JPH034787A - アルカリセルラーゼ、これを産生する微生物及びアルカリセルラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼ、これを産生ずる微
生物、及び該アルカリセルラーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、バイオマス
資源（特にセルロース資源）の有効利用を一大目標とし
て、進められてきており、多くの場合、カビ類にその供
給源を求めてきている。セルラーゼ生産菌として分離さ
れて来た菌株は、多種類にわたり、アスペルギルス属、
ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム屈、フミ
コーラ属、アクレモニウム属等の糸状菌（カビ）を中心
に、シュウトモナス属、セルロモナス属、ルミノコッカ
ス属、バチルス属等の細菌、更に、ストレプトマイ、セ
ス属、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告さ
れている。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼのほ
とんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵
素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類
されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合する
ための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ領
域で最大活性を示す所謂アルカリセルラーゼの存在は極
めて少ないのが実情である。尚、ここで言うアルカリセ
ルラーゼとは至適ｐＨがアルカリ領域にあるものを言う
。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼの生産方法としては、好アルカリ
性バチルス属細菌の培養によりセルラーゼＡを採取する
方法（特公昭５０−２８５１５号公報）、セルロモナス
属に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラ
ーゼ３０１−八を生産する方法（特開昭５８−２２４６
８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮα１１３９を培
養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法（Ｐ
ｕｋｕｍｏｒｉ、　Ｆ、、　Ｋｕｄｏ、　Ｔ。

ａｎｄ　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、　Ｋ、、　Ｊ、Ｇｅｎ０
Ｍ１ｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１３１゜３３３９、　　（
１９８５））及びストレプトマイセス属の一種を用いて
アルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−１９
４８３号公報）が報告されているに過ぎず、しかもいず
れも工業的発酵生産に適うものではｊ！！（かった。

ところが、最近、好アルカリ性細菌の一種であるバチル
ス　エスピー（［１ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＫＳＭ
−６３５（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１４８５）　（特開昭６３
−１０９７７１号公報）が、衣料用洗浄剤組成物として
適したアルカリセルラーゼＫ（特開昭６３−１０９７７
６号公報）を高生産することが見出され、アルカリセル
ラーゼの工業的発酵生産が行われるに至っている。更に
好アルカリ性菌によらずとも、培養が容易な中性細菌に
よってもアルカリセルラーゼ（特開昭６３−１３７６７
７゜２４０７８５、２４０７７７、２４０７８６号公報
、特開昭６４−３７２８５号公報、Ｓ、Ｋａｗａｉ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

５２、１４２５（１９８８））及びアルカリ領域におい
ても高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼ　（特
開昭６３−１４１５８６．１４６７８６．２７３４７４
．２７３４７５．２７９７９０号公報、特開昭６４〜３
７２８６号公報）を生産し得ることも見出されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、工業的発酵生産に適うアルカリセルラー
ゼの例は現在までのところ上記の例のみであり、更に様
々な特色を有するアルカリセルラーゼ及びその生産菌°
の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自
然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県那
須郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物が、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規なアル
カリセルラーゼを生産することを見出し、本発明を完成
した。

したがって、本発明は新規なアルカリセルラーゼに−６
４、これを産生ずる微生物（バチルス・エスピーＫＳＭ
−６４）及び該アルカリセルラーゼの製造法を提供する
ものである。

本発明のアルカリセルラーゼを生産する上記微生物は、
次のような菌学的性状を示す。なお、以下において菌株
の分類に用いた培地は次の培地１〜２１の２１種類であ
り、これらは何れも別途滅菌した炭酸す）　ＩＪウム（
Ｎａ＝ＣＬ）を１．０重量％（以下、単に％という）含
有する。

使用した培地の組成（表示は％）： 培地１．ニュートリエンドブロス、０．８；バクト寒天
、１．５ ｔｇｍ２．　二ニートリエンドブロス、０．８培地３．
ニュートリエンドブロス、０．８；ゼラチン、２０．０
；バクト寒天、１．５ 培地４．バイトリドマスミルク、１０．５培地５．ニュ
ートリエンドブロス、　　０．８　；　ＫＮｏ。

