JPH01296980A - 微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼを産生ずる、バチル
ス属に属し、中性培地に生育する微生物に関する。

〔従来の技術〕

繊維累分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されてき
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シコウドモナ
ス属、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス属
等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアクチ
ノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかしな
がら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的規
模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６〇−３６２４０号公報）。しか
し、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼのほ
とんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵
素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類
されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合する
ための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ領
域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有する
、所謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼ
の存在は、極めて少ないのが実情である。ここでアルカ
リセルラーゼとは、至適ＰＨがアルカリ領域にあるもの
を言い、アルカリ耐性セルラーゼとは、至適ｐＨは中性
から酸性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至適ｐ
ｌ＋に於ける活性に比較して十分に活性を有しかつ安定
性を保持するものを言う。また、中性とはｐＨ６〜８の
範囲を言い、アルカリ性とはこれより高いｐ１１範囲を
いう。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生
産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養に
よりセルラーゼ八を採取する方法（特公昭５０−２８５
１５号公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細
菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−八を生産する
方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ
性バチルスＮα１１３９を培養してカルボキシメチルセ
ルラーゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、　Ｆ、。

にｕｄｏ、　Ｔ、　　ａｎｄ　ｌ１ｏｒｉｋｏｓｈｉ、
　　に、、　　Ｊ、　　Ｇａｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ−
１３１、３３３９，（１９８５））及びストレプトマイ
セス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方
法（特開昭６１−１９４８３号公報）が報告されている
に過ぎず、しかもいずれも工業的醗酵生産に適うもので
は無かった。

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一種で
あるバチルス　エスピー　ＫＳＭ−６３５（ｌ１ａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、　　ＫＳＭ−６３５）　　（Ｆ　ＥＲ
ＭＰ−８８７２）が衣料用洗浄剤配合成分として適した
アルカリセルラーゼＫを収率良く生産すること及び更に
培養条件を選択することにより、より生産性が高まり、
アルカリセルラーゼの工業的醗酵生産が可能となること
を見出した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記バチルス　エスピー　ＫＳＭ−６３
５の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えな
い。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、Ｉ】（１を
アルカリ性に保ち続ける必要があるが、現在までのとこ
ろ、好アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性醗酵法の
歴史は浅く、通常の中性微生物と比較するとこれら好ア
ルカリ性微生物の生理、生化学についての知見は充分に
蓄積されておらず、工業的醗酵生産を行うにあたっての
培地調製、培養方法が操作上の難点とな、っていた。

更に、前述した報告例のうち、至適ｐＨがアルカリ領域
にある本来のアルカリセルラーゼとしては、バチルス　
Ｎ１菌株、Ｎ２閑株、Ｎ３菌株（特公昭５０−２８５１
５号公報）の生産する、至適Ｉ〕１１がそれぞれ８〜９
．９．８〜９の酵素、バチルスＮα１１３９の産生する
、至適ｐ１１９のもの及びバチルス　エスピー　ＫＳＭ
−６３５の産生ずる至適ｐＨＩＯのアルカリセルラーゼ
Ｋ（特願昭６１−２５７７？Ｇ号）が存在するが、更に
洗浄剤組成物に配合し用いることのできる至適ｐ＋＋が
アルカリ側にあり、かつその作用ｐ　Ｈ範囲の広いアル
カリセルラーゼの提供が求められていた。

〔問題点を解決するだめの手段〕

斯る実情において本発明者らは中性培地で生育し、しか
も作用の優れた゛ｒアルカリセルラーゼ産生することの
できる菌株を得べく種々研究をおこなった。

かかる問題点を解決するには、中性領域で生育する菌株
を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニン
グする、所謂遺伝子組換えの手法を取ることも可能であ
るが、アルカリ領域に至適ｐｉを有するアルカリセルラ
ーゼを生産する中性微生物を自然界に探索し、これを分
離することがより有効である。しかして、本発明者らは
上記微生物を自然界に求めた結果、−群のバチルス属に
属する微生物は中性培地において生育するにもかかわら
ず、一定のアルカリセルラーゼを産生ずることを見出し
、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、バチルス属に属し、中性培地で生
育し、次の酵素学的性質を有するアルカリセルラーゼを
生産する微生物を提供するものである。

