden op-timi-pH-alueella, myös pH-alueella 6 - 11,5, käsiteltynä 5 45 °C:ssa 10 minuutin ajan.
(4) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Se on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 10 -60 °C, jolloin optimilämpötila on noin 55 °C.
( 5) Stabiilisuus lämmön suhteen 10 Se on hyvin stabiili aina 45 °C:seen asti käsitel tynä 30 minuutin ajan 10 mM glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5).
(6) Molekyylipaino
Molekyylipaino on noin 110 000 +/- 10 000 mitattuna 15 geelisuodatusmenetelmällä valmistetta Bio-gel A 0,5m käyttäen.
Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön uusi puhdistettu alkalinen pullulanaasi Z-l, jolla on seuraavat entsymologiset ominaisuudet: 20 (1) Vaikutus
Se hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia, jolloin muodostuu maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten hajoamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia.
25 (2) Substraattispesifisyys
Sillä on hydrolyyttistä aktiivisuutta sellaisten sokereiden alfa-1,6-glykosidisidoksien suhteen, joiden polymer i saat ioaste on korkeampi kuin maltoosin.
(3) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue 30 Sen aktiivinen pH-alue on 5 - 11, jolloin optimi- .· · pH-alue on 9,5 - 11.
• · (4) Stabiilisuus pH:n suhteen
Se on stabiili pH-alueella 8 - 10 ja säilyttää 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden op- 5 95481 timi-pH-alueella, myös pH-alueella 7 - 10,5, käsiteltynä 45 °C:ssa 10 minuutin ajan.
(5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Se on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 10 -5 60 °C, jolloin optimilämpötila on noin 50 °C.
(6) Stabiilisuus lämmön suhteen
Se on hyvin stabiili 40 °C:ssa käsiteltynä 30 minuutin ajan 10 mM glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5).
(7) Molekyylipaino 10 Molekyylipaino on noin 120 000 +/- 5 000 mitattuna elektroforeettisesti natriumdodesyylisulfaattia käyttäen.
(8) Metalli-ionien vaikutukset
Hg2+-, Cd2+-, Mn2*- ja Pb2+-ionit vaikuttavat siihen kielteisesti.
15 (9) Pesuaineiden vaikutus
Siihen eivät sanottavasti vaikuta pinta-aktiiviset aineet kuten lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (LAS), natriumalkyylisulfaatti (AS), natriumpolyoksiety-leenialkyylisulfaatti (ES), natrium-alfa-olefiinisulfo-20 naatti (AOS), natrium-alfa-sulfonoitu rasvahappoesteri (alfa-SFE), natriumalkyylisulfonaatti (SAS), natriumdode-syylisulfaatti (SDS), saippuat ja softanoli.
(10) Kelatoivien aineiden vaikutukset EDTA:lla, EGTA:11a, sitruunahapolla ja zeoliitilla 25 ei ole siihen sanottavaa vaikutusta.
> · · (11) Vastustuskyky proteaaseja vastaan
Se osoittaa voimakasta vastustuskykyä aikalisiä proteaaseja vastaan.
Esillä olevan keksinnön edelleen seuraava päämäärä 30 on antaa käyttöön Bacillus-sukuun kuuluva mikro-organismi, joka kykenee tuottamaan alkalista pullulanaasia, jolla on * ‘ edeltävät ominaisuudet.
Esillä olevan keksinnön seuraava päämäärä on antaa käyttöön menetelmä alkalisen pullulanaasin tuottamiseksi, 35 Jolla on edeltävät ominaisuudet.
95481 6
Keksinnön muut päämäärät, ominaispiirteet ja edut ilmenevät selvemmin seuraavasta kuvauksesta.
Kuvion 1 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin suhteellinen aktiivisuus 5 reaktio-pH:n funktiona.
Kuvion 2 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin jäämäaktiivisuus pH:n funktiona.
Kuvion 3 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön 10 mukaisen alkalisen pullulanaasin suhteellinen aktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
Kuvion 4 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin jäämäaktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
15 Kuvion 5 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mu kaisen alkalisen pullulanaasin Z-l suhteellinen aktiivisuus reaktio-pH:n funktiona.
Kuvion 6 piirroksessa nähdään tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l jäämäaktiivisuus pH:n 20 funktiona.
Kuvion 7 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l suhteellinen aktiivisuus ieaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
Kuvion 8 piirroksessa on esitetty tämän keksinnön 25 mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l jäämäaktiivisuus reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) funktiona.
Kuvion 9 piirroksessa on esitetty tulokset tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l elektroforeesia josta.
30 Kuvion 10 piirroksessa on esitetty tulokset tämän .· keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin Z-l SDS-elek- troforeesiajosta.
Esillä olevan keksinnön mukaisille mikro-organismeille ei aseteta mitään muita rajoituksia, kuin että ne 35 kuuluvat Bacillus-sukuun ja kykenevät tuottamaan pullula- I IM I I 111 l irtt 7 95481 naasia, jonka pH-optimi on 9,5 - 11. Tyypillisenä esimerkkinä esitetään alkalofiilinen mikro-organismi, Bacillus sp. KSM-AP1876, jonka kyseiset keksijät löysivät maaperästä alueella Yokahama-shi, Kanagawa-ken, Japani.
5 Seuraavaksi käsitellään Bacillus sp. KSM-AP1876:n, joka on yksi tämän keksinnön mukaisista mikro-organismeista, mykologisia ominaispiirteitä. Kannan luokittelemiseksi käytetään seuraavia, 21 eri lajia edustavia kasvualustoja (kasvualustat 1 - 21). Ne kaikki sisältävät 0,5 10 paino-% steriloitua natriumkarbonaattia (Na2C03).
Käytettyjen kasvualustojen koostumukset (paino-%):
Kasvualusta 1: ravinneliemi, 0,8; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical Co.), 1,5.
Kasvualusta 2: ravinneliemi, 0,8.
15 Kasvualusta 3: ravinneliemi, 0,8; gelatiini, 20,0; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5.
Kasvualusta 4: Bacto-lakmusmaito, 10,5.
Kasvualusta 5: ravinneliemi, 0,8; KN03, 0,1.
