JPS63279790A - アルカリ耐性セルラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリ耐性セルラーゼ及びこれを産生
ずる微生物に関する。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウトモナ
ス属、セルロモナス属、ルミノコツカス属、バチルス属
等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアクチ
ノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかしな
がら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的規
模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界において従来見出されたセルラーゼのほとん
どは、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵素活
性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類され
るものであって、衣料用洗浄剤配合成分としての必要条
件である、アルカリ領域で最大活性を示すか、あるいは
アルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂アルカリセルラ
ーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。

ここで言うアルカリセルラーゼとは、至適ｐＨがアルカ
リ領域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラーゼとは
、至適１１８は中性から酸性領域にあるが、アルカ・り
領域に於いても至適１）Ｈに於ける活性に比較して充分
に活性を有しかつ安定性を保持するものを言う。

また、中性とはｐＨ６〜８の範囲を言い、アルカリ性と
はそれ以上のＩ）Ｈ範囲をいう。

即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアル
カリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法
としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセ
ルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０−２８５１５号
公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培
養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（
特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バチ
ルスＮＯ，１１３９を培養してカルボキシメチルセルラ
ーゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、Ｆ、　、にｕ
ｄｏ、Ｔ。

ａｎｄ　１ｌｏｒｉｋｏｓｈｉ、に、、　Ｊ、Ｇｅｎ、
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１３１，３３３９゜（１９８
５））及びストレプトマイセス属の一種を用いてアルカ
リセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−１９４８３
号公報）が報告されているに過ぎず、いずれも工業的発
酵生産に適うものでは無かった。

ところが、最近、本発明者らは好アルカリ性微生物の一
種であるバチルス　エスピー（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｔ）
、）ＫＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８７２）が、
衣料用洗浄剤組成物として適したアルカリセルラーゼＫ
を効率良く生産すること、及び更に培養条件を選択する
ことにより、より高収率で、アルカリセルラ−ゼ 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、上記バチルス　エスピーＫＳＭ−６３５
の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、ｐＨをアルカ
リ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好
アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史は
浅く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ
性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積さ
れておらず、工業的発酵生産を行うにあたっての培地調
製、培養方法が操作上の難点となっていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはかかる問題点を解決するためにアルカリ領
域に至適ｐＨを有するアルカリセルラーゼ或いは、アル
カリ領域に於いても、至適ｐＨに於ける最高活性に比較
しても高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼを生
産する中性細菌を得べく、中性領域で生育する菌株を宿
主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニングす
る、所謂遺伝子組換えの手段と併行し、自然界において
該細菌の探索を続けて来た。

そして、その結果、栃木県芳賀郡の土壌から分離した菌
株は、アルカリ側においても充分作用を有し、且つ安定
性を保持する、所謂アルカリ耐性セルラーゼを産生ずる
ことを見出し、本発明を完成した。

本発明において用いられる菌株は、次のような菌学的性
質を有する。なお、以下の分類同定において用いた培地
は次の通りである。

培地　１．肉エキス、　ｉ、ｏ　：バクトベブトン、　
１．０　；　ＮａＱｉｊ。

０．５；バクト寒天、　１．５　（ｐＨ７，２）　　（
表示は、重量％：以下同じ） 培地　２．肉エキス、　１．０　；バクトペプトン、　
１．０　；　Ｈａ（７゜０．５　（ｐＨ７，２） 培地　３．肉エキス、　１．０　：バクトベプトン、　
１．０　：　ＮａＣｐ。

０．５＝ゼラチン、　１．０　（ｐＨ７，２）培地　４
．バタトリトマスミルク、ｉｏ、。

培地　５．バクトペプトン、　１．０　；にＮＯ３，０
，１培地　６．バクトベブトン、　１．０　：　　Ｎａ
ＮＣｈ、　１．０培地　７．バクトペプトン、　０．７
　：ＮａＣ１！、　０．５　ニブドウ糖。