０．１ 培地６．バタトベブト：’、　　０．７　；　ＮａＣβ
、０．５；ブドウ糖、０．５； 培地７．３ＩＭ寒天培地、指示量 培地８．ＴＳ＋寒天培地（栄研化学製）、指示量培地９
．バタトペブトン、１５；酵母エキス。

０．５；可溶性澱粉、　　２．０　；　Ｋ２＋１ＰＯ，
、０，１；　Ｍｇ５Ｏ＊・７Ｈ２０，０，０２；バクト
寒天。

１．５ 培地１０．　Ｋｏｓｅｒ培地、指示量 培地１１．　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地　（栄研化学
製）、指示量培地１２．■酵母エキス、　０．０５；Ｎ
ａ２Ｓ０．０．　ｌ；Ｋ１１ｚＰＯ＜。

０．１；ブドウ糖、１．０ ■酵母エキス、０．０５；Ｎａ２．Ｓ０４．０．ｉ；Ｋ
１１２ＰＬ。

０．１；ブドウ糖、　　１．０； ＣａＣｆ１２”　２１１２Ｄ、　０．０５；Ｍｎ５Ｏ，
”　４〜６Ｈ，０゜０、０１：ＦｅＳＯ４・７＋１２０
．０．００１：Ｍｇ５Ｌ・７１ｉ２０．０．０２ 窒素源は、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化ア
ンモニウム及びリン酸アンモニウムを総窒素含■として
０．０４１２％となる様に上記■及び■の培地に加えて
用いた。

培地１３．キングΔ培地″栄研”　（栄研化学製）。

指示量 培地１４．キングＢ培地“栄研”　（栄研化学製）指示
量 培地１５．尿累培地“栄研”　（栄研化学製）、指示■ 培地１６．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
永製薬製） 培地１７．３％過酸化水素水 培地１８．バタトペブトン、　０．５；酵母エキス、０
．５；ＫＨ２ＰＯ，、０，１；ブドウ糖、　　１．０；
Ｍｇ５ＩＬ・７１．０．０．０２ 培地１９．バタトベプトン、　２．７；ＮａＣｊ！　、
　５．５ニブドウ糖、　０．５；ＫＨ２ＰＯ，、０，３
；ブロムチモールブルー　０．０６；バクト寒天、１．
５培地２０．　（ＮＩ＋４）　、１ｌＰＯ，、Ｏ８１：
ＫＣｌ、　０．０２：Ｍｇ５Ｏ＜・７１１，０゜０．０
２；酵母エキス、　０，０５；糖、１．０培地２１．カ
ゼイン、０．５；バクト寒天、　　１．５；酵母エキス
１０．５；ブドウ糖、　　１．０；に２＋１ＰＯ，、０
，１；Ｍｇ５Ｌ・７Ｎ２０．０．０２ （菌学的性質） （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．５〜１．２μｍＸ１．２〜６．６
μｍの桿菌であり、菌体の準端に円筒形の内生胞子（０
，７〜１．０μｍ　ｘｌ、５〜２．５μｍ　）を作る。

周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は陽性。

（ハ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良好。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁も円滑である。又集落の色調は乳白色で光沢があ
る。

■　肉汁液体培養（°培地２） 生育良好。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良好。ゼラチンの液化が認められた。

■　ＩＪ　）マスミルク培地（培地４）ミルクの凝固、
ペプトン化は認められない。

又、ＩＪ　）マスの変色は培地がアルカリ性のため判定
できない。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）硝酸塩の還元
は陽性。脱窒反応は陰性。