Kasvualusta 6: Bacto-peptoni, 0,7; NaCl, 0,5; glu-20 koosi, 0,5.
Kasvualusta 7: SIM-agar-alusta (valmistaja Eiken
Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 8: TSI-agar (valmistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
25 Kasvualusta 9: hiivauute, 0,5; Bacto-peptoni, 1,5; K2HP04, 0,1; MgS04.7H20 , 0,02; liukoinen tärkkelys, 2,0; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemicals), 1,5.
Kasvualusta 10: Koserin kasvualusta (valmistaja
Eiken Kagaku), merkitty määrä.
30 Kasvualusta 11: Christensenin kasvualusta (valmis- .· 1 taja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
• ·
Kasvualusta 12: kasvualusta, joka sisältää seuraa-vat koostumukset (1) ja (2), joihin lisätään typpilähtei-tä, jotka koostuvat natriumnitraatista, natriumnitriitis-35 tä, ammoniumkloridista ja ammoniumfosfaatista vastaavasti 95481 8 määrinä 0,25 %, 0,2025 %, 0,158 % ja 0,195 % kasvualustassa; (1) hiivauute, 0,05; Na2S04, 0,1; KH2P04, 0,1; glukoosi , 1,0.
5 (2) hiivauute, 0,05; Na2S04, 0,1; KH2P04, 0,1; glukoosi, 1,0; CaCl2.2H20 , 0 , 05; MnS04.4-6H20, 0,01;
FeS04.7H20, 0,001; MgS04.7H20, 0,02.
Kasvualusta 13: King A -kasvualusta, "Eiken" (valmistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
10 Kasvualusta 14: King B -kasvualusta "Eiken" (val mistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 15: urea-kasvualusta "Eiken" (valmistaja Eiken Kagaku), merkitty määrä.
Kasvualusta 16: sytokromioksidaasikoesuodatinpaperi 15 (valmistaja Nissui Pharmaceutical Co., Ltd).
Kasvualusta 17: vetyperoksidin 3-%:inen vesiliuos. Kasvualusta 18: Bacto-peptoni, 0,5; hiivauute, 0,5; K2HP04, 0,1; glukoosi, 1,0; MgS04.7H20 , 0,02.
Kasvualusta 19: Bacto-peptoni, 2,7; NaCl, 5,5; 20 K2HP04, 0,3; glukoosi, 0,5; bromitymolisininen, 0,06; agar- jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5.
Kasvualusta 20: (NH4)2HP04, 0,1; KC1, 0,02;
MgS04.7H20, 0,02; hiivauute, 0,05; sokeri, 1,0.
Kasvualusta 21: kaseiini, 0,5; hiivauute, 0,5; 25 glukoosi, 1,0; K2HP04, 0,1; MgS04.7H20, 0,02; agar-jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5.
Mykologiset ominaisuudet (1) Tarkastelu mikroskoopissa
Solut ovat sauvoja, joiden koko on 1,0 - 2,2 mikro-30 m x 2,2 - 4,4 mikro-m, jolloin lähelle niiden päätä muo-.* dostuu ellipsin muotoinen bakteerinsisäinen itiö (0,8 - 1,0 mikro-m x 1,0 - 1,8 mikro-m). Niillä on värekarva ja ne ovat liikkuvia. Gram-värjäys on positiivinen. Happokestävyys: negatiivinen.
9 95481 (2) Kasvu eri kasvualustoissa (a) Ravinneliemi-agar-malja (kasvualusta 1)
Solut kasvavat hyvin. Pesäke on ympyrän muotoinen, ja sen pinta on tasainen ja sen äärialueet ovat sileät tai 5 aaltoilevat. Pesäke on väriltään maitomainen, puolittain läpinäkyvä ja kiiltävä.
(b) Ravinneliemi-agar-vinopintaviljelmä (kasvualusta 1)
Solut kykenevät kasvamaan. Pesäke on viuhkan muo-10 toinen, ja väriltään kiiltävän maitomainen sekä puolittain läpinäkyvä.
(c) Nestemäinen ravinneliemi (kasvualusta 2)
Solut kykenevät kasvamaan.
(d) Pistoviljelmä ravinneliemigelatiinissa (kasvu- 15 alusta 3)
Solut kasvavat hyvin. Gelatiinin nesteytymistä havaittavissa.
(e) Lakmus-maitokasvualusta (kasvualusta 4)
Maidon koaguloitumista tai peptonisaatiota ei ha- 20 väitä. Lakmusvärjäytymistä ei voida määrittää, koska kasvualusta on alkalinen.
(3) Fysiologiset ominaisuudet (a) Nitraatin pelkistys ja denitrifikaatio (kasvualusta 5) iti 25 Nitraatin pelkistys: positiivinen.
Denitrifikaatio: negatiivinen.
(b) MR-koe (kasvualusta 6)
Ei määritettävissä, koska kasvualusta on alkalinen.
(c) V-P-koe (kasvualusta 6) 30 Negatiivinen.
: (d) Indolin tuotanto (kasvualusta 7) t «*
Negatiivinen.
(e) Rikkivedyn tuotanto (kasvualusta 8) Negatiivinen.
35 (f) Tärkkelyksen hydrolyysi (kasvualusta 9)
Positiivinen.
95481 10 (g) Sitruunahapon käyttö (kasvualusta 10, kasvualusta 11)
Negatiivinen Koserin kasvualustassa (kasvualusta 10) ja el määritettävissä Chrlstensenin kasvualustassa 5 (kasvualusta 11).
(h) Epäorgaanisten typpilähteiden käyttö (kasvualusta 12)
Nitraatti-, nitriitti- ja anunoniumsuolat tulevat kaikki käytetyiksi.
10 (1) Värjääntyminen (kasvualusta 13, kasvualusta 14)
Negatiivinen.
(j) Ureaasi (kasvualusta 15)
Negatiivinen.
(k) Oksidaasi (kasvualusta 16) 15 Ei määritettävissä.
(l) Katalaasi (kasvualusta 17)
Positiivinen.
(m) Kasvualue (kasvualusta 18)
Kasvulämpötila: 20 - 40 °C; 20 optimaalinen kasvulämpötila: 30 - 35 °C; kasvu-pH-alue: 7 - 10,5; optimi-pH: 10.
