JPS63109777A

JPS63109777A - Ｃｍｃア−ゼ１

Info

Publication number: JPS63109777A
Application number: JP25777786A
Authority: JP
Inventors: Susumu Ito; 進伊藤; Kenzo Koike; 謙造小池; Yuichi Ota; 裕一太田; Akira Takei; 章武井; Kikuhiko Okamoto; 暉公彦岡本
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1986-10-28
Filing date: 1986-10-28
Publication date: 1988-05-14
Anticipated expiration: 2009-07-27
Also published as: JPH0655138B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なＣＭＣアーゼに関し、更に詳細にはアル
カリ側に最適ｐＨを有する新規酵素ＣＭＣアーゼＩに関
する。

〔従来の技術〕

セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコース、
又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵
素反応を触媒する複雑な酵素系から成シ、その作用機構
によシ、ｃｍ酵素、ｃｘ酵素とβ−グルコシダーゼ、或
いはエキンーβ−クルカナーゼ、エンド−β−グルカナ
ーゼ、セロビオースなどの名称で呼ばれる酵素の総称と
理解されている。長年、セルラーゼ研究の歴史は専らバ
イオマス資源の有効利用を図る目的から進められてきて
おり、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アク
レモニウム属、フミコーラ属などのカビの類にそめ供給
源を求めてきた。然るに、カビを含めて微生物起源のセ
ルラーゼには、その構成酵素群の作用特異性や物塩化学
的諸性質等の多様性が有シ、その実態は未だ明確化され
たとは言い難い。

上記セルラーゼのうち、カルボキシメチルセルロース（
ＣＭＣ）に対する作用、すなわちｃｘ酵素作用が％に高
いものをＣＭＣアーゼと称するが、最近、ＣＭＣアーゼ
を含むセルラーゼの新規な産業用途として、例えば、衣
料用洗浄剤組成物の添加成分としての用途が開発されつ
つある。しかしながら、自然界において微生物の産生ず
るセルラーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎシ
、大部分がアルカリｐＨにおいて失活する不安定性を有
する、いわゆる酸性セルラーゼ（最適作用ｐＨが４〜６
）であって、衣料用洗浄剤組成物の要件である、アルカ
リ側で最大活性を有し、且つ耐性を有する、いわゆるア
ルカリセルラーゼの存在は極めて少々いのが実情である
。

すなわち、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカ
リセルラーゼに関しては、好アルカリ性微生物起源のア
ルカリセル２−ゼを生産する方法として、バチルスに属
する細菌を培養して培地よシセルラーゼＡを採取する方
法ｃ％公昭５０−２８５１５号公報）、セルロモナス属
に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラー
ゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４６８
６号公報）、好アルカリ性バチルス醜１１３９を培養し
てカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法（Ｈｏｒ
ｉｋｏｓｈｉら、Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１３１巻、３３３９頁（１９
８５年））、及びストレプトマイセス属の種を用いてア
ルカリセル２−ゼを生産する方法（特開昭６１−１９４
８３号公報）が知られているにすぎない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、アルカリ側において至適ｐＨを有し、衣料洗浄
用酵素としての機能を有するアルカリセルラーゼを新た
に提供することが要望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自
然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県芳
賀郡の土壌よシ採取したバチルス属に属する微生物が、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規アルカ
リセルラーゼＫを生産すること及び該アルカリセルラー
ゼを更に精製するとその主成分として新規なＣＭＣアー
ゼ■及び■が得られることを見出し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明は新規酵素ＣＭＣアーゼＩを提供する
ものである。

本発明のＣＭＣアーゼ■の製造において用いられる微生
物は次のような菌学的性状を示す。なお、以下において
菌株の分類に用いた培地は矢の培地１〜２４であシ、特
にことわりの無い限シ別滅菌した適当量の１．０重＃チ
の炭酸ナトリウム（ＮａｚＣＯｓ）を含むものである。

分類用検定培地の組成（表示は重量％）：培地１：バク
トベプトン、α５；肉エキス、０．３；バクト寒天、１
．５培地２：バクトベプトン、　０．５　：肉エキス、０．
３培地３：バクトベプトン、　０．５　：肉エキス、０
．３；食塩、７０培地４：バクトベプトン、　０．５　；肉エキス、０．
３；バクトゼラチン、　２０．０培地５：パクトリトマスミルク、　１０．５培地６：バ
クトベプトン、　０．５　；肉エキス、０，３：　ＫＮ
Ｏｓ　、　０．１培地７：バクトベプトン、　０．７　ニゲルコース。

０．５；食塩、０，５培地８：バクトベプトン、　３．０　：肉エキス、０．
３；チオ硫酸ナトリウム、　ｏ、　ｏ　ｏ　ｓ　；塩酸
システィン、　０．０２　：クエン酸鉄アンモニウム、
　０．０５　：パクト寒天、０．５培地９：バクトベプ
トン、１．５：肉エキス、０．４；乳糖、１．０；蔗糖
、１．０；グルコース。