（１）　　ｐｌ＋７〜１０の広い至適ｐ＋＋範囲を有し
、その最適ｐＨはｐＨＩＯ近傍である。

（２）　　ｔｌ　ｇ　２＋の存在により、その活性が阻
害され、Ｃａ２＋の存在により活性化される。

（３）　　プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤で
ほとんどその活性は阻害されない。

（４）　　ＣＭ、Ｃアーゼ活性（Ｃつ活性）を主活性と
し、濾紙崩壊活性やアピセラーゼ活性（Ｃ。

活性）をも有する。

斯かるアルカリセルラーゼを産生ずる本発明の微生物と
しては、本発明者が栃木県芳賀郡の土壌より分離し、工
業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した、バチルス　
エスピー　ＫＳＭ−５２１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９００９
）が挙げられる。

この菌株は、下に示すような菌学的性質を示す。

なお、菌株の分類には、次に示す１〜２５の培地を用い
た。（表示は、重量％） 培地１．　肉エキス、１．０；バクトペブトン。

１、Ｑ　；　　ＮａＣｌ１．　０．５　；バクト寒天。

１、５　（ｐＨ１７，２） 培地２．　肉エキス、１．０；バクトペブトン。

１、０　；　　ＮａＣＲ、０，５（ｐＨ７，２）培地３
．　肉エキス、１．０；バクトペブトン。

１、０　；　　ＮａＣｊ！、　　０．５　；ゼラチン、
１．０（ｐＨ７，２） 培地４．　　バタトリトマスミルク、１０．０培地５．
　バタトペブトン、　　１．０　；　　ＫＮＯ，、０，
１培地６．　バタトペブトン、　　１．　Ｏ：　　Ｎａ
ＮＯ３，１，０培地７．　バタトペプトン、　Ｏ，？　
；　　ＮａＣＡ、　０．５　；ブドウ糖、　　０．５　
　（ｐＨ７，０）培地８．　バタトベブトン、１．０ 培地９．　　ＴＳＩ寒天（栄研化学製）二指水量培地１
０．　　肉エキス、１．０．バタトペブトン。

１、　Ｏ；　　ＮａＣ１，０，５；可溶性澱粉。

０．２；寒天、１．５ 培地１１．　　ＮａＮＨ，１ＩＰＯ，’　４１（２０、
０，１５；　ＫＩｌ、ＰＯ，。

０、１　；　Ｍｇ５Ｏｓ　　・７１１．０　、０．０２
　；クエン酸ナトリウム、　　０．２５　　（ｐＨ６，
８）培地１２．　　　クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅ
ｒ＋５ｅｎ）培地（栄研化学製）：指示量 培地１３．　　ブドウ糖、　　１．　Ｏ；　　ＫＩＩ２
ＰＯ，、０，１；Ｍｇ５Ｏｎ　　・７１（，０、０，０
５；　ＫＣ，１、０，０２；窒素源、　０．　］、　　
（ｐＨ７、２）窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸ア ンモニウムを用いた。

培地１４．　　キングΔ培地“栄研”　（栄研化学製）
　：指示量 培地１５．　　キングＢ培地“栄研”　（栄研化学製）
　：指示量 培地１６．　　尿素培地“栄研”　（栄研化学製）：指
示量 培地１７．　　チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙
（日永製薬製） 培地１８．３％過酸化水素水 培地１９．　　　ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）：指
示量培地２０．　　　（Ｎｌ＋４）２１１ＰＯ，、０，
１；　　に［：Ｃ０，０２；Ｍｇ５Ｏｎ　　・７１１．
０　、０．０２　：酵母エキス。

０、０２　；バクト寒天、２．０；ＢＣＰ（０，２％溶
液）、０゜４ 培地２１．　　バクト・サブロー・デキストロース寒天
培地（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量 培地２２．　　肉エキス、０．３；バクトベブトン。