０．５　（ｐＨ７，０） 培地　８．バクトペプトン、１．０ 培地　９．ＴＳＩ寒天（米研化学製）：指示量培地１０
．肉エキス、　１．０　；バクトペブトン、　１．０　
；　Ｈａ（７゜０．５；可溶性澱粉、０．２；寒天、１
．５培地１１．ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２０，０，１
５；ＫＨ２ＰＯ４゜０．１　：ＭＯ８Ｏ４・７Ｈ２０，
０，０２；クエン酸ナトリウム、　０．２５　（ｐＨ６
，８＞ 培地１２．クリステンセン培地（米研化学製）；指示量
培地１３．７ｔ’つ糖、１．Ｏ；ＫＨ２ＰＯａ、　０．
１　：ＭＱＳＯａ　・７Ｈ２０，０，０５；ＫＣｊ！、
　０．０２　：　　窒素源、０．１（窒素源は、硝酸ナ
トリウム及び硫酸アンモニウムを用いた）　　（１）Ｉ
Ｉ　　７．２）培地１４．キングＡ培地パ米研″（米研
化学製）：指示量培地１５．キングＢ培地゛栄研″（米
研化学製）：指示量培地１６．尿素培地゛米研″（米研
化学製）；指示量培地１７．チトクローム・オキシダー
ゼ試験用濾紙（日本製薬製） 培地１８．３％過酸化水素水 培地１９．ＯＦ基礎培地（Ｄ　ｉ　ｆｃｏ社製〉；指示
量培地２０．　　（ＮＨａ　）　２　ＨＰＯａ　、　０
．１　：ＫＣｊ！、　０．０２　：ＭＱＳＯａ・７Ｈ２
０，０，０２：酵母エキス、０．０２；バクト寒天、　
２．０　：　ＢＣＰ　（０，２％溶液）、０．４培地２
１．バクト・サブロー・デキストロース寒天培地（Ｄｔ
ｆｃｏ社製）；指示量 培地２２．肉エキス、０．３：バクトベブトン、０．５
：酵母エキス、　ｉ、ｏ　；グリセリン、２．０培地２
３．フェニルアラニン　マロン酸塩培地（日本製薬社製
）；指示量 培地２４．スキムミルク、　５．０　：バクト寒天、１
．５培地２５．肉エキス、０．３；バクトベプトン、０
．５：Ｌ−チロシン、０．５；バクト寒天、１．５（菌
学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．４〜０．８趨×１．０〜２．０伽
の桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形の内生胞
子（０，４〜０．８　＊　Ｘ　０．８〜１．２趨）を作
る。

周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は陽性。

抗酸性はない。

（ｂ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養　（培地１） 生育状態は弱い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑である。又集落の色調は淡黄色半透明で光
沢がある。

■肉汁寒天斜面培養　（培地１） 生育は弱く、その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半
透明である。

■肉汁液体培養　（培地２） 生育する。特に、上層生育が認められる。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　（培地３） 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。

■リドマスミルク培地　（培地４） ミルクの液化は認められるが、リドマス色素の明確な変
化はない。

（Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５．培地６）共に、
陰性。

■ＭＲテスト　（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ５，２）。

■ＶＰテスト　（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ５，２＞。

■インドールの生成　（培地８） 陰性。

■硫化水素の生成　（培地９） 陰性。

■澱粉の加水分解　（培地１０） 陽性。

■クエン酸の利用　（培地１１．培地１２）コーサ培地
及びクリステンセン培地で、ともに陽性。

■無機窒素源の利用　（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。

■色素の生成　（培地１４．培地１５）陰性。

■ウレアーゼ　（培地１６） 陰性。

■オキシダーゼ　（培地１７） 陽性。

■カタラーゼ　（培地１８） 陽性。

■生育の範囲　（培地２） 生育の温度範囲は、１５〜５０℃、生育最適温度範囲は
２５〜４０℃ 生育のｌ）Ｈ範囲は、ｐＨ５〜１１、生育最適ＩｌＮ範
囲はｔ）Ｈ６−１０であった。

■酸素に対する態度 通性嫌気性。

■Ｏ−Ｆテスト　（培地１９） 好気嫌気共に生育する。

［相］糖の利用性　（培地２０）（＋：利用する、−二
利用しない） １、　　Ｌ−アラビノース　　　＋ ２、　０−キシロース　　　　＋ ３、　　Ｄ−グルコース　　　　＋ ４、　　Ｄ−マンノース　　　　− ５、　　Ｄ−フラクトース　　　士 ６、　０−ガラクトース　　　− ７、麦芽糖　　　　　　　　− ８、ショ糖　　　　　　　　十 ９、乳糖　　　　　　　　　− １０、トレハロース １１、　Ｄ−ソルビット　　　　＋ １２、　Ｄ−マンニット　　　　＋ １３、　　イノジット　　　　　　− １４、グリセリン　　　　　　＋ １５、デンプン　　　　　　　＋ ■ｖＰ培地に於けるｐ］１（培地７） ＝　１３− ｐＨ５，２゜ ［相］食塩含有培地に於ける生育　（改変培地１）５％
で生育する。