■　ＭＲテスト（培地６） 陰性、陽性は判定できない。

■　ＶＰテスト（培地６） 陽性。

■　インドールの生成（培地７） 陰性。

■　硫化水素の生成（培地８） 陰性。

■　澱粉の加水分解（培地９） 陽性。

■　クエン酸の利用（培地１０．Ｌｌ）コーサ培地で陽
性。クリステンセン培地では、陰性、陽性は判定できな
い。

■　無機窒素源の利用（培地１２） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。

■色素の生成（培地１３．１４） キングＢ培地で黄色色素を生成する。

■　ウレアーゼ（培地１５） 陰性。

■　オキシダーゼ（培地１６） 陽性。

■　カタラーゼ（培地１７） 陽性。

■　生育の範囲（培地１８） 生育の温度範囲は２０〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３７℃。生育のｐＨ範囲はｐＨ７〜１１、生育最適
ｐＨはｐＨ１０，５であった。

■　酸素に対する態度 好気性。

■　Ｏ−Ｆテスト（培地１９） アルカリ性のため、変色は判定できない。好気状態での
み生育する。

■　糖の利用性（培地２０．＋：生育する、：生育せず
） １、　　Ｌ−アラビノース　　　＋ ２、　　Ｄ−キシロース　　　　＋ ３、　　Ｄ−グルコース　　　　＋ ４、　　Ｄ−マンノース　　　　＋ ５、　　Ｄ−フラクトース　　　＋ ６、　　Ｄ−ガラクトース　　　＋ ７、麦芽糖　　　　　　　　十 ８、ショ糖　　　　　　　　　　十 ９、乳糖　　　　　　　　　十 １０、トレハロース　　　　　　＋ １１、Ｄ−ソルビット １２、Ｄ−マンニット　　　　士 １３、イノジット　　　　　　→− １４、グリセリン　　　　　＋ １５、デンプン　　　　　　　　士 ■　食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）食塩濃
度が７％で生育良好。

１０％で生育せず。

■　カゼインの分解（培地２１） 陽性。

■　Ｇ＋Ｃ含景（Ｔｍ法） 本発明にかかる菌のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は約３７、７　
ｎｏ１％である。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ・
マニュアル・オブ・システィマティク・バクテリオロジ
ー（［３ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻お
よびザ・ジーナス・バチルス（′″Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ
　Ｄａｃｉｌｌｕｓ”　Ｒｕｔｈ、Ｂ。

Ｇｏｒｄｏｎ、　　八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ　　　Ｎｏ、４２７゜Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、Ｕ、Ｓ、Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，、（１９７３））を参照
し、比較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｈの一種であるとδ忍めら
れる。しかし、本菌株は中性領域では生育できず、専ら
アルカリ領域で良好な生育を示すことから、最近、Ｈｏ
ｒｉｋｏｓｈｉと八ｋｉｂａ（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉ
ｃＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”、Ｊａｐａｎ　　５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ　　５ｏｃｉｅｔｙＰｒｅｓｓ　（Ｔ
ｏｋｙｏ）、　１９８２年刊）の主張している、所謂好
アルカリ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）細菌に属し、
従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。

そして、本菌株の上記菌学的性質は、公知の好アルカリ
性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規菌
株と判断して、バチルス・エスピーＫＳＭ−６４と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第
１０４８２号（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０４８２）として寄託
した。

本発明アルカリセルラーゼを製造するには、例えばＣＭ
Ｃ・アーゼ活性を測定してアルカリセルラーゼ生産菌を
選択し、これを培養し、その培養物から該アルカリセル
ラーゼを取得する方法が挙げられる。

更に本発明のアルカリセルラーゼは、例えば、上記の好
アルカリ性バチルス・エスピー　ＫＳＭ−６４（ＦＢＲ
Ｍ　Ｐ−１０４８２）及びこれより誘導された高力価の
当該酵素生産性を有する各種突然変異株を用いる発酵法
により製造することができる。

上記の菌株を用いて本発明のアルカリセルラーゼを得る
には、適当な培地に該菌株を接種し、常法に従って培養
すれば良い。培養培地としては、資化し得る窒素源と炭
素源を適宜組み合わせて含有せしめたものが使用される
。この炭素源及び窒素源については、特に制限はない。