０．５；酵母エキス、１．０；グリセリン。

２．０ 培地２３．　７エニルアラニンマロン酸塩培地（日永製
薬社製）：指示量 培地２４．　　スキムミルク、５．０；バクト寒天。

１．５ 培地２５．　　肉エキス、０．３．バクトペブトン。

０．５；Ｌ−チロシン、０．５．バクト寒天、１．５ （菌学的性質） （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．６〜０．８μｍ　Ｘ　１．０〜２
．０μｍの桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形
の内生胞子（０，４〜０．８μｍ　Ｘ　１．０〜２、０
μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。

ダラム染色は陽性。抗酸性はない。

（ｂ）　　各種培地に於ける生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（培地１） 良く生育する。集落の形状は円形であり、表面は円滑、
周縁は円滑又は葉状である。又、集落の色調は淡黄色半
透明で光沢がある。

■　肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半透
明である。

■　肉汁液体培養（培地２） 生育し混濁する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。

■　リドマスミルク培地（培地４） ミルクの液化が認められ、リドマスの変色は認められな
い。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５．６）共に、陰
性。

■　ＭＲテスト（ｔ８地７） 陽性。

■　ＶＰテスト（培地７） 陽性。

■　インドールの生成（培地８） 陰性。

■　硫化水素の生成（培地９） 陰性。

■　澱粉の加水分解（培地１０） 陰性。

■　クエン酸の利用（培地１１．１２）クリステンセン
培地で陽性、コーサ培地では陰性か陽性か特定できない
。

■　無機窒素源の利用（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに陰性。

■　色票の生成（培地１４．１５） 陽性。

■　ウレアーゼ（培地１６） 陰性。

■　オキシダーゼ（培地１７） 陰性、陽性は、はっきりせず。

０　カタラーゼ（培地１８） 陽性。

■　生育の範囲（培地２） 生育の温度範囲は１０〜５０℃で、生育最□適温度範囲
は２０〜４０℃である。

生育のｐＨ範囲はｐＨ５〜１０、生育最適ｐ！（範囲は
ｐｕｅ〜ｌＯである。

■　酸素に対する態度 好気性。

■　Ｏ−Ｆテスト（培地１９） 酸化。

［相］　糖類からの酸及びガスの生成（培地２０）（＋
：生成、−二生成せず） 酸の生成　ガスの生成 １、　Ｌ−アラビノース　　　＋　　　　−２、Ｄ−キ
シロース　　　　十　　　　−３、Ｄ−グルコース　　
　　十　　　　−４、Ｄ−マンノース　　　　十　　　
　−５、フラクトース　　　　　＋　　　　−６、Ｄ−
ガラクトース　　　＋　　　　−７、麦　　芽　　糖　
　　　　　　　　　〜−−８、シ　　ヨ　　糖　　　　
　　　　　　＋　　　　　　　−９、乳　　　　　糖　
　　　　　　　　　−−１Ｏ，トレハロース　　　　　
　十　　　　−１１、Ｄ−ソルビット　　　　　−− １２、Ｄ−マンニット　　　　十　　　　−１３、イノ
ジット　　　　　　　−　　　　−１４、グリセリン　
　　　　　　　十　　　　　−１５、デンプン　　　　
　　　　−　　　　−０■Ｐ培地に於けるｐＨ（培地７
） ｐＨ５，０ ■　食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）５％、
７％および１０％ＮａＣＩ！存在中でいずれも生育する
。

＠ｌ　　ｐＨ５，７に於ける生育（培地２１）生育する
。

［相］　ジハイドロキシアセトンの生成（培地２２）陰
性。

■　フェニルアラニンの脱アミノ化（培地２３）陰性。

■　カゼインの分解（培地２４） 陽性。

■　チロシンの分解（培地２５） 陰性。

以上の分類学的考察から判断して、ＫＳＭ−５２１株は
容易に有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
）属の一種であると認められる。

そして更に、菌学的性質について、バーシーズ・・マニ
ュアル・オブ・ディタミネイティブ・バタテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒ　ｉｏｌｏｇｙ）第８
版及びザ・ジーナス・バチルス（“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　”　Ｒｕｔｈ、　Ｂ、　Ｇｏｒｄ
ｏｎ八ｇｒｉｃへｌｔｕｒｅ　　１ｌａｎｄ−ｂｏｏｋ
　　Ｎａ　４　２　７　、　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃａ　、　１１．Ｓ、
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　
　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　　ロ、Ｃ０，（１９７３）　
　）　　を参照し比較、検索すると、この菌株は、最近
、掘越と秋葉（１′　Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ″。