(n) Käyttäytyminen hapen suhteen Aerobi.
25 (o) O-F-koe (kasvualusta 19)
Ei määritettävissä, koska kasvualusta on aikaiinen.
Solut kykenevät kasvamaan vain aerobisissa olosuhteissa.
(p) Sokerin käyttö (kasvualusta 20) Käytettiin seuraavia sokereita: L-arabinoosi, D- 30 ksyloosi, D-glukoosi, D-mannoosi, D-fruktoosi, D-galak- .· ' toosi, maltoosi, sakkaroosi, laktoosi, trehaloosi, D-sor- « · bitoli, D-mannitoli, glyseroli, tärkkelys, salisiini, D-riboosi ja dekstriini.
(g) Kasvu natriumsuolaa sisältävässä kasvualustassa 35 (muunnos kasvualustasta 1) !l : M i lii li I I I tl .
11 95481
Solut kykenevät kasvamaan 5 %:n natriumkloridia läsnäollessa, mutta eivät 7 %:n natriumkloridia läsnäollessa .
(r) Kaseiinin hydrolyysi (kasvualusta 21) 5 Posiitiivinen.
Edeltävien mykologisten ominaispiirteiden nojalla esillä olevan keksinnön mukaista kantaa verrattiin julkaisuihin Bergeyn käsikirjaan "Determinative Bacteriology", osa 8, ja maatalousalan käsikirjaan "The Genus Bacillus", 10 Ruth, E. Gordon, n:o 427, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture Washington, D.C., 1973, ja se määritettiin Bacillus-sukuun, askosporisauvat, kuuluvaksi mikro-organismiksi. Kanta ei kasva neutraalilla alueella, mutta kykenee enimmäkseen kasvamaan hyvin alka-15 lisella alueella. Tämän seikan nojalla esillä olevan keksinnön mukainen kanta luokitellaan alkalofiiliseksi mikro-organismiksi, jonka tunnistivat Horikoshi ja Akiba, "Alka-lophilic Microorganism", Japan Scientific Society Press, Tokio, 1982. Esillä olevan keksinnön mukainen kanta eroaa 20 ryhmästä Bacillus-sukuun kuuluvia mikro-organismeja, jotka kykenevät kasvamaan neutraalilla alueella.
Esillä olevan keksinnön mukaisella kannalla on edeltävien ominaispiirteiden ohella mykologisia ominaispiirteitä, jotka poikkeavat minkään tunnetun alkalofiili-25 sen Bacilluksen ominaispiirteistä. Täten esillä olevan keksinnön mukainen kanta määriteltiin uudeksi kannaksi, ja nimettiin Bacillus sp. KSM-AP1876:ksi, joka talletettiin talletuslaitokseen the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, nimellä FERM 30 P-10887.
Esillä olevan keksinnön mukaista alkalista pullu-lanaasia voidaan tuottaa siirrostamalla esillä olevan keksinnön mukaisia mikro-organismeja ja viljelemällä niitä sitten tavanomaisten viljelymenetelmien mukaan. Edullises-35 ti kasvualustaan sisällytetään sopiva määrä hiili- ja typ- 95481 12 pilähteitä, jolta mikro-organismi kykenee käyttämään. Hii li- ja typpilähteille ei aseteta mitään spesifisiä rajoituksia. Typpilähteinä mainittakoon orgaaniset typpilähteet kuten maissigluteenijauho, soijajauho, maissinliotusvesi, 5 kasaminohappo, hiivauute, farma-alusta, lihauute, tryp-toni, soitoni, hypro, "ajipower", soijajauho, puuvillan-siemenjauho, kultivaattori, ajipron, sitruunan kuoret ja vastaavat; ja epäorgaaniset typpilähteet kuten ammonium-sulfaatti, ammoniumnitraatti, ammoniumfosfaatti, ammonium-10 karbonaatti, natriumnitraatti, ammoniumasetaatti ja vastaavat. Esimerkkeinä hiililähteistä esitetään liukoinen tärkkelys, ei-liukoinen tärkkelys, amylopektiini, glyko-geeni, pullulaani, sekä näiden osittain hajotessa muodostuneet haarautuneet oligomeerit, ja käyttökelpoisia hiili-15 lähteitä ovat glukoosi, maltoosi, arabinoosi, ksyloosi, riboosi, mannoosi, fruktoosi, galaktoosi, sakkaroosi, laktoosi, trehaloosi, mannitoli, sorbitoli, glyseroli ja käyttökelpoiset orgaaniset hapot kuten etikkahappo ja vastaavat. Näiden hiili- ja typpilähteiden ohella kasvualus-20 taan voidaan lisätä tarpeen mukaan epäorgaanisia ioneja kuten fosfaatteja, magnesiumia, kalsiumia, mangaania, sinkkiä, kobolttia, natriumia, kaliumia ja vastaavia, muita orgaanisia tai epäorgaanisia mikroravinteita.
Esillä olevan keksinnön mukaista alkalista pullu-.. 25 lanaasia voidaan valmistaa viljelyliemestä käyttäen ta vanomaisia, yleisesti entsyymeille sopivia talteenotto- ja puhdistusmenetelmiä. Spesifisesti solut erotetaan viljely-liemestä käyttäen tavanomaisia kiinteä-neste-erotusmene-telmiä, joita ovat esimerkiksi sentrifugointi, suodatus, 30 tai vastaavat, raakaentsyymiliemen saamiseksi. Vaikka on • ‘ ' mahdollista käyttää näin saatua raakaentsyymilientä sei- laisenaan, entsyymejä voidaan niinikään käyttää puhdistettuina tarpeen mukaan suorittamalla erotus käyttäen erilaisia erotusmenetelmiä, joita ovat esim. suolaus, saostus, 35 ultrasuodatus, ja vastaavat, raakaentsyymin saamiseksi, >1 lU I Hl·ti i t · ϋΐ 13 95481 minkä Jälkeen tämä puhdistetaan Ja kiteytetään tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Sopivia puhdistusmenetelmiä ovat esimerkiksi DEAE-selluloosa- (valmistaja Whatman Co.) adsorptio, DEAE-selluloosakromatografia, Sephacryl- (valmis-5 ta Ja Pharmacia Co.) kromatografia, DEAE Toyopeal - (valmistaja Tosoh) kromatografia Ja butyyli-Toyopeal-kromato-grafia.