ＬＯ；食塩、　０．５　：チオ硫酸ナトリウム。

ｏ、　ｏ　ｏ　ｓ　；亜硫酸ナトリウム、０．０４：硫
酸ＷＬ　−鉄、　ｏ、　０２　；フェノール・レッド、
　０．００２　；バクト寒天、１．５培地１０：バクト
ペプトン、１．５；酵母エキス。

０．５；可溶性澱粉、　２．、　Ｏ”、　Ｋ２ＨＰＯ４
、０，１：バクト寒天、　１．５　：　ＭｇＳＯ４・７
ＨｚＯｔ０．０２培地ｌｌニリン酸アンモニウム、　０．１　；塩化カリ
ウム、α０２；酵母エキス、Ｏ，ＯＳ；Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７ＨｓＯ、０，０２：糖類、　１．
０　（濾過滅菌）培地１２ニリン酸−水素カリウム、　０．１　ニリン酸
二水素アンモニウム、０．１：クエン酸ナトリウム、α
２　：　ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ？　Ｏ−０３：食塩、
Ｏ，Ｓ；ブロム・チモール・ブルー。

０．００２４：バクト寒天、１．５培地１３：＃母エキス、０．０５：塩酸システィン。

０．０１：クエン酸ナトリウム、０．３：食塩、０．５
；チオ硫酸ナトリウム、ｏ、ｏｏｓ；クエン酸鉄アンモ
ニウム、０．０４；グルコース、０．０２ニリン酸二水
素カリウム、　０．１５　：フェノール・レッド。

０、００１２　；バクト寒天、Ｌ５培地１４ニリン酸アンモニウム、　０．１　；リン酸二
水素カリウム、　Ｏ，ＯＳ　；クエン酸ナトリウム　、
　　０．　２　　：　　ノミ　り　ト　寒天　、　　　
１．　５　　ｅ、　　ＭｇＳＯ４・７Ｈｘ０　、０．０
２培地１５：酵母エキス、　０．０　’５　：　Ｎａ雪Ｓ
Ｏａ　、　０．１　”。

ＫＨＩＰＯ４＠　０．１　；グルコース、１．０；無機
窒素源、適当ｒ来硝酸ナトリウムは０．２５％、亜硝酸す）　ＩＪクム
は０．２０２５％、塩化アンモニウムは０、１５８チ、
リン酸アンモニウムは０．１９５チ（各々、０．０４１
２Ｎチに相当）になるように加えた。

培地１６：酵母エキス、　０．０５　；　ＮａｚＳＯ４
，０，１：ＫＨｚＰ０４ＨＯ−１＊グルコース、！、０
；無機窒素源、適当ｉ　　？　ＣａＣ１ｚ　・２　Ｈｚ
Ｏｔ　Ｏ−０５：　ＭｎＳＯ４・４”６ＨｚＯ、０，０
０１：　ＦｅＳＯ４−７Ｈ！０　、０．００１　（濾過
滅菌）　＊　Ｍｇ５Ｏ＜・７　ＨｚＯ、０，０２（濾過
滅菌）４ｓ余硝酸ナトリウムは０．２５％、亜硝酸ナトリウム
は０．２０２５％、塩化アンモニウムは０、１５８％、
リン酸アンモニウムは０．１９５チ（各々α０４１２Ｎ
％に相当）になるように加えた。

培地１７：キングＡ培地“栄研″″（栄研化学社ｊＲ）
。

指示量培地１８：キングＢ培地“栄研′（栄研化学社製）。

指示量培地１９：ポテトデキストロース寒天培地“栄研１（栄
研化学社製）、指示量培地２０：バクトベプトン、０．２５：食塩、　０．２
５；酵母エキス、　０．２５　：マンニット。

０．５；バクト寒天、λＯ培地２１：尿素培地“栄研“（栄研化学社製）、指示量培地２２：バクトペプトン、　０．１　；食塩、　０．
５　：ＫＨＩＰＯ４ｖ　Ｏ，２：酵母エキス、　０．　
Ｏ５：グルコース、０．１；尿素、　２０　；フェノー
ル・レッド、　Ｏ，ＯＯ１培地２３：バクトベプトン、　０．５　：酵母エキス。

０、５　；　ＫＩＨＰＯ４、０，１ｍ、グルコース、１
．０：ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ，α０２培地２４：酵母エキス、α５；グルコース、１．０：カ
ゼイン（バーマーシュタイン、メルク社製）　＊　０．
５　：　Ｋ２ＨＰＯ４ｓ　０．１　；　Ｍｇ５Ｏａ・７
ＨｚＯｔ　０．０２　＊パクト寒天、１．５Ｃ菌学的性
状）Ｌ　顕微鐘的観察結果：菌体の大きさは、α５〜１２μｍ　Ｘ　１．５〜４．０
（至）の桿蕗であシ、菌体の一端に内生胞子〔０，７〜
Ｌ２μｍ　Ｘ　１．０〜２．、　Ｏｐｍ　）を作る。周
鞭毛。運動性；陽性。グラム染色；陽性。