７％で生育する。

１０％で生育せず。

＠ｐＨ５，７に於ける生育　（培地２１）生育する。

［相］ジハイドロキシアセトンの生成　（培地２２）陰
性。

０フエニルアラニンの脱アミノ化　（培地２３）陰性。

０カゼインの分解　（培地２４） 陽性。

■チロシンの分解　（培地２５） 陰性。

以上の菌学的性質について、バーシーズ・マニュアル・
オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ　’ｓ　Ｈａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版及び
ザ争ジーナス・バチルス（“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ”　、　Ｒｕｔｈ、　Ｅ、Ｇｏｒｄｏｎ著
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｎｏ、　
４２７　、　ＡＯｒｉＣｔｌｌｔｌＪ−ｒａｌ　　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　　、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆＡａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｗａ
ｓｈｉｎｏｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，（１９７３））を参照し比
較、検索した結果、本発明の菌株は、有胞子桿菌である
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種であると認めら
れる。そして本菌株は、最近、掘越と秋菓（”Ａｌｋａ
ｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｈｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”　、
　ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙ　
Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏｋｙｏ）　、　１９８２年刊）の主張
している、所謂好アルカリ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉ−Ｉ
　ｉｃ）微生物がｐＨ８以上のアルカリ培地に於いて生
育し、これ以下の中性ｐＨ領域では生育出来ないのに対
し、弱酸性領域からアルカリ領域（ｐＨ５〜１１）に於
いて生育が可能である事から、この好アルカリ性微生物
とは明らかに異なるものであり、一般的な中性で生育可
能なバチルス属微生物と判断できる。

更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較すると
、最も類縁の種としてバチルス・リケニホルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げら
れる。しかしながら、公知のリケニホルミスに属する菌
株と本菌株とを比較すると、硝酸塩の還元能において相
異する。更に上記リケニホルミスに属する菌株は少なく
ともアルカリ耐性のセルラーゼを産生しないので本発明
者らは本菌株を新菌株と判断し、バチルス　エスピー　
ＫＳＭ−５７７と命名して工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０１２）。

本発明の菌株を用いてアルカリ耐性セルラーゼ、セルラ
ーゼに−５７７を得るには、培地に該菌株を接種し、常
法に従って培養すれば良い。培地中には、資化し得る炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。この炭素源及び窒素源については特に制限はないが
、その例としては、窒素源として無機態の硝安、硫安、
塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダや、コーングル
テンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、ペプトン、バイブロ、アジパワー、コーンソイ
ビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、
アミフレックス及びアジジブロン、ゼスト、アシックス
などが挙げられる。

又、炭素源としては、籾殻、麩、濾紙、一般紙類、おが
屑などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチ
ルセルロース（ＣＭＣ）、アビセル、セルロース綿、キ
シラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、例えば、
アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース
、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、可
溶性デンプンや資化し得る有機酸、例えば酢酸、クエン
酸等が挙げられる。また、その伯、リン酸、＠ｇ２＋。

Ｃａ”　、　Ｈｎ”　、　Ｚｎ”　、　Ｃｏ２＋　、　
Ｎａ”　、　　Ｋ＋などの無機塩や、必要であれば、無
機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもでき
る。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるセルラ
ーゼに−５７７の採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠心
分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去して粗酵素液を得ることも出来る。この粗酵
素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応じ
て、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗
酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製
酵素として使用することも可能である。

斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼに−５７
７は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵素活
性の測定は、以下の方法に従って行ない、また用いた緩
衝液は次の通りである。

１）８３〜８　　　マクルベイン緩衝液ｐＨ８〜１１　
　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０＃ＩｇＣＭＣ（Ａ−０１１，山陽国策パルプ社）、
１００μｍｏｌ各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グ
リシン−Ｎａ叶等）を含む基質溶８ｕ０．９−に０．１
ｄの酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反応１
．３．５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔ
ｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）法
にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１．０ｄ
にＤＮＳ試薬１．０＃ｌｌ！を加え、５分間、１００℃
で加熱発色させ、冷却後、４．０　ｄの脱イオン水を加
えて希釈した。これを波長５３５　ｎｍで比色定量した
。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。