Seuraavaksi käsitellään uuden entsyymin, tämän keksinnön mukaisen alkalisen pullulanaasin, entsymologisia 10 ominaispiirteitä. Entsyymiaktiivisuudet mitattiin käyttäen seuraavia puskuriliuoksia (pitoisuus 50 mM kussakin) alla selostetun menetelmän mukaan.
Puskuriliuokset: pH 4 - 6: asetaattipuskuri 15 pH 6 - 8: fosfaattipuskuri pH 8 - 11: glysiini-NaCl-NaOH-puskuri pH 11 - 12: KCl-NaOH-puskuri.
Entsyymiaktiivisuuden mittaus: 0,1 ml entsyymiliuosta lisättiin 0,9 ml:aan kutakin 20 substraattiliuosta, Joka koostui kulloisestakin pullulaa- nia sisältävästä (loppupitoisuus reaktlosysteemissä: 0,25 % w/v) puskuriliuoksesta, Ja seoksen annettiin reagoida 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Reaktion jälkeen määritettiin kvantitatiivisesti pelkistävät sokerit käyttäen 3,5-dinit- .. 25 rosalisyylihappo- (DNS-) menettelyä. Spesifisesti 1,0 ml • · DNS-reagenssia lisättiin 1,0 ml:aan reaktioseosta, joka kuumennettiin sitten 100 °C:seen värin kehittämiseksi. Seoksen jäähdyttyä siihen lisättiin 4,0 ml deionisoitua vettä. Tällä seoksella suoritettiin kolorimetrinen kvanti-30 tatiivinen analyysi 535 nm:n aallonpituudella. Entsyymiaktiivisuuden yhdeksi yksiköksi (1 U) määriteltiin se määrä
• · I
entsyymiä, joka vapautti yhden mikromoolin (1 mikro-m) pelkistävää sokeria kuten glukoosia minuutissa vakiomääri-tysolosuhteissa.
14 95481
Epäpuhtaan alkalisen pullulanaasln entsymologinen karakterisointi (1) Vaikutus
Entsyymi hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia 5 tuottaen maltotrioosia, ja kuten esitetty taulukossa 1, hydrolysoi tärkkelyksen, amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten hajoamistuotteiden, alfa-1,6-glykosi-disidoksia.
Taulukko 1 10 Substraatti Pitoisuus Suhteellinen aktiivisuus (%) pullulaani 1 x 10'5 100 glykogeeni (osteri-) 1 x 10'6 1 glykogeeni (kaniininmaksa-) 1 x 10'6 6 15 amylopektiini 1 x 10‘8 55 (2) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue
Sen aktiivinen pH-alue on 4 - 12, ja optimi-pH-alue on 9,5 - 11, ja se säilyttää 50 %:n tai sitä korkeamman 20 suhteellisen aktiivisuuden optimi-pH-alueella, myös pH:ssa 8,5 - 11,5.
Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitattiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 25 10 mM asetaatti (pH 4-6), fosfaatti (pH 7-8), glysii- ni-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 10,5) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12).
Kunkin reaktion annettiin kestää 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tulokset on esitetty kuviossa 1.
(3) Stabiilisuus pH:n suhteen 30 Entsyymi on stabiili pH-alueella 7 - 10 ja se säi- .* ' lyttää 50 %:n tai sitä korkeamman suhteellisen aktiivisuu- • · · den optimi-pH-alueella, myös pH:ssa 6 - 11,5.
Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitattiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) 35 pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 10 15 95481 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 7 - 8), glysiini-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 10,5) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12). Kunkin reaktion annettiin kestää 45 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tulokset on esitetty kuviossa 2.
5 (4) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Entsyymi toimii laajalla lämpötila-alueella 10 -60 °C, ja optimilämpötila on 55 °C (katso kuvio 3).
(5) Stabiilisuus lämmön suhteen
Mitattiin entsyymin jäämäaktiivisuus, sen jälkeen 10 kun sitä oli käsitelty lämmöllä eri lämpötiloissa 30 minuutin ajan glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5). Tämän keksinnön mukainen entsyymi menettää aktiivisuuttaan tuskin lainkaan 45 °C:ssa, ja sen jäämäaktiivisuus on noin 50 % jopa 52 °C:ssa (katso kuvio 4).
15 (6) Molekyylipaino
Esillä olevan keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino mitattiin käyttäen geelisuodatusmenetelmää ja valmistetta Bio-gel A 0,5m. Tämän keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino on noin 110 000 +/- 10 000.
20 (7) Metalli-ionien vaikutus
Hg21-, Pb21- ja Cd21-ionien (kutakin 1 mM) lisäyksellä on kielteinen vaikutus ja Mn2+-ionien (1 mM) lisäyksellä on lievä kielteinen vaikutus.
(8) Pinta-aktiivisten aineiden vaikutukset 25 Pinta-aktiivisia aineita, kuten lineaarinen alkyy- libentseenisulfonaatti (LAS), natriumalkyylisulfaatti (AS), natriumpolyoksietyleenialkyylisulfaatti (ES), nat- rium-alfa-olefiinisulfonaatti (AOS), natrium-alfa-sulfo-noitu rasvahappoesteri (alfa-SFE), natriumalkyylisulfo- 30 naatti (SAS), natriumdodesyylisulfaatti (SDS), saippuat ja * · softanoli, testattiin 0,05 paino-%:n pitoisuutena 40 °C:ssa • · 15 minuutin ajan, jolloin varmistui, ettei näillä ollut mitään kielteisiä vaikutuksia entsymaattisiin aktiivisuuksiin .
1β 95481
ID
(9) Kelatoivien aineiden vaikutus
Kelatoivilla aineilla, kuten EDTA (10 mM), EGTA
(10 mM), sitruunahappo (0,05 paino-%) ja zeoliitti (0,05 paino-%), ei ollut kielteisiä vaikutuksia entsyymiaktiivi-5 suuksiin.