２　各種培地における生育状態： ■　肉汁寒天培地（培地１）集落の形状は円形で、集落の光面は偏平状である。又、
集落の色調は白色乃至黄色の半透明であシ、光沢がある
。

■　肉汁液体培地（培地２）生育し、混濁する。

■　７％食塩肉汁液体培地（培地３）生育し、混濁する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培ｔ！（培地４）生育しない。

■　リドマスミルク培地（培地５）ミルクの凝固、ペプトン化；陰性。又、培地５がアルカ
リ性のため、リドマスの変色も認められなかった。

λ　生理学的性質： ■硝酸塩の還元及び脱窒反応硝酸還元；陽性、脱窒反応；陰性（培地６）。

■ＭＲテスト（培地７）培地がアルカリ性のため、メチルレッドの変化は認めら
れず、判定不能。

■ｖｐテスト（培地７）陽性。

■インドールの生成（培地８）インドール産生試験用濾紙（「ニラサン」。

日永製薬社製）に対する反応、コバツクの試薬に対する
呈色のいずれに対しても陰性。

■硫化水素の生成（培地９）陰性。

■澱粉の加水分解平板寒天培地、培地１０、を４Ｎ塩酸で酸性にしても通
常のヨウ素反応による検出法では陰性といえる。液体培
地１１において、可溶性澱粉の資化性は陰性。

■クエン酸の利用性培地１１；陽性◎ 培地１２（コーナ（シモンズ）のクエン酸寒天平板培地
）；陰性。培地１２から寒天を除き、０．０５％の酵母エキスを加えた液体培地では、陽性。

培地１３（クリステンセンの寒天平板培地）；陽性。但
し、アルカリ性のためフェノールレッドの変化なし。

培地１４；陰性（生育せず）。培地１４から寒天を除き
０．０５％の酵母エキスを加えた液体培地では、陽性。

■無機窒素源の利用培地１５：硝酸、亜硝酸、アンモニアのいずれも陰性か
らぎ陽性。

培地１６；微量金属塩類を含有する本培地では、硝酸と
亜硝酸に関し陽性。塩化アンモニウム；ぎ陽性。リン酸アンモニウム；陽性。

■色素の生成 Δ キング培地（培地１７）では生育せず、判定不能。

キングＢ培地（培地１８）では淡黄色Ｃ螢光性無し）。

ポテトデキストロース寒天培地（培地１９）とマンニッ
ト酵母エキス寒天培地（培地２０）では生育するが、色
素の生成は陰性。

■ウレアーゼ培地２１；生育せず。培地２１からフェノール・レッド
を除き、本国を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確認したが、陰性。

培地２２（クリステン七ンの尿素培地に酵母エキスを添
加）：培地から７エノール・レッドを除き、本国を培養後、ネスラー試薬でアンモニアの生成を確認したが、陰性。又、細胞毒性を予測して、培地２２の尿素濃度を０．１　、０．２　、０．５　、１．０．２０％と変化
させて試験したが、陰性。

■オキシダーゼ陽性、陰性はつきシせず。

＠カタラーゼ陽性。

■生育の範囲（培地２３）生育温度範囲は２０〜４５℃、生育最適温度範囲は２９
〜３７℃。生育のｐＨ範囲を調べる目的で、ＮａＩＣＯ
３により初発ｐＨを変えて試験したところ、生育ｐＨ範
囲は８〜ＩＬ生育最適ｐＨ範囲は９．５〜１０．２であ
った。一方、ＫＩＣＯｓでｐＨを調整すると、生育量は
著しく少なく、生育至適ｐＨは、約９であった。

［相］酸素に対する態度好気的。

＠Ｏ−Ｆテストアルカリ性のため変色せず。好気のみ生育する。

［相］糖類の利用性（培地１１）利用できる炭素源：Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−７ラクトース、麦芽糖、シヨＩＩ、）レバロース、Ｄ
−マンニット、イノジット、グリセリン利用できない炭素源：Ｄ−ガラクトース、乳糖、Ｄ−フ
ルビット、デンプン、デキストリン、ラフィノース ■カゼインの加水分解（培地２４）寒天平板培地２４に菌を生育せしめ、３０％トリクロロ
酢酸を流し込んで判定したが、菌体周囲に透明帯を形成
せず、陰性。