Ｊａｐａｎ　　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　　Ｉ’ｒｅｓｓ　　（Ｔｏｋｙｏ）。

１９８２年刊）の主張している、所謂好アルカリ性（Ａ
ｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物、すなわちｐＨ８以上
のアルカリ培地に於いて生育し、これ以下の中性ｐＨ領
域では生育出来ない微生物に属するものでなく、弱酸性
領域からアルカリ領域（ｐＨ５〜１０）に於いて生育可
能な、−船釣な中性で生育するバチルス属微生物と判断
できる。

更にこの菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較する
と、最も類縁の種としてバチルス・プミルス（口ａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ　）が挙げられる。しかしな
がら、公知のバチルス・プミルスに属する菌株と本菌株
とを比較すると、上記公知菌株は少なくともアルカリセ
ルラーゼを産生じないので、本菌株は新菌株と判断され
る。

上記したような本菌株を用いてアルカリセルラーゼを得
るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すれば
良い。培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当
量含有せしめておくことが好ましい。この炭素源及び窒
素源については特に制限はないが、その例としては、窒
素源としてコーングルテンミール、大豆粉、コーンスチ
ープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディ
ア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、バイブロ、ア
ジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕、綿実
油粕、カルチベータ、アミフレックｘｐｋ−びアジブロ
ン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。又、炭素源
としては、籾殻、麩、濾紙、一般紙類、おが屑等の植物
繊維質、廃糖蜜、転化ｕ、ＣＭＣ，アビセル、セルロー
ス綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、
例えば、アラビノース、グルコース、マンノース、フラ
クトース、麦芽糖、ショ糖、マンニット、ソルビット、
イノジット、グリセリン、可溶性デンプンや資化し得る
有機酸、例えば、クエン酸や酢酸などが挙げられる。ま
た、その他、リン酸、Ｍｇ　２　＋　、　Ｃａ　２　＋
。

Ｍｎ　２　＋　、　　Ｚ　ｎ　２　＋　、　　（ｏ　２
　＋　、　　Ｎ　ａ　＋、　　に“　等の無機塩や、必
要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜転化
することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リセルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び
精製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分離
又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養液か
ら除去して粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液
は、そのまま使用することもできるが、必要に応じて、
塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素
を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製酵素
として使用することも可能である。

斯くして得られたアルカリセルラーゼの代表的なものと
しては、アルカリセルラーゼに−５２１ど命名されたも
のが挙げられ、以下このものを例に取り本発明を更に説
明する。

なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行い、次
の緩衝液を用いた。

１１１３〜８　　マクルベイン緩衝液 ｐ）１８〜１１　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ｍｇ　　ＣＭＣ（Ａ−０１Ｌ、山間国策バルブ社）
、１００μｍｏｌ各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、
グリシン−ＮａＯＨ等）を含む基質溶液０．９　ｍ　ｌ
に０．１　ｍ　ｊ！の酵素溶液を加え、３０℃、２０分
反応した。反応後、３．５−ジニ）。

−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙ
ｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法にて還元糖の定量を行
った。すなわち、反応液、１．０　ｍ　ｌにＤＮＳ試薬
１．　Ｏｒｎ　ｆ！を加え、５分間、１００℃で加熱発
色させ、冷却後、４．０　ｍ　ｊ？の脱イオン水を加え
て希釈した。

これを波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上
記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当す
る還元糖を生成する酵素量を１単位とし、た。