(10) Proteaasin vastustuskyky
Aktiivisuuksia mitattiin alkalisen proteaasin, kuten API-21:n (Showa Denko), Maxatase (IBIS) ja Sabinase, Alkalase ja Esperase (Novo), läsnäollessa määränä 0,2 10 AU/litra, jolloin varmistui, että tämän keksinnön mukaisella entsyymillä oli hyvä vastustuskyky kaikkia näitä proteaaseja vastaan.
Puhdistetun alkalisen pullulanaasin Z-l entsymolo-giset ominaisuudet 15 (1) Vaikutus
Entsyymi hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia tuottaen maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, amy-lopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten hajoamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia.
20 (2) Substraattispesifisyys
Entsyymillä on hydrolyyttistä aktiivisuutta sellaisten sokereiden alfa-1,6-glykosidisidoksen suhteen, joiden polymerisaatioaste on korkeampi kuin maltoosin, kuten esitetty taulukossa 2.
« ♦ 1 ?l itl-i i t i-at i <· • ♦ 17 95481
Taulukko 2
Substraatti Pitoisuus Suhteellinen (M) aktiivisuus (%) pullulaani 1 x 10‘5 100 5 glykogeeni (osteri-) 1 x 10'6 0,2 glykogeeni (kaniininmaksa-) 1 x 10'6 0,0 amylopektiini 1 x 10'8 6,1 amyloosi 1 x 10'8 0,0 maltoosi 1 x 10"2 0,0 10 maltotrioosi 1 x 10*2 0,0 panoosi 1 x 10‘2 0,0 isomaltoosi 1 x 10"2 0,0 isomaltotrioosi 1 x 10‘2 0,0 gentiobioosi 1 x 10*2 0,0 15 (3) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue
Entsyymin aktiivinen pH-alue on 5 - 11, ja optimi-pH-alue on 9,5 - 11.
Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitat-20 tiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 10 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 6 - 8,5), glysiini-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 11) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12). Kunkin reaktion annettiin kestää 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tu-25 lokset on esitetty kuviossa 5.
(4) Stabiilisuus pH:n suhteen
Entsyymi on stabiili pH-alueella 8 - 10 ja se säilyttää 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden optimi-pH-alueella, myös pH-alueella 7 - 10,5.
30 Pullulanaasiaktiivisuudet eri pH-lukemissa mitat tiin käyttäen reaktiosysteemiä, joka sisälsi 0,25 % (w/v) pullulaania ja puskuriliuosta, joka käsitti pitoisuuden 10 mM asetaatti (pH 4 - 6), fosfaatti (pH 6 - 8,5), glysiini-NaCl-NaOH (pH 8,5 - 11) tai KCl-NaOH (pH 11 - 12). Kunkin 18 95481 reaktion annettiin kestää 45 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tulokset on esitetty kuviossa 6.
(5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
Entsyymi on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 5 10-60 °C, ja optimilämpötila on 50 °C (katso kuvio 7).
(6) Stabiilisuus lämmön suhteen
Mitattiin entsyymin jäämäaktilvisuus, sen jälkeen kun sitä oli käsitelty lämmöllä eri lämpötiloissa 30 minuutin ajan glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5). Tämän 10 keksinnön mukainen entsyymi menettää aktiivisuuttaan tuskin lainkaan 40 °C:ssa, ja sen jäämäaktiivisuus on noin 50 % jopa 50 °C:ssa (katso kuvio 8).
(7) Molekyylipaino
Esillä olevan keksinnön mukaisen entsyymin mole-15 kyylipaino mitattiin käyttäen SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia (7,5-%:inen geeli). Tämän keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino on noin 120 000 +/- 5 000.
(8) Metalli-ionien vaikutus
Hg2*-, Cd2*- ja Mn2*-ionien (kutakin 1 mM) lisäyksel-20 lä on kielteinen vaikutus ja Pb2*-ionien (1 mM) lisäyksellä on lievä kielteinen vaikutus.
(9) Pinta-aktiivisten aineiden vaikutukset Pinta-aktiivisia aineita, kuten lineaarinen alkyy- libentseenisulfonaatti (LAS), natriumalkyylisulfaatti . 25 (AS), natriumpolyoksietyleenialkyylisulfaatti (ES), nat- rium-alfa-olefiinisulfonaatti (AOS), natrium-alfa-sulfo-noitu rasvahappoesteri (alfa-SFE), natriumalkyylisulfo-naatti (SAS), natriumdodesyylisulfaatti (SDS), saippuat ja softanoli, testattiin 0,05 paino-%:n pitoisuutena 40 °C:ssa 30 15 minuutin ajan, jolloin varmistui, ettei näillä ollut mitään kielteisiä vaikutuksia entsymaattisiin aktiivisuuk- • · siin.
(10) Kelatoivien aineiden vaikutus Kelatoivilla aineilla, kuten EDTA (10 mM), EGTA (10 35 mM), sitruunahappo (0,05 paino-%) ja zeoliitti (0,05 pai-
<1 lil t aim I I 1 .ill ; : I
19 95481 no-%), ei ollut kielteisiä vaikutuksia entsyymiaktiivisuuksiin.
(11) Proteaasin vastustuskyky
Aktiivisuuksia mitattiin alkalisen proteaasin, 5 esimerkiksi API-21:n (Showa Denko), Maxatase (IBIS), Sa-binase, Alkalase ja Esperase (Novo), läsnäollessa määränä 0,2 AU/litra, jolloin varmistui, että tämän keksinnön mukaisella entsyymillä oli hyvä vastustuskyky kaikkia näitä proteaaseja vastaan.
10 Esillä olevan keksinnön mukaisen alkalisen pullu- lanaasin opt imi-pH-alue (pH 9,5 - 11) on korkeampi kuin tavanomaisten alkalisten pullulanaasien ja se osoittaa erinomaista stabiilisuutta laajemmalla pH-alueella. Sen optimilämpötila on yli 50 °C ja se on lämmön suhteen sta-15 biili aina 40 °C:seen saakka. Edelleen esillä olevan keksinnön mukaisella alkalisella pullulanaasilla on voimakas vastustuskyky lähes kaikkia pesuaine-ainesosia vastaan, kuten pinta-aktiivisia aineita, kelatoivia aineita, pesuaineproteaaseja ja vastaavia vastaan. Täten esillä 20 olevan keksinnön mukaista entsyymiä voidaan edullisesti käyttää pesuaine-ainesosana. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaista entsyymiä voidaan käyttää monenlaisten oligosakkaridien tuottamiseksi ja myös yhdessä alfa-amy-laasin kanssa erilaisten monosakkaridien tuottamiseksi.