■栄養要求性ビオチン（又はデスチオビオチン）。

以上の菌学的性質について、バーシーズ・マニュアル・
オプ・デイタミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版を参照
した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　）属の一種であると認められる。しかし、
本菌株が中性ｐＨでは生育できず、専ら高アルカリｐＨ
で良好な生育を示すことから、最近、掘越と秋葉（“Ａ
ｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
”　、　ＪａｐＨｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｔｏｋｙｏ　）　、　１９８２年
刊）の主張する、いわゆる好アルカリ性（ａｌｋａｌｏ
ｐｈｉｌｉｃ　）微生物として暫定的に、従来の中性で
生育するバチルスと区別される。

そして、本菌株の菌学的性質は、公知の好アルカリ性バ
チルスのいずれとも一致しないのでこれを新規菌株と判
断してバチルス　エスピーＫＳＭ−６３５と命名し、微
工研菌寄第８８７２号として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した。

本発明のＣＭＣアーゼ■を収得するには、上記バチルス
エスピーＫＳＭ−６３５若しくはその変異株を培地中で
培養し、アルカリセルラーゼＫを得た後、これを通常の
酵素ｎ製法に付し、分離、精製すれば良い。

アルカリセルラーゼにの発酵生産にあたっては、適当な
培地を加熱等によシ殺菌後、バチルス　エスピー　ＫＳ
Ｍ−６３５（ＦＥＢＭ　Ｐ−８８７２’）を接種し、２
２℃〜４０℃、好ましくは２６℃〜３７℃で、１〜４日
振盪又は通気攪拌培養すれば良い。ｐＨは８〜１１に調
襄すると良い結果が得られる。発酵生産培地がアルカリ
性なので、時として発泡するが、適当な消泡剤を適宜添
加することによって解消される。

アルカリセルラーゼに生産には、資化し得る窒素源と炭
素源を適宜組み合わせて培養培地に含有させれば良く、
特に両栄養源を限定するものではない。例えば、窒素源
としては、無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニ
ウム、硝酸ソーダや、コーングルテンミール、大豆粉、
コーンステープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファ
ーマメデイア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハ
イフロ、アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒ
ー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びア
ジプロン、ゼスト、フレックス々どが挙げられる。又、
炭素源としては、籾殻、麩、濾紙、−紋紙類、おが屑、
などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチル
セルロース（ＣＭＣ）、アピセル、セルロース綿、キシ
ラン、ペクチンに加え、貴化し得る炭素源、例えば、リ
ボース、アラビノース、キシロース、グルコース、マン
ノース、７ラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロース
、マンニット、イノジット、グリセリンや資化し得る有
機酸、例えば、酢酸、クエン酸などが挙げられる。すな
わち、これらの窒素源と炭素源を適宜組み合わせたいか
なる培地を使用しても良く、上述の栄養源を特に限定す
るものではない。その他、リン酸、Ｍ　ｇ　Ｒ＋　、　
（ａ　！　＋、　Ｍｎ　２　＋　、　ｚｎ　２　＋　、
　（ｏ　２　＋。

Ｎａ＋、　Ｋ＋　などの無機塩や、必要であれば、無機
、有機微量栄養源を含有する培地を適宜選択して使用さ
れる。

斯くして得られた培養物中からアルカリセルラーゼＫを
得るには、例えば、後記実施例に示す如く、一般の酵素
の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。

すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等によって菌体
を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手疫、
例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノー
ル、エタノール、イソプロパツール等）によって蛋白を
沈澱させたシ、又、限外濾過（例えばダイアフローメン
ブレンＹ０１アミコン社製）により濃縮させてアルカリ
セルラーゼＫを得る。塩析法では例えば、硫安（３０〜
７０％飽和画分）、溶媒沈澱では例えば、７５％エタノ
ール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱
塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可
能である。脱塩の方法としては透析又はセファデックス
　Ｇ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用い
られる。

さらに１このアルカリセルラーゼＫからＣＭＣアーゼ■
を得るには例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、ＤＩＡＩ−セファデックス又はＤＥＡＥ−セル
ロース等のイオン交換クロマトグラフィー及びセファデ
ックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフ
ィーを適宜組み合わせて分別ｒＩＩＩ製すれば良い。

斯くして得られ九０ＭＣアーゼ■は、以下に示すような
性質を有する。

（１）　　作用本酵素は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に作
用するＣｘ酵素活性を有する。しかしながら、更に、リ
ン酸膨潤セルロースにも作用し、作用特異性トシて結晶
性セルロース（セルロース綿）や結晶性の高いセルロー
スであるアピセルに作用する酵素（すなわちアビセラー
ゼ）と濾紙崩壊活性（ＦＰアーゼ）などに代表されるＣ
ｔ酵素、セロビオースやセロオリゴ糖に作用するβ−グ
ルコシダーゼ活性も有する。また、人工基質であるｐ−
エトロフェニルセロビオシドに対しても若干ながら作用
してｐ−ニトロフェノールを遊離させる。