（２）　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０．
１μｍｏｔ　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ
社）、１００μｍｏ１　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を
含む反応液１．　Ｏｍ　ｉ中に適当量の酵素液を３０℃
で作用させた後、Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ＣＤ＊をＱ、　３ｍ　
ｌ、脱イオン水を１．７　ｍ　１２順次加え、遊離する
ｐ−二トロフェノールを４００ｎｍで比色定量した。酵
素力価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニ
トロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）　　アビセル、セルロース粉末、及び濾紙分解活
性 ２０ｍｇアビセル（メルク社）、２００μｍｏ！リン酸
緩衝液（ｐＨ７、０）を含む反応液２．　Ｏｍ　Ｉｌ中
に適当量の酵素液を加え、３０℃、２５　Ｏｒｐｍで振
とうしながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃
、３０００ｒｐｍ、２０分）を行い、その上清１．０　
ｍ　１を３．５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉ
ｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（Ｄ　Ｎ
　Ｓ　）　）法にて還元糖の定量を行った。セルロース
粉末分解活性はセルロース粉末（東洋濾紙社）を、濾紙
分解活性は濾紙（セルラーゼ活性度検定用濾紙、東洋Ｎ
α５１−特）を用い、アピセラーゼ活性の時と同様に行
った。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌ
のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単
位とした。

（４）セロビアーゼ活性 １０ｍｇ七ロピロビオース東化学社）、１００μｍｏｌ
　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ１７，０）を含む反応液１、０
　ｍ　！！内に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後
、１００℃、２分間処理して酵素を失活させた後、生成
グルコース量をムロターゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ
　Ｃ−Ｔｅ５ｔ　、和光純薬工業社）で測定した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に２μｍｏｌのグルコー
スを生成する酵素量を１単位とした。

（酵素学的性質） （１）　　　作　　用 ＣＭＣ，セルロース粉末、濾紙、アビセル等の繊維素に
よく作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元
糖を生成する。

（２）　　基質特異性 本酵素は、ＣＭＣのほかにも、セルロース粉末、アビセ
ル、濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオシド、セルビ
オースに対する活性を有していた。

（３）　　作用ｐｌ＋及び至適ｐＨ 作用１１１１範囲は、３〜１２．５と極めて広範囲であ
った。最適ｐＨは、７〜１０と幅広＜、ｐＨ１４，５〜
１０．５の範囲に於いても至適ｐ＋＋に於（プる活性の
５０％以上の相対活性を有しており、従って過去に研究
されたアルカリセルラーゼの中でも最も゛ｒルカリ側で
充分活性が発揮される酵素と言える（第１図）。

（４）　　ｐＨ安定性 各々のｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測
定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐｌＩ５〜１２
で極めて安定で失活せず、ｐ＋＋４．５〜１２．５に於
いても、約５０％以上の活性を維持していた。本酵素は
、このように高アルカリ領域に於いても充分に安定であ
る（第２図）。

（５）　　最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であった。又、４５〜６５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた（第
３図）。

（６）温度安定性 至適ｐＨに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存
活性を測定した結果、４０℃では安定しており、５５℃
に於いても約５０％の残存活性を有していた（第４図）
。

（７）分子量 本酵素をセファデックス　Ｇ−１００ （５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１００）によるゲル濾過法
に基づき分子量を測定したところ、約３．１万であった
。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（＾１３“。

Ｆｅコ＋　、　　Ｂａ”　　、　　Ｃａ”◆　、　　Ｃ
ｄ”會　、　　Ｃｏ’◆　　　Ｃｒ　２　＋　　。

Ｃｕ２＋　、　Ｆｅ２＋　、　１１ｇ２＋　、　ｙｎ２
＋　、　ｙｏ２＋　、　Ｈ１２＋。

Ｐｂ”　、　Ｚｎ”　、　Ｌｉ”　、Ｋ”　、　Ｎａ”
　）を活性測定時に共存させて、その影響を検討した（
Ｋ＋。

Ｎａ＋については濃度を５０ｍＭとし、他のイオンにつ
いては、１ｍＭとした）。その結果、１１ｇ２＋で阻害
が、Ｃａ　２　＋により活性化が認められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、ＡＳ。

ＥＳＳＡＯ３，α−３ＦＥＳＳＡＳ、石鹸、ボリオキシ
エチレンヤカンダリアルキルエーテル）の酵素活性に及
ぼす影響を調べた。本酵素を界面活性剤０．０５％溶液
で３０℃、１５分間処理後、活性測定を行った。その結
果、何れの界面活性剤によってもほとんど阻害を受けな
かった。強力なデタージエントであるソデイウム・ドデ
シルサルフェートによっても活性の阻害は認められなか
った。