.. 25 Esillä olevan keksinnön mukaisella entsyymillä on täten huomattavaa merkitystä teollisilla aloilla.
Keksinnön muita ominaispiirteitä ilmenee seuraa-vista mallisuoritusmuotojen kuvauksista, jotka esitetään keksinnön havainnollistamiseksi ja joiden tarkoituksena ei 30 ole sen rajaaminen.
' Esimerkki 1
Lusikallinen maata (noin 0,5 g) seudulta Yoko-hamashi, Kanagawa-ken, Japani, lietettiin steriloituun suolaliuokseen, minkä jälkeen seosta käsiteltiin lämmöllä 35 80 °C:ssa 15 minuutin ajan. Lämmöllä käsitellystä seoksesta 95481 20 saatua supernatanttia laimennettiin sopivasti, minkä jälkeen se panostettiin eristys-agar-kasvualustaan (kasvualusta A) ja viljeltiin 30 °C:ssa 3 päivän ajan pesäkkeiden kasvattamiseksi. Pesäkkeet, jotka muodostivat läpinä-5 kyviä vyöhykkeitä äärialueilleen pullulaanin liukenemisen johdosta, otettiin talteen pullulanaasia tuottavien kantojen saamiseksi. Näitä kantoja siirrostettiin nestemäiseen kasvualustaan B ja ravistelukasvatettiin 30 °C:ssa 3 päivän ajan. Viljelyn päätyttyä viljelylleni! sentrifugoi-10 tiin supernatantin erottamiseksi. Supernatantin pullula-naasiaktiivisuus mitattiin pH:ssa 10 alkalista pullulanaasia tuottavien kantojen valitsemiseksi. Näin saatiin kanta Bacillus sp. KSM-AP1876 (FERM P 10887).
15 paino-%
Kasvualusta A: pullulaani 0,8 värillinen pullulaani 0,2 polypeptoni 0,2 hiivauute 0,1 20 KH2P04 0,03 (NH4)2S04 0,1
MgS04.7H20 0,02
CaCl2.2H20 0,02
FeS04.7H20 0,001 25 MnCl2.4H20 0,0001 • 1 agar 1,5 il tir:r nm m t m · i l: 21 95481
Na2C03 _ O, 5 pH: 10,0 paino-%
Kasvualusta B: pullulaani 1,0 5 tryptoni 0,2 hiivauute 0,1 KH2P04 0,03 ( nh4 ) 2S04 0,1
MgS04.7H20 0,02 10 CaCl2.2H20 0,02
FeS04.7H20 0,001
MnCl2.4H20 0,0001
Na2C03 __Oj_5_ pH: 10,0 15
Esimerkki 2
Alkalista pullulanaasia tuottavaa kantaa Bacillus sp. KSM-AP1876 siirrostettiin esimerkin 1 mukaiseen nestemäiseen kasvualustaan B, ja ravistelukasvatettiin 20 30 °C:ssa 3 päivän ajan. Viljelyn päätyttyä solut poistet tiin sentrifugoimalla raakapullulanaasivalmisteen saamiseksi. Raakaentsyymiä käsiteltiin tavanomaisen menetelmän mukaan etanoli-kuivajauheen valmistamiseksi. Tulokseksi saadun pullulanaasientsyymin tuotannosta varmistuttiin 25 kuten esitetty taulukossa 3. Entsyymiaktiivisuus mitattiin pH:ssa 9.
Taulukko 3
Kanta Enstyymimäärä litrassa Entsyymin 30 kasvualustaa (g) aktiivisuus (U/g) KSM-AP1876 0,2 1,870
Esimerkki 3
Alkalista pullulanaasia tuottavaa kantaa Bacillus 35 sp. KSM-AP1876 siirrostettiin kasvualustaan, jonka koos- 95481 22 tumus oli sama kuin esimerkin 1 mukaisen nestemäisen kasvualustan B, lukuun ottamatta, että pullulaanin asemesta lisättiin 1 % maltoosia ja ravistelukasvatettiin 30 °C:ssa 2-3 päivän ajan. Viljelmä sentrifugoitiin ja supernatan-5 tista mitattiin pullulanaasiaktiivisuus, joksi saatiin 211 U/litra viljelylientä.
Esimerkki 4
Esimerkissä 2 valmistettuun raakaentsyymiin lisättiin DEAE-selluloosajauhetta, ja raakaentsyymin sisältämä 10 pullulanaasi adsorboitiin täysin DEAE-selluloosaan. Hartsi pestiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8), minkä jälkeen entsyymi eluoitiin käyttäen 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8), joka sisälsi pitoisuuden 0,6 M natriumkloridia.
10 mM Tris-HCl-puskurierää, johon entsyymi eluoitiin, 15 dialysoitiin puskurin konsentroimiseksi. Sitten entsyymi adsorboitiin DEAE-selluloosa-DE52-hartsiin, jota tasapai-noitettiin puskurilla ja eluoitiin 10 mM Tris-HCl-pusku-rilla (pH 8), joka sisälsi natriumkloridigradientin 0 -1 M, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Aktiiviset 20 fraktiot konsentroitiin käyttäen ultrasuodatuskalvoa (erotuskyky 10 kDa), minkä jälkeen niitä dialysoitiin yön yli 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8) vastaan, joka käsitti pitoisuuden 0,1 M natriumkloridia. Kun eluaattia oli konsentroitu ja dialysoitu, se adsorboitiin Sephacryl S-200 -ko-. 25 lonniin, jota tasapainoitettiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8), joka käsitti pitoisuuden 0,1 M natriumkloridia. Entsyymi eluoitiin 10 mM Tris-HCl-puskuriin, joka käsitti pitoisuuden 0,1 M natriumkloridia, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi, jotka sitten adsorboitiin DEAE Toyopeal 650S 30 -kolonniin. Adsorboitu entsyymi eluoitiin käyttäen 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8), joka käsitti natriumkloridigradientin 0 - 1 M, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Aktiiviset fraktiot konsentroitiin ultrasuodatuskalvoa käyttäen, minkä jälkeen ne adsorboitiin butyyli-Toyopeal 35 650S -kolonniin, jota tasapainoitettiin 10 mM Tris-HCl- 23 95481 puskurilla, joka käsitti pitoisuuden 2 M ammoniumsulfaat-tia. Kolonnia eluoitiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8), joka käsitti ammoniumsulfaattigradientin 2 - 0 M, aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Aktiivisia fraktioita 5 konsentroitiin ultrasuodatuskalvoa käyttäen ja dialysoi-tiin yön yli 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8) vastaan puhtaan alkalinen pullulanaasi Z-l -entsyymin saamiseksi. Puhdistetulla entsyymillä suoritettiin polyakryyliamidi-geelielektroforeesiajo (geelin pitoisuus: 15 %) Davisin 10 menetelmän mukaan (Davis, D.J., Ann.N.Y. Acad.Sci. 121 (1964) 404), minkä jälkeen ajotulos värjättiin Coomassie Brilliant Blue -värillä sen varmistamiseksi, että entsyymi antoi vain yhden nauhan (katso kuvio 9). Aktiivisen entsyymin saanto oli noin 4 %.