（２）基質特異性本酵素はＣＭＣアーゼ活性を主活性とするが、その約０
．３　％の７ビセ２−ゼ及びＦＰアーゼ活性（Ｃｓ活性
）を有する。また、人工基質ｐ−二）ロフェニルセロビ
オシド分解活性は、その約１．５〜Ｌ８％であった（第
１表）。一方、キシラン、アミロース、デキストリン、
ペクチン、イヌリン、カードランに対し分解能力を有し
なかった。

第１表ＣＭＣ６，５６濾紙　　　　　０．０２０アピセル　　　　　　　　　　０．０１９セロビオース
　　　　　　　　０．０１０ＰＮＰＣ”　　　　　　　
　　　０．０９９奈ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ本酵素の作用ｐＨ範囲は、３〜１２．５であり、至適ｐ
Ｈ範囲は６〜１１．５である（第１図）。最も作用の強
い最適ｐＨは約９．５である。

なお、ｐ−ニトロフェニルセルビオシトに対する作用ｐ
Ｈ範囲は４〜１１であシ、最適ｐＨは約７であった。

（４）　　ｐＨ安定性本酵素を各々のｐＨで３０’Ｃ，１時間保持した後の残
存活性を測定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐＨ
５から１２で極めて安定で、失活しなかつえ（第２図）
。

（５）力価の測定法００ＭＣアーゼ活性ＣＭＣ（１５％　）０．２ｍ、０．５Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ９，０）　０．１　ａ！、及び脱イオン水０．１
−からなる基質溶液に酵素液０．１　ｍを加え、４０℃
で２０分間反応した。反応後、３．５−ジニトロ−サリ
チル酸（３、５−ｄｉｎｉｔｒｏ　−５ａｌｉｃｙｌｉ
ｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ　）　）法にて還元糖の定量を
行った。すなわち、反応液０．５　ｄにＤＮＳ試薬１−
を加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４
．５ｍｇの脱イオン水を加えて希釈した。これを波長５
３５ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で
１分間にｌｐｍｏｔのグルコースに相当する還元糖を生
成する酵素量を１単位とした。

■ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性１００　ｐ
ｍｏＬリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、Ｏ−１μｍｏｔｐ
−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社）を含む反応
液１．Ｏｄ中に適当量のＣＭＣアーゼを３０℃で作用さ
せた後、Ｉ　Ｍ　Ｎａ２ＣＯｓを０．３ｍ、脱イオン水
をＬ７−順次加え、遊離するｐ−二トｉフェノールを４
００℃ｍで比色定量した。この条件で１分間にｌｐｍｏ
ｔのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量ｔ−１単
位とした。

■アビセラーゼ及びＦＰアーゼ活性反応液２　ｒｓｌ中、ＣＭＣ反応液の基質ＣＭＣに代え
て２０１１９のアピセル（メルク社）、又は塊状にした
、幅０．５　ｃｍ　、長さ５３の濾紙片（セルラーゼ活
性度検定用濾紙、東洋Ｎ１５１−４？）を加え、アビセ
ラーゼ及びＦＰアーゼ活性を測定した。この条件で１分
間にグルコース換算でｌｐｍｏｔの還元糖を遊離させる
酵素量を１単位とした。

■蛋白定量法バイオ・２ド　プロティン　アッセイ　キット（バイオ
・ラド社）を用いて、牛血清アルブミンを像準蛋白とし
て算出した。

（６）作用温度及び至適温度ＣＭＣアーゼ■の作用温度範囲は、１０〜６０℃である
。また至適温度範囲は２２〜５３℃である。なお、本酵
素の作用最適温度は４０℃である。

また、本酵素は低温において充分に耐性を有し、２０℃
の低温下でもその約５０％の活性を有する（第３図）。

（７）温度安定性５０℃、３０分間の加温処理によっても約５０−の残存
活性を有する（グリシン緩衝液中；ｐＨ９，０）。

（８）　　金属の影響金属やイオンはＣＭＣの物理化学的性質、特に粘性等を
変えるので、本発明の酵素成分の活性を測定するにあた
シ、ＣＭＣを基質とする場合、アルカリセルラーゼにの
反応動力学的諸因子を正確に反映しないことは自明であ
る。そこで、ＣＭＣアーゼ■がｐ−ニトロフェニルセロ
ビオシド分解活性を有することを指標として、酵素活性
に及ばず金属の影響を調べ九。この結果、ｚｎ２＋、Ｃ
ｏ２＋。