例えば、窒素源としては、硝安、硫安、塩安、リン酸ア
ンモニウム、硝酸ソーダ、コーングルテンミール、大豆
粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、
ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン
、バイブロ、アジパワー　コーンソイビーンミール、コ
ーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター　アジプロン、ゼ
ストなどが；また、炭素源としては、籾殻、麩、濾紙、
−絞紙類、おが屑等の植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、Ｃ
ＭＣ、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、
リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽１３１４
、蔗ａ、乳糖、）レバロース、マンニット、イノジット
、グリセリン、澱粉、酢酸、クエン酸などが挙げられる
。その他に、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋Ｍｎ”　　Ｚ
ｎ”、　Ｃｏ”、　Ｎａ”　、　Ｋ”などの無機塩や、
必要であれば、無機、有機微量栄養源を添加することも
できる。

斯くして得られた培養物からの目的物質であるアルカリ
セルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精
製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分離又
は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養物から
除去して粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液は
、そのまま使用することもできるが、必要に応じて塩析
法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素を得
、さらに公知の方法により精製結晶化して、Ｍ製酵累と
して使用することも可能である。

次に、斯くして得られる本発明の新規酵素、アルカリセ
ルラーゼに−６４の酵素学的性質について説明する。

なお酵素活性の測定は、以下の方法に従って行った。

（１）　ＣＭＣアーゼ活性 ２．５％ＣＭＣ（サンローズへＯＩＬ、山陽国策パルプ
社製）０．４ｍＡ、５００ｍＭ　　グリシン緩衝液（ｐ
ｉｔ９）０．２ｍＡ、及び脱イオン水０．３ｍＩ！から
なる基質溶液に酵素液０．１＋ｎｊ！を加え、３０℃で
、２０分間反応させた。反応後、３．５−ジニトロ−サ
リチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉ
ｃ　ａｃｉｄ（１）ＮＳ））法にて、還元糖の定量を行
った。即ち、反応液１．０ｍβにＤＮＳ試薬１．０ｍｆ
ｆ１を加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後
、４．Ｏｍβの脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５
ｎｍで比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μｍｏ
ｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１
単位とした。

尚、用いた緩衝液は、次の通りである。

９Ｈ３〜８　マクイルバイン緩衝液 ｐＨ８〜１１　　グリシン−水酸化す）　ＩＪウム緩衝
液ｐ　１１１２〜１３　　塩化カリウム−水酸化ナトリ
ウム緩衝液 （２）　　ｐ−ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニト
ロフェニルセロビオ゛シト分解活性 ０．８μｍｏｌ　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シ
グマ社製）又はｐ−ニトロフェニルグルコシド（シグマ
社製）と５０μｍｏｌ　　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７．０
）又は１００μｍｏｌグリシン緩衝液（ｐＨ９）とを含
有する反応液１．０＋ｎｊ！中に適当量の酵素液を３０
℃で作用させた後、Ｉ　Ｍ　ＮａｚＣＯｉを０．４ｍｌ
加え、遊離するｐ−二トロフェノールを４１０ｎｍで比
色定量した。酵素力価は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニ
トロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）　　アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セル
ロール及び濾紙分解活性 １０ｍｇアビセル（メルク製社）及び１０（）μｍｏｌ
グリシン緩衝液（ｐＨ９）を含有する反応液１．０ｍβ
中に適当量の酵素を加え、３０℃で２８（）ｒｐｍで振
盪しながら反応させた。反応後、ＤＮＳ法にて還元糖の
定量を行った。酵素力価は、１分間に１μｍｏｌのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とし
た。

その他の活性も、」二記の方法に準じて行った。

基質としては、東洋濾紙社製のセルロース粉末、セルラ
ーゼ活性検定用濾紙（東洋Ｎ０５１−特）及び、富国等
の方法（Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｊ、　
Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　５２．２３５．１．９７４）に従
って処理したアルカリ膨潤セルロース、リン酸膨潤セル
ロースを使用した。

（４）　　β−１，３−；１．４−グルカナーゼ゛、β
−１，３−グルカナーゼ活性 β−１，３−，１，４−グルカナーゼ、β−１，３−グ
ルカナーゼ活性は、基質としてリケナン（ｆｒｏｍ第１
表 て、（３）に準じて活性を測定した。