（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０．１
μｍｏｌ　ｐ−二トロフェニルセ口ビオシド（シグマ社
）　、１００μｍｏｌ　リン酸［ｉ液（ｐＨ７，０）を
含む反応液１．Ｏｄ中に適当量の酵素液を３０℃で作用
させた後、Ｉ　Ｈ’Ｎ８２ＣＯ３を０．３ａｆ！、脱イ
オン水を１．７ｄ順次加え、遊離するｐ−ニトロフェノ
ールを４００　ｎｍで比色定置した。酵素力価は、上記
の条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−二トロフェノール
を遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセル、セルロース粉末、及び濾紙分解活性 ２０Ｆｌアビセル（メルク社）、２００μｍｏｌ　リン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）を含む反応液２．０　ｍ！！中
に適当量の酵素液を加え、３０℃、２５　Ｏｒｐｍで撮
とうしながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃
、３０００ｒｐｍ　、２０分）を行い、その上清１．０
−を３，５−ジニトロ−サリチル酸（３゜５−ｄｉｎｉ
ｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）
法にて還元糖の定量を行った。セルロース粉末分解活性
はセルロース粉末（東洋濾紙社）を、濾紙分解活性は濾
紙（セルラーゼ活性検定用濾紙：東洋Ｎα５１−特）を
用い、アビセラーゼ活性の時と同様に行った。酵素力価
は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに
相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

（４）セロビアーゼ活性 １０ｒＩＩｇセロビオース（関東化学社）、１００μｍ
ｏｌリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）を含む反応液１、Ｏ
ｄ中に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１００
℃、２分処理し酵素を失活させた後、生成グルコース量
をムロターゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔｅ５
ｔ、和光補薬工業社）で測定した。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に２μｍｏｌのグル
コースを生成する酵素量を１単位とした。

（Ｗｌ素学的性質） （１）作用 セルロース、ン戸紙、アビセル、ＣＭＣ等の繊維素によ
く作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖
を生成する。

（２）基質特異性 本酵素はＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル及
び濾紙に対する活性を有していた。

（３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用１）Ｈ範囲は、３〜１２と極めて広範囲にわたる。

最適ｐＨは、７であり、４．５〜１０．５の範囲に於い
ても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有
しており、過去に研究されたセルラーゼの中でも最もア
ルカリ側で作用ｐＨ範囲が広い酵素と言える（第１図）
。

（４）ｐＨ安定性 各々のｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測
定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐＨ５〜１２で
極めて安定で失活せず、ｐＨ４，５〜１２．５に於いて
も、約５０％以上の活性を維持していた。

本酵素は、このように高アルカリ領域に於いても充分に
安定である（第２図）。

（５）最適温度 作用温度は、１５〜７５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であった。又、４０〜６５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以“下を有していたく
第３図）。

（６）温度安定性 至適ｐＨに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存
活性を測定した結果、５０℃では安定しており、５５℃
に於いても約５０％の残存活性を有していた（第４図）
。

（７）分子量 本酵素をセファデックスＧ　−１００（”５ｅｐｈａ−
ｄｅｘ　Ｇ−１００”　）によるゲル濾過法に基づき分
子量を測定したところ、約１．７万と約３．０万に主た
るピークが観察された。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Ｍ３＋、　Ｆｅ３＋
。

Ｂａ２＋　　、　　　（：３２＋　　、　　　Ｃｄ２＋
　　、　　　Ｑ０２＋　、　　　Ｃｒ２＋　　、　　　
Ｃｕ２＋　　、　　　ｌ：６２＋　　。

８ｇ２＋　　、　　　１１２＋　　、　　　）１０２÷
　＊　　　Ｎｔ”　　、　　　Ｐｂ２＋　　、　　　Ｚ
ｎ２＋　　、　　　Ｌｉ”　　　。

に＋、　Ｎａ十）を活性測定時に共存させて１、その影
響を検討したく各種金属イオン濃度は１ｍＭ、　　に＋
。

Ｎａ＋は５０　ｍａｔ”ある）。

その結果、ｌａ２＋で阻害が、Ｃａ２＋　、　Ｃｄ２＋
　、　Ｂ；３２＋。

Ｃｏ２＋により活性化が認められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（゛例えば、ＬＡＳ、Ａｓ、ＥＳ。

ＡＯ８，α−８ＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレ
ンセカンダリーアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす
影響を調べた。界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、１
５分間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの界
面活性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強力
なデタージエントであるソデイウム・ドデシルサルフェ
ートによっても活性の阻害は認められなかった。