Ｎ　ｉ　２　＋　、　（ｕ２　＋　、　Ｈｇ２＋は、Ｃ
ＭＣアーゼＩの活性を阻害した。一方、活性化について
は、Ｍｎ”＋とＢａ’＋で若干の活性化を認めた。

（９）　　＃レートの影響ＣＭＣアーゼ■はキレート剤であるＥＤＴＡ。

ＥＧＴＡＳＮＴＡ、８ＴＰＰ及びゼオライトによって何
ら阻害を受けなかった。

（１０）糖類の影響（８）　、！−同ｍにｐ−ニトロフェニルセロビオシト
全０ＭＣアーゼ■の基質として、各種糖類の影響を調べ
九。セロビオースは、両酵素成分を阻害し、生成物阻害
（ｐｒｏｄｕｃｔ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　）の型式を
示したが、他の２糖類、例えば乳糖、麦芽糖は、無影響
であった。単糖であるグルコサミン、Ｎ−アセチルグル
コサミン、リボース、アラビノース、ソルボース、キシ
ロース、果糖、ガラクトース、グルコース、その誘導体
である３−０−メチル−Ｄ−グルコース、α−メチル−
β−Ｄ−グルコース、ａ−メチル−Ｄ−グルコシド、ａ
−メチル−ｂ−マンノシド、２−デオキシグルコースあ
るいは、その他の糖類、例えばラムノースなども何ら活
性を阻害しなかった。

（Ｕ）塩濃度の影響反応緩衝液としてリン酸緩ｍ液、パイシン（ＢＩＣＩＮ
Ｅ　−Ｎａ　）緩衝液、トリス−塩酸緩衝液を用い、イ
オン強度調節剤として、食塩（０〜２５０ｍＭ）ヲ用い
て、ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性を指標と
して、ＣＭＣアーゼ■に対するイオン強度の効果を調べ
た。この結果、イオン強度と酵素活性の間には促進、阻
害等の関係は認められなかった。・（１２）界面活性剤の影響線状アルキルペンゼスルホン酸ナトリウム（−ＬＡＳ）
、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、ポリオ
キシエチレンアルキルｔｔ酸エステルナトリウム塩（Ｅ
Ｓ）、（１−オレフィンスルホン酸ナトリウム（ＡＯＳ
）、α−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム塩（Ｑ
−ＳＦＥ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）
、ポリオキシエチレンセカンダリ−アルキルニー７−７
ｙ、ＪＪＩ肪酸塩（ナトリウム塩）、ジメチルジアルキ
ルアンモニウムクロライド及びタウロコール酸によって
殆んど活性は阻害されなかった。

（１３）分子量ゲルクロマトグラフィー（トヨパール５５Ｓ；東洋曹達
）を用いて測定した分子量は、１４へｏｏｏ±ＩＱＯＯ
Ｏであった。

（１４）　Ｕ　Ｖ吸収スペクトル本酵素をパイシン（ＢＩＣＩＮＩ　）−ナトリウム緩衝
液に溶解してＵＶ吸収スペクトルを測定した結果、約２
８０ｍｍに最大吸収を有し、微分吸収スペクトラムを調
べることによって２９０ｎｍにおける肩吸収の存在が示
された（第５図）。

（１５）糖の検出精製した本酵素蛋白を７エノール硫、酸性で発色試験し
たところ４８０ｎｍに最大吸収を有した。本結果　　　
　　−は、本酵素が糖を含有することを示す。アルディ
ドール・酢酸法を用い”てガスクロマトグラフィーにて
糖を検出し、構成糖としてＮ−アセチルグルコサミンを
含むことが認められた。本酵素は１．３〜４．０重量％
の当該糖成分を含有していた。

（１６）プロテアーゼ耐性洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ（昭和電工）、マク
サターゼｃノボ社）、及びアルカラーゼｃノボ社）を本
酵素と共存させ（０，０００２〜０．１重量％）、１５
℃、１２時間プリインキュベーション処処理菌の残存活
性を測定したところ、全く失活は認められず、本酵素が
プロテアーゼに対して強い耐性を有することがわかった
（第２表）。

以下余白第２表対照（無添加）　　　　　　　　　　　１００ＡＰＩ−
２１０，１９９（＋１１３和電工）　　　　　０．０１　　　　　１１
２マクサターゼ　　　　０．１　　　　　１０２（ノボ
）　　　　　　　０．０１　　　　　１０８アルカラー
ゼ　　　　０．１　　　　　　１１１（ノボ）　　　　
　　　０．０１　　　　　１１６上記した、本発明のＣ
ＭＣアーゼ■の諸性質を公知のセルラーゼと比較すれば
次の通りである。

本酵素は、高ｐＨ領域に最適ｐＨを有するものでアリ、
トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属（
西沢−俊、「セル２−ゼ」（東京南江堂、昭和４９年刊
））、アクレモニウム属（特公昭５９−１６６０８１ン
、７ミコーラ属（特公昭６ｌ−１６３１６）などに代表
されるカビの酸性側に最適ｐＨ’に有するセルラーゼと
区別されるものであることは明らかである。

また、特公昭５０−２８５１５号に開示のセルラーゼ及
びＪ、　Ｇｅｎ、　Ｍｔｃｒｏｂｉｏｌ　１３１巻、３
３３９頁（１９８５）に報告されたセルラーゼと比較し
た場合は、本アルカリセルラーゼが分子量１４５０００
±ＩＱＯＯＯであるのに対し、特公昭５０−２８５１５
号のアルカリセルラーゼの分糖を構成成分として含む点
において明らかに区別される。