15 Esimerkki 5
Esimerkissä 4 saadulla alkalinen pullulanaasi Zl:llä suoritettiin SDS-elektroforeesiajo tavanomaisen menetelmän mukaan, jolloin entsyymin molekyylipainoksi varmistui 120 000 +/- 5 000.
20 Kuten on ilmeistä, edeltävien oppien valossa esillä olevan keksinnön monenlaiset modifikaatiot ja muunnokset ovat mahdollisia. Sen vuoksi tulee huomata, että oheisten patenttivaatimuksien puitteissa keksintö voidaan toteuttaa toisinkin kuin tässä spesifisesti kuvattu.
Claims (4)
1. Oleellisesti puhdistettu alkalinen pullulanaasi Z-l, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ent-5 symologiset ominaispiirteet: (1) Vaikutus Se hydrolysoi pullulaanin alfa-1,6-sidoksia, jolloin muodostuu maltotrioosia, ja hydrolysoi tärkkelyksen, amylopektiinin, glykogeenin, tai niiden osittaisten ha-10 joamistuotteiden, alfa-1,6-glykosidisidoksia; (2) Substraattispesifisyys Sillä on hydrolyyttistä aktiivisuutta sellaisten sokereiden alfa-1,6-glykosidisidoksien suhteen, joiden po-lymerisaatioaste on korkeampi kuin maltoosin; 15 (3) Käyttö-pH- ja optimi-pH-alue Sen aktiivinen pH-alue on 5 - 11, jolloin optimi-pH-alue on 9,5 - 11; (4) Stabiilisuus pH:n suhteen Se on stabiili pH-alueella 8 - 10 ja säilyttää 20 50 %:n tai tätä korkeamman suhteellisen aktiivisuuden op- timi-pH-alueella, myös pH-alueella 7 - 10,5, käsiteltynä 45 °C:ssa 10 minuutin ajan; (5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila Se on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella 10 -. 25 60 °C, jolloin optimilämpötila on noin 50 °C; (6) Stabiilisuus lämmön suhteen Se on hyvin stabiili 40 °C:ssa käsiteltynä 30 minuutin ajan 10 mM glysiini-NaCl-NaOH-puskurissa (pH 9,5); (7) Molekyylipaino
30 Molekyylipaino on noin 120 000 ± 5 000 mitattuna . elektroforeettisesti natriumdodekyylisulfaattia käyttäen; • · '' (8) Metalli-ionien vaikutukset Hgz+-, Cd2+-, Mn2*- ja Pb2*-ionit vaikuttavat siihen kielteisesti; I IUi Ui li! i t 4 el 25 95481 (9) Pesuaineiden vaikutus Siihen eivät sanottavasti vaikuta pinta-aktiiviset aineet kuten LAS, AS, ES, AOS, alfa-SFE, SAS, SDS, saippuat ja softanoli; 5 (10) Kelatoivien aineiden vaikutukset EDTA:11a, EGTA:11a, sitruunahapolla ja zeoliitilla ei ole siihen sanottavaa vaikutusta; (11) Vastustuskyky proteaaseja vastaan Se osoittaa voimakasta vastustuskykyä aikalisiä 10 proteaaseja vastaan; ja (12) Se on saatavissa viljelemällä Bacillus sp. KSM-AP1876, joka on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology numereolla FERM BP-3049.
2. Alkalista pullulanaasia tuottava mikro-organis mi, tunnettu siitä, että se on nimeltään Bacillus sp. KSM-AP1876 ja on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, numerolla FERM BP-3049.