（酵素学的性質） （１）作用 ＣＭＣ、セルロース粉末、アビセル等の繊維素によく作
用し、これらを溶解せしめ、還元糖を生成する。

（２）基質特異性 本酵素の基質特異性の一例を第１表に示した。

本酵素は、ＣＭＣの他にも、β−１，３−；１，４−グ
ルカンであるリケナンに非常に高い氷解活性を有し、β
−１，３−グルカンであるラミナリンにも作用した。ま
た、濾紙、ｐ−ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニト
ロフェニルセロビオシドニ対シて若干の活性を有してい
た。

以下余白 ＊ｐ−ニトロフェニルセロビオシド 本木本−ニトロフェニルグルコシド （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ ＣＭＣに対する作用ｐｌ＋範囲は、３〜１　３．　０と
広範囲であり、至適作用ｐＨは、８．５〜１０である。

また、７．０〜１２．０の範囲に於いても至適ｐＨに於
ける活性の５０％以上の相対活性を有する（第１図）。

（４）　　ｐｔ１安定性 それぞれのｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性
を測定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐＨ５，０
〜１０．５の範囲で極めて安定であり、ｐＨ３，０〜１
１に於いても約５０％以上の活性を維持する（第２図）
。

（５）作用温度及び至適温度 本酵素は、１０〜７０℃の広範囲で作用し、その至適温
度は、５０℃である。又、３５〜６０℃の範囲に於いて
も至適温度での活性の５０％以上を有する（第３図）。

（６）温度安定性 グリシン−Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液（ｐｔ１９．０　）中で
、各温度で１０分間加熱処理後の残存活性を測定した結
果、本酵素は、５０℃でもほとんど失活せず、５５℃に
於いても約５０％の残存活性を有していた（第４図）。

（７）分子量 本酵素は、バイオゲルＡ０．５ｍ（バイオラッド社製）
を用いたゲル濾過法によれば、約１８±１万及び８．０
±０．２万にＣＭＣを基質とした場合の活性ピークを有
する。

（８）　　金属イオンの影響 各種金属イオン（Ｎ　ａ　＋、　Ｋ　＋　、　Ｃａ　２
　＋　、　Ｃｕ　２　＋　　Ｃｏ　２　＋Ｃｄ２＋、　
）４ｎ２＋２　ｈ２＋、　Ｂａ２＋、　ｐＢ２＋、　Ｈ
ｇ２＋、　＋７８２４゜ｐｂ２＋、　Ｚｎ’Ｚ八β３へ
、　ｐｅ３＋）を活性測定時に共存させてその影響を検
討した結果、Ｈｇ”　（ｌ　ｍＭ）の添加は、阻害効果
を与え、Ｃｏ２＋、Ｍｎ”　（ｌ　ｍＭ）の添加は、活
性化効果を与えた。

（９）界面活性剤の影響 本酵素は、０．０５％の各種界面活性剤（例えば、ＬＡ
Ｓ　　、　　　ＡＳ　　、　　ＵＳ、　　八〇Ｓ　１　
α−３ＦＢ　　Ｓ　ＳＡＳ　１　石鹸、ポリオキシエヂ
レンセカンダリーアルキルエーテル、５Ｏ３）の酵素活
性の阻害は認められなかった。

α１　プロテアーゼの影響 洗剤用プロテアーゼ、例えば、ＡＰＩ−２１（昭和電工
）、マクサターゼ（ＩＢＩＳ）　、サビナーゼ、アルカ
ラーゼ、エスペラーゼ（ノボ）を活性測定時に共存（０
，２八［１／β）させ、その影響を調べたところ、何れ
のプロテアーゼに対しても強い耐性を有することが判っ
た。