〔作用及び発明の効果〕

本発明のＣＭＣアーゼＩは、ｐＨ１１においても最適ｐ
Ｈの約７５〜８０％の相対活性を有しており、過去に研
究されたアルカリセルラーゼの中でも最もアルカリ側で
充分活性が発揮される酵素群であることがわかる。又、
最適ｐＨが高アルカリ側に強く発揮されるＫも拘らず、
ｐＨ３，５前後の強酸性側でも活性を有するという点で
も特異的である。このように広いｐＨ領域において活性
を有し、かつ安定なセルラーゼは従来存在しないもので
ある。また、比較的低温下（１５℃前後）でも充分活性
を有し、界面活性剤、キレート剤や各種プロテアーゼに
対する強力な耐性を合せ持つセルラーゼも従来知られて
おらず、本発明によって初めて見出されたものである。

したがって、本発明のＣＭＣアーゼ■は、低温洗浄にお
いても強力な洗浄効果を発現する、衣料用洗浄剤添加酵
素を始め、バイオマスその他の用途に有効に利用するこ
とができるものである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１゜栃木県芳賀郡市貝町の土壌を滅菌生理食塩水に懸濁し、
８０℃で３０分間熱処理した。この熱処理液を適当に希
釈してマスタープレート（１チ肉エキス（オキンイド社
裂）、１％バクトペプトン（ディ７コ社製）、１％Ｎａ
Ｃ１、０，１％　ＫＨｚＰＯ４，０、５％ＮａｚＣＯｓ
　（別滅菌）、１．５％パクト寒天）に塗床し３０℃で
３日間培養し、集落を形成させた。

レプリカ法により、２％ＣＭＣ含有マスタープレートに
移植し、再度集落を形成させた後、コンゴーレッド色素
溶液を流し込み、周囲が透明に々る集落を検出した。当
該する集落をマスタープレートから選出し、高力価ＣＭ
Ｃアーゼ生産菌をスクリーニングした。

上述の手法によシ、本発明のバチルス　エスピー　　Ｋ
ＳＭ−６３５（ＦＥＲＭＰ−８８７２）を取得した。

実施例２バチルス　エスピー　ＫＳＭ−６３５（ＦＩＲＭＰ−８
８７２）を１．５％肉エキス、０．５％酵母エキス、１
　％　ＣＭ　Ｃ％　　ｏ、　１１西ＰＯ＜と０．７５　
％Ｎａ２ＣＯ３からなる液体培地中、３４℃で２日間好
気培養した。その培養土清液１ｔに対して３ｔの冷エタ
ノール（−１０℃）を徐々に加えて蛋白沈澱を生じさせ
、得られる沈澱物を最小量の滅菌脱イオン水に溶解し、
希酢酸で中和した後、流水に対して１５時間透析し、凍
結乾燥して酵素粉末＆６ｔを得た。得られた乾燥粉末中
の各種酵素活性は第３表に示した通シであった。

第３表酵素の種類　　　　比活性（単位／２酵素粉末）β−グ
ルコシダーゼ　　　　　　　０．７ＰＮＰＣ１６，５ＣＭＣアーゼ　　　　　　　３３３ＦＰアーゼ　　　　　　　　　　１．１アビセラーゼ　
　　　　　　　　１．１帝ｐ−ニトロフェニルセロビオ
シ）”ｌＦ活性実施例ふ実施例２において、バクトペブトンに代えて魚肉エキス
１．５チ添加した培地にバチルス　エスピー　　ＫＳＭ
−６３５（ＦＥＢＭＰ−８８７２）を接糧し、３０℃で
３日間撮盪培養した。培養後、遠心分離した上清液につ
いてＣＭＣアーゼ活性を測定した結果、３ｏｏｏ単位／
ｌであった。

実施例４゜実施例３．で得られた培饗上清１ｔについて、以下の手
順に従って精製をおこない、ＣＭＣアーゼＩを得た。■
ストレプトマイシン処理、■硫安分画（３０〜７５％飽
和沈澱画分］、■分取高速液体クロマドグ２フィー（例
えば、ＳＷ　　３０００　　Ｇカラム（東洋曹達））、
■ＤＥＡＥ−）ヨパール（東洋曹達）クロマトグラフィ
ー、■ヒドロキシアパタイト（生化学工業）クロマトグ
ラフィー、そして再度、■ＤＥＡＥ−トヨパールクロマ
トク２フィーを行うことＫよって精製される。精製の第
６段階でＮａＣＬの直線濃度勾配による溶出（０，２５
ＭＮａＣｔから０．３５ＭＮａＣｔ）をおこなうと、溶
出速度の順にＣＭＣアーゼＩとＣＭＣアーゼ■が溶出さ
れ、２４岬のＣＭＣアーゼ■が分離、取得された。得ら
れた〇ＭＣアーゼ■につい１２１巻、４０４頁（１９６
４年））の方法に従って電気泳動を行つ死後、コマクー
・ブリリアント・ブルーで染色して単一のバンドを与え
ることを確認した。