3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen alkali- sen pullulanaasin Z-l tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään Bacillus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia, joka kykenee tuottamaan mainittua alkalista pullulanaasia, minkä jälkeen alkalinen pullulanaasi otetaan . 25 talteen kasvualustasta.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä alkali-sen pullulanaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismia nimeltä Bacillus sp. KSM-AP1876, joka on talletettu talletuslaitokseen Fermentation 30 Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, numerolla FERM BP-3049; minkä jälkeen alkalinen « « * pullulanaasi otetaan talteen kasvualustasta. 95481
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1226211A JPH0659215B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 |
| JP22621189 | 1989-08-31 | ||
| JP1226210A JPH0387176A (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼ、これを産生する微生物及びアルカリプルラナーゼの製造法 |
| JP22621089 | 1989-08-31 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI904277A0 FI904277A0 (fi) | 1990-08-30 |
| FI95481B true FI95481B (fi) | 1995-10-31 |
| FI95481C FI95481C (fi) | 1996-02-12 |
Family
ID=26527056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI904277A FI95481C (fi) | 1989-08-31 | 1990-08-30 | Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5147795A (fi) |
| EP (1) | EP0415397B1 (fi) |
| CA (1) | CA2024194C (fi) |
| DE (1) | DE69013446T2 (fi) |
| DK (1) | DK0415397T3 (fi) |
| ES (1) | ES2065449T3 (fi) |
| FI (1) | FI95481C (fi) |
| HK (1) | HK154695A (fi) |
| NO (1) | NO180642C (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1050579B1 (en) * | 1990-04-05 | 2006-04-26 | Kao Corporation | Detergent composition |
| JPH05236958A (ja) * | 1992-02-28 | 1993-09-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 新規イソアミラーゼ及びその製造法 |
| WO1994019468A1 (en) * | 1993-02-25 | 1994-09-01 | Kao Corporation | Dna fragment containing gene for alkaline pullulanase |
| CA2316191A1 (en) * | 1997-12-22 | 1999-07-01 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions containing a neopullulanase |
| WO2007022597A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Protech Research Pty Ltd | Extracting and purifying limit dextrinases |
| CN101974543B (zh) * | 2010-08-18 | 2012-05-23 | 江南大学 | 一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用 |
| JP5860480B2 (ja) | 2011-01-11 | 2016-02-16 | キャプシュゲル・ベルジウム・エヌ・ヴィ | プルランを含む新しい硬カプセル |
| CA3059529A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| CN110678170A (zh) | 2017-04-14 | 2020-01-10 | 比利时胶囊公司 | 普鲁兰多糖胶囊 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1517752C3 (de) * | 1966-02-05 | 1974-10-24 | Farbwerke Hoechst Ag, Vormals Meister Lucius & Bruening, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von Pullulanase |
| US3806419A (en) * | 1968-11-13 | 1974-04-23 | Cpc International Inc | Preparing pullulanase enzyme |
| US3963575A (en) * | 1974-02-25 | 1976-06-15 | A. E. Staley Manufacturing Company | Producing pullulanase with organisms having a superior capacity to elaborate pullulanase |
| US4318989A (en) * | 1979-06-07 | 1982-03-09 | Lifeline Products, Inc. | Starch-degrading enzymes from Cladosporium resinae |
| US4734364A (en) * | 1983-05-20 | 1988-03-29 | Miller Brewing Company | Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice |
| JPS60186282A (ja) * | 1984-03-07 | 1985-09-21 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規な耐熱性プルラナ−ゼ |
| US4628031A (en) * | 1984-09-18 | 1986-12-09 | Michigan Biotechnology Institute | Thermostable starch converting enzymes |
| US4628028A (en) * | 1985-05-23 | 1986-12-09 | Cpc International Inc. | Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production |
| US4612287A (en) * | 1985-05-23 | 1986-09-16 | Cpc International Inc. | Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids |
| JPS6336780A (ja) * | 1986-07-31 | 1988-02-17 | Res Dev Corp Of Japan | 新規なプルラン分解酵素およびその製法 |
| JPH062071B2 (ja) * | 1986-08-08 | 1994-01-12 | 新技術事業団 | 糖類の製造法 |
| FI81112C (fi) * | 1986-08-27 | 1990-09-10 | Alko Ab Oy | Amylas av ny typ. |
-
1990
- 1990-08-29 EP EP90116597A patent/EP0415397B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-29 CA CA002024194A patent/CA2024194C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-29 ES ES90116597T patent/ES2065449T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-29 DE DE69013446T patent/DE69013446T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-29 DK DK90116597.7T patent/DK0415397T3/da active
- 1990-08-30 NO NO903801A patent/NO180642C/no unknown
- 1990-08-30 US US07/575,434 patent/US5147795A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 FI FI904277A patent/FI95481C/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-09-28 HK HK154695A patent/HK154695A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2024194A1 (en) | 1991-03-01 |
| FI904277A0 (fi) | 1990-08-30 |
| CA2024194C (en) | 1999-05-04 |
| EP0415397A1 (en) | 1991-03-06 |
| NO903801D0 (no) | 1990-08-30 |
| HK154695A (en) | 1995-10-06 |
| US5147795A (en) | 1992-09-15 |
| DE69013446T2 (de) | 1995-05-24 |
| DE69013446D1 (de) | 1994-11-24 |
| ES2065449T3 (es) | 1995-02-16 |
| FI95481C (fi) | 1996-02-12 |
| EP0415397B1 (en) | 1994-10-19 |
| NO903801L (no) | 1991-03-01 |
| NO180642C (no) | 1997-05-21 |
| NO180642B (no) | 1997-02-10 |
| DK0415397T3 (da) | 1995-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2652871B2 (ja) | アルカリセルラーゼおよびその製造法 | |
| EP0269977B1 (en) | Alkaline cellulases and microorganisms capable of producing same | |
| EP0458162B1 (en) | Proteinase-resistant cellulase, micro-organism producing the same and process for producing the same | |
| EP0495401A1 (en) | Novel alkaline proteinase and process for producing the same | |
| EP1050579B1 (en) | Detergent composition | |
| FI95481B (fi) | Alkalinen pullulanaasi, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen tuottamiseksi | |
| US5147796A (en) | Alkaline pullulanase Y having α-amylase activity | |
| EP0418835B1 (en) | Novel alkaline pullulanase y having alpha-amylase activity, microorganism producing the same, and process for producing the same | |
| WO1993012224A1 (en) | Carboxymethylcellulases and bacillus strains producing same | |
| JPH0630578B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼｋ | |
| JP2676453B2 (ja) | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 | |
| JP3000310B2 (ja) | カルボキシメチルセルラーゼ及びこれを生産する微生物 | |
| JP2866460B2 (ja) | 多糖類の糖化方法 | |
| JP2651576B2 (ja) | アルカリセルラーゼｅ−▲ｉｉ▼ | |
| JPH09206073A (ja) | アルカリα−アミラーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリα−アミラーゼの製造法 | |
| JPH0632606B2 (ja) | 新規微生物 | |
| JPH0387177A (ja) | アルカリプルラナーゼｚ―ｉ、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―ｉの製造法 | |
| JPH0787971A (ja) | カルボキシメチルセルラーゼ及びこれを生産する微生物 | |
| JPH0632612B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼ製造法 | |
| JPS63109777A (ja) | Ｃｍｃア−ゼ１ | |
| JP2000023666A (ja) | アルカリアミラーゼ | |
| JPH0655139B2 (ja) | Ｃｍｃア−ゼ▲ｉｉ▼ | |
| JPH07213282A (ja) | 耐熱性α−１，３−グルカナーゼの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: KAO CORPORATION |