ＱＧ　　プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ社
）を、活性測定時に共存（０，１ｍｇ／ｍ＋ｊりさせて
その影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対して
も強い耐性を有することがわかった。

ａｔ＋　　キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、　　トリポリリ
ン酸ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に共存
させ、その影響を検討したが、はとんど阻害は認められ
なかった。

〔発明の効果〕

本発明の微生物によって得られるアルカリセルラーゼは
、従来のアルカリセルラーゼに比較して高アルカリ側（
ｐＨｌＯ）に最適ｐＨを有している。

その上、ｐｌ＋７．０〜１０の広範囲に於いて、至適ｐ
Ｈを有しており、更に広い範囲に於いて極めて安定であ
る。

また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄
剤配合成分によってもほとんど阻害を受けない。したが
って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有利に使
用することができるものである。

更に、本発明の微生物は中性で生育するので、好アルカ
リ性菌株と比べ容易にアルカリセルラーゼを工業的に生
産することができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙−杯（約０．５ｇ）、
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した
。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの
溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣア
ーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を液体培地（培地
２）に接種し、３０℃で３日間振とう培養した。培養後
、遠心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、ｐ
ｌ＋３〜１３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌を
スクリーニングした。

上述の方法により、本発明のＫＳＭ−５２１株（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−９００９）を取得することが出来た。

培地１．　　　ＣＭＣ２％ ポリペプトン　　　　　　　０．５　　％酵母エキス　
　　　　　　　０．０５％ＫＨ２ＰＯ，０，１％ Ｎａ、ＩＩＰＯ＝　’　１２Ｈ２００，２５％Ｍｇ５Ｏ
＜・７１１．０　　　　　　　０．０２％ｐｔ１６．８ 培地２．　　ＣＭＣ１％ ポリペプトン　　　　　　　１　　％ 酵母エキス　　　　　　　　０．５　　％に＋Ｉ、ＰＯ
４０，１％ Ｎａｚｌｌｒ’Ｏ，’　１２Ｈ２００，２５％ｐＨ６，
８ 実施例２ 実施例１で得たバチルス　エスピー　ＫＳＭ−５２１株
を同実施例の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振と
う培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素
液を得た。この粗酵素液１１に対してドライアイス−エ
タノール中で、３ｆ！のエタノールを加え、生じた沈澱
を遠心分離し、更に凍結乾繰を行い、乾燃粉末として、
アルカリセルラーゼに−５２１（比活性＊２０単位／ｇ
）９ｇを得た。

＊　酵素活性はｐ１１９に於ける測定値である（以下同
じ）。

実施例３ ＣＭＣを１％ショ糖に代え、ポリペプトンを７％Ｃ３Ｌ
に代える以外は実施例１の液体培地２と同じ組成の培地
にＫＳＭ−５２１株を接種し、３０℃で２日間振とう培
養した。この培養物を遠心分離し、得られた上清のＣＭ
Ｃアーゼ活性を測定したところ１００単位／１であった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルカリセルラーゼに−５２１の酵素反応ｐ
ｉｆと相対活性の関係を示す図面である。 第２図は、同酵素の処理ｐｌと相対活性の関係を示す図
面である。 第３図は、同酵素の反応温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第４図は、同酵素の処理温度と相対活性の関係を示す図
面である。 以　　上 出願人　　　花　　王　　株　　式　　会　　社第１図 反応ｐＨ 第２図 処理ｐＨ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス属に属し、中性培地で生育し、次の酵素学
   的性質を有するアルカリセルラーゼを生産する微生物。 （１）ｐＨ７〜１０の広い至適ｐＨ範囲を有し、その最
   適ｐＨはｐＨ１０近傍である。 （２）Ｈｇ＾２＾＋の存在により、その活性が阻害され
   、Ｃａ＾２＾＋の存在により活性化される。 （３）プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤でほと
   んどその活性は阻害されない。 （４）ＣＭＣ分解活性（Ｃ＿ｘ活性）を主活性とし、濾
   紙崩壊活性とアピセラーゼ活性（Ｃ＿１活性）をも有す
   る。 ２、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳ
   Ｍ−５２１と命名され、微工研菌寄第９００９号として
   寄託された特許請求の範囲第１項記載の微生物。