実施例５゜実施例４．で得たＣＭＣアーゼＩ及び■について、常法
に従いソデイウム・ドデシル・サルフェート電気泳動を
おこなった。この結果を第６図に示す。

この結果から、ＣＭＣアーゼＩ及び■は最低分子１３Ｑ
ＯＯＯ±ｚｏｏｏから最高分子量１２ＱＯＯＯ±１５０
００の各分子量の会合体であることが認められ、本発明
のＣＭＣアーゼ■及びＣＭＣアーゼ■は、最低分子量３
（１０００±２．ｏｏｏの酵素蛋白が何らかの物理化学
的相互作用により強固に会合したものと判断される。本
発明のＣＭＣアーゼ■の主蛋白種は、分子量５ａｏｏｏ
〜６！１４０００である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＣＭＣアーゼＩの反応ｐＨと相対活
性の関係を示す図面である。第２図は、本発明のＣＭＣアーゼ■の処理ｐＨと残存活
性の関係を示す図面である。第３図は、本発明のＣＭＣアーゼＩの反応温度（ｐＨ９
，０）と相対活性の関係を示す図面である。第４図は、本発明のＣＭＣアーゼ■の処理温度（ｐＨ９
，０）と残存活性の関係を示す図面である。第５図は、本発明のＣＭＣアーゼＩのＵＶ吸収を示す図
面である。第６図は、本発明のＣＭＣアーゼＩ及び■のソデイウム
・ドデシル・サルフェート電気泳動の結果を示す図面で
ある。以上第５図波長（面）Ｎ区残存活性（％）区相対活性　（％）礫、ｂ残・°存活性　　（％）　　　　区、−；ｆ’：、＝１．’ ω 区相対活性（％）第６図手続補正書（自発）昭和６１年１２月２３日１、　事件の表示昭和６１年　特　　許　願第２５７７７７号２、発明の
名称ＣＭＣアーゼＩ３、　補正をする者事件との関係　　　出願人住所名称　（０９１）花王株式会社４・代■人 α　補正の対象明細書の「発明の詳細な説明」の欄７、　補正の内容（１）明細書中、第５頁第９行「バチルスに」とある含「バチルス属に」と訂正する。（２）同、第２８頁下から第３行「２８０　ｎｍ　Ｊとあるを「２８０ｎｒｎ」と訂正する。（３）同、第２９頁第１２行「マクサターゼ（ノボ社）」とあるを「マクサターゼ（ギスト社）」と訂正する。（４）同、第３０頁「第２表」、「添加したプロテアー
ゼ」の欄の第３欄「マクサターゼ（ノボ）」とあるを「マクサターゼ（ギスト）　」と訂正する。（５）　　同、第３０頁下から第３行「カビの酸性」とあるを「カビの中性ないし酸性」と訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】１、次の物理化学的性質を有するＣＭＣアーゼ I 。（１）作用カルボキシメチルセルロースに作用するＣ＿ｘ酵素活性
のほか、弱いＣ＿１酵素活性、β−グルコシダーゼ活性
を有する。（２）基質特異性カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、アピセル、セロビオース及びｐ−エトロフェニ
ルセロビオシドに対して作用する。（３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ作用ｐＨは３〜１２５であり、至適ｐＨは６〜１１．５
である。（４）ｐＨ安定性３０℃で１時間保持した場合ｐＨ５〜１２で失活しない
。（５）作用温度及び至適温度作用温度は１０〜６０℃、至適温度は２２〜５３℃である。（６）キレート剤の影響ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＳＴＰＰ及びゼオライトは活性を阻害しない。（７）界面活性剤の影響線状アルキルベンゼスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ
）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウ
ム塩（ＥＳ）、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（
ＡＯＳ）、α−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム
塩（α−ＳＦＥ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（Ｓ
ＡＳ）、ポリオキシエチレンセカンダリ−アルキルエー
テル、脂肪酸塩（ナトリウム塩）、ジメチルジアルキル
アンモニウムクロライド及びタウロコール酸は活性を阻
害しない。（８）プロテアーゼ耐性プロテアーゼに対して強力な耐性を有する。（９）分子量（ゲルクロマトグラフィー法）本酵素の分
子量は１４５，０００±１０，０００である。（１０）ＵＶ吸収スペクトル本酵素は、２８０ｎｍに最大吸収を有しまた２９０ｎｍに肩吸収を有し糖成分を含有する。２、バチルス　エスピー　ＫＳＭ−６３５の培養物より
分離取得されたものである特許請求の範囲第１項記載の
ＣＭＣアーゼ I 。