（１０）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ社
）を、活性測定時に共存（０，ＩＩｎｇ／ｄ）させてそ
の影響を調べたところ、何れのプロテアーゼによっても
、本酵素がプロテアーゼに対して強い耐性を有すること
がわかった。

（１１）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ゼオ
ライト、トリポリリン酸ソーダを活性測定時に共存させ
、その影響を検討したが、はとんど阻害は認められなか
った。

〔発明の効果〕

本発明のセルラーゼ　Ｋ−５７７は、至適ｐＨを７に有
するにもかかられずアルカリにおいても高い相対活性を
有し、ｐＨ５〜１２に於て極めて安定である。また、界
面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄剤配合成
分によってもほとんど阻害を受けない。したがって、本
酵素は洗浄剤事成物の配合成分として有利に使用するこ
とができるものである。

また、本発明の菌株、バチルス　エスピーＫＳＭ−５７
７は中性で生育する菌株であるので、好アルカリ性細菌
と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを工業的に生産す
ることができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯（約０．５ｇ）を
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した
。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの
溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣア
ーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地２の液体培
地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠
心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、ｐＨ３
〜１３にて測定し、アルカリ耐性セルラーゼ生産菌をス
クリーニングした。

上述の方法により、本発明のバチルス　エスピ−　　Ｋ
ＳＭ−５７７株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０１２）を取得す
ることが出来た。

培地１．　０Ｍ０　　　　　　　　２％ポリペプトン　
　　　　　　　　０．５％酵母エキス　　　　　　　　
　　０．０５％ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｎａ２ＨＰＯａ　・１２１−１２０　　０．２５％ＭＱ
ＳＯａ　・７Ｈ２００，０２％ 培地２．　　ＣＭＣ１％ ポリペプトン　　　　　　　　　１％ 酵母エキス　　　　　　　　　　０．５％ＫＨ２ＰＯ，
ｉ　　　　　　　　　　０．１％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２
１−１２０　　０．２５％ＭＱＳＯａ・７Ｈ２００，０
２％ ｐａｌ　　６．８ 実施例２ 実施例１で得たバチルス　エスピー　ＫＳＭ−５７７を
実施例１の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培
養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を
得た。この粗酵素液１Ｊに対して、ドライアイス−エタ
ノール中で３ｊ！のエタノールを加え、生じた沈澱を遠
心分離し更に凍結乾燥を行ない乾燥粉末としてセルラー
ゼに−５７７９ｇ（比活性２２単位／ｇ：Ｉ）Ｈ９にお
ける測定値以下同じ）を得た。

実施例３ 液体培地２においてＣＭＣを１％蔗糖に、ポリペプトン
を７％Ｃ３Ｌ（コーン・スチープ・リカー）に代えた培
地を用い、実施例２に準じて３０℃で２日間振盪培養し
た。得られた培養液の遠心分離上清についてそのＣＭＣ
アーゼ活性を測定したところ４０単位／１であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素反応ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第２図は、酵素処理ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、酵素処理温度と相対活性の□関係を示す図面
である。 以上 第１図 反応ｐＨ 第２図 処理ｐＨ 第３図 反応温度（Ｑ 第４図 処理温度（６）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の酵素学的性質を有するアルカリ耐性のセルラー
   ゼＫ−５７７。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、セルロース、濾紙、アビ
   セル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、グ
   ルコース等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロースの他にも、セルロース粉末
   、アビセル及び濾紙に対する活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１２である。最適ｐＨは、７であ
   り、４．５〜１０．５の範囲に於いても至適ｐＨに於け
   る活性の５０％以上の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ４．５〜１
   ２．５に於いても、約５０％以上の活性を維持している
   。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜７５℃の広範囲にわたり、その至適
   温度は６０℃である。また、４０〜６５℃の範囲に於い
   ても、至適温度での活性の５０％以上を有している。 （６）分子量 約１．７万と約３．０万に分子量のピークを有する（セ
   フアデツクスＧ−１００を用いたゲル濾過法による）。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋で阻害され、Ｂａ＾２＾＋、Ｃａ＾２＾＋
   、Ｃｄ＾２＾＋及びＣｏ＾２＾＋により活性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
   鹸、ポリオキシエチレンセカンダリーアルキルエーテル
   は、活性をほとんど阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリポリリン酸ソーダ、ゼオライ
   ト、クエン酸は活性を阻害しない。 ２、バチルス属に属し、セルラーゼに−５７７生産性を
   有する微生物。