αＤ　キレート剤の影響 キレート剤であるＢＤＴＡ、　［３ＧＴＡ、　　）リボ
リリン酸ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に
共存させ、その影響を検討したが、阻害は、認められな
かった。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼに−６４は、至適ｐＨが８
．５〜１０であり、ｐＨ７，０〜１２．０の範囲におい
ても至適１１Ｈにおける活性の５０％以上の相対活性を
有し、ｐＨ５，０〜１０，５の範囲において極めて安定
である。更に界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等
の洗浄剤配合成分によっても殆ど阻害を受けず、洗浄剤
組成物の配合成分として有利に使用できるものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 栃木県那須郡の土壌を薬匙−杯（約０．５ｇ）とり、滅
菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した。

この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地
（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日
間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの溶
解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣアー
ゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地
に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心
分離した上清液について、ＣＭＣアーゼ活性をｐｔ１３
〜１３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌を選択し
た。

ｐＨ約１０ ｐＨ約１０ 上述の方法により、本発明のＫＳＭ−６４菌（ＰＥＲＭ
　Ｐ−１０４８２）を取得することができた。

実施例２ 実施例１で得たバチルス・エスピーＫＳＭ−６４菌を実
施例１の液体培地Ｂに接種し、３０ｔで３日間振盪培養
した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液とし
た。更に、通常の方法に従って、エタノール乾煙粉末と
し、セルラーゼ酵素標品（第２表）を得ることが出来た
。

βのＣＭＣアーゼ活性が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアルカリセルラーゼの（：　Ｍ　Ｃ
に対する反応ｐＨと相対活性との関係を示す図面、第２
図は、ＣＭＣに対する処理ｐＨと残存活性との関係を示
す図面、第３図は、本発明アルカリセルラーゼの反応温
度と相対活性との関係を示す図面、第４図は、処理温度
と残存活性との関係を示す図面である。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の物理化学的性質を有するアルカリセルラーゼＫ
   −６４。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース、
   濾紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解
   せしめ、還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロー
   ス、アビセル、濾紙、ｐ−ニトロフェニルグルコシド及
   びｐ−ニトロフェニルセロビオシドに対する活性を有す
   る。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ ＣＭＣに対する作用ｐＨ範囲は、３〜１３．０である。 至適ｐＨは、８．５〜１０．０であり、７．０〜１２．
   ０の範囲においても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上
   の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ＣＭＣを基質とした場合、ｐＨ５〜１０．５で極めて安
   定で失活せず、ｐＨ３〜１１においても、約５０％以上
   の活性を維持する。 （５）最適温度 ＣＭＣに対する作用温度は、１０〜７０℃の広範囲にわ
   たり、その至適温度は、５０℃である。又、３５〜６０
   ℃の範囲に於いても、至適温度での活性の５０％以上を
   有する。 （６）分子量 ＣＭＣを基質とした場合、約１８±１万及び８．０±０
   ．２万に活性のピークを有する（バイオゲルＡ０．５ｍ
   を用いたゲル濾過法による）。 （７）金属イオンの影響 ＣＭＣを基質とした場合、Ｈｇ＾２＾＋により阻害され
   、Ｃｏ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋により活性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＣＭＣを基質とした場合、直鎖アルキルベンゼンスルホ
   ン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル
   スルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、２−スル
   ホ脂肪酸塩、二級アルカンスルホン酸塩、ドデシルスル
   ホン酸塩、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダリーアル
   キルエーテルは活性を殆ど阻害しない。 （９）プロテアーゼの影響 ＣＭＣを基質とした場合、プロテアーゼに対して耐性を
   有する。 （１０）キレート剤の影響 ＣＭＣを基質とした場合、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン
   酸、トリポリリン酸ソーダ、ゼオライトは活性を阻害し
   ない。 ２、バチルス属に属し、アルカリ培地で生育するアルカ
   リセルラーゼＫ−６４生産菌。 ３、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｋ
   ＳＭ−６４と命名され、微工研菌寄第１０４８２号とし
   て寄託された請求項２記載のアルカリセルラーゼＫ−６
   ４生産菌。４、バチルス属に属し、アルカリ培地で生育
   するアルカリセルラーゼＫ−６４生産菌を培養し、その
   培養物からアルカリセルラーゼＫ−６４を取得すること
   を特徴とするアルカリセルラーゼＫ−６４の製造法。