JPS63240786A - アルカリセルラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼに−５８０に関する
。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
た菌株は多種類にわたり、ブスペルギルス属、ベニ７リ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心ｉｃ　％　シュウ
トモナス属、セルロモナス属、ルミノコツカス属、バチ
ルス属等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモ
アクチノマイセス属等の放線菌でも報告されている。

しかしながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの
工業的規模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼのほ
とんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵
素活性金示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類
されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合する
ための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ領
域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有する
、所謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼ
の存在は、極めて少ないのが実情である。ここでアルカ
リセルラーゼとは、至適ｐＨがアルカリ領域にあるもの
を言い、アルカリ耐性セルラーゼとは、至適ｐＨは中性
から酸性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至適ｐ
ＨＫ於ける活性に比較して十分に活性を有しかつ安定性
を保持するものを言う。また、中性とはｐＨ５〜８の範
囲を言い、アルカリ性とはこれよシ高いｐＨ範囲をいう
。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生
産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養に
よりセルラーゼＡを採取する方法（％公昭５０−２８５
１５号公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細
菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産する
方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ
性バチルスム１１３９を培養してカルボキシメチルセル
ラーゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、Ｆ、、Ｋｕ
ｄｏ、Ｉ。

ａｎｄ　Ｈｏｒｉｋｏａｈｉ、　Ｋ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ
、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

１３１．３３３９．（１９８５））及びストレゾトマイ
セス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方
法（特開昭６１−１９４８３号公報）が報告されている
に過ぎず、しかもいずれも工業的発酵生産に適うもので
は無かった。

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一稽で
あるバチルス　エスピー拾通−６３５（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐ、　ＫＳＭ−６３５）　（ＦＥＲＭＰ−８８７
２）が衣料用洗浄剤配合成分として適したアルカリセル
ラーゼＫを収率良く生産すること及び更に培養条件を選
択することにより、よシ生産性が高まり、アルカリセル
ラーゼの工業的発酵生産が可能となることを見出した。

〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、上記バチルス　エスピーＫＳＭ−６３ｓ
の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、ｐＨをアルカ
リ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好
アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史は
浅く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ
性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積さ
れておらず、工業的発酵生産を行うＫあたっての培地調
製、培養方法が操作上の難点となっていた。

更に、前述した報告例のうち、至適ｐＨがアルカリ領域
にある本来のアルカリセルラーゼとしては、バチルス　
Ｎ１菌株、Ｎ２菌株、Ｎ３菌株（特公昭５０−２８５１
５号公報）の生産する、至適ｐＨがそれぞれ８〜９．９
．８〜９の酵素、バチルス　４１１３９の産生する、至
適ｐＨ９のもの及びバチルス　エスピーＫＳＭ−６３５
の産生する至適ｐ）ＩＩＯのアルカリセルラーゼＫが存
在するが、更に洗浄剤組成物に配合し用いることのでき
る至適ｐＨがアルカリ側にあり、かつその作用ｐＨ範囲
の広いアルカリセルラーゼの提供が求められていた。

〔問題点を解決するための手段〕

斯る実情において本発明者らは中性培地で生育する微生
物の産生ずる、作用の優れたアルカリセルラーゼを得べ
く種々研究をおこなった。

かかる問題点を解決するには、中性領域で生育する菌株
を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニン
グする、所謂遺伝子組換えの手法を取ることも可能であ
るが、アルカリ領域に至適ｐＨを有するアルカリセルラ
ーゼ生産ｍを生産する中性微生物を自然界に探索し、こ
れを分離することがより有効である。しかして、本発明
者らは上記微生物を自然界に求めた結果、栃木県芳賀郡
の土壌より分離した微生物は、上記要望を満すものであ
ることを見出し、本発明を完成した。

本発明のアルカリセルラーゼを産生ずる菌株は、下に示
すような菌学的性質を示す。なお、菌株の分類には、次
に示す１〜２５の培地を用いた。（表示は、重量優） 培ｉ１．肉エキス、１．０；バクトペデトン。

１、　Ｏｉ　ＮａＣｌ、　ｏ、　５　ｉパクト寒天。

１．５（ｐ）Ｉ７．２） 培地２　肉エキス、１．Ｏｉバクトベゾトン。

１．０　；　ＮＪＬ（Ｊ、　０．５　ｉ　（ｐＨ７，２
）培地３．　肉エキス、１．Ｏｉバクトペゾトン。

１、０　；　ＮａＣｘ、　ｏ、　５　ｉゼラチ／、、１
．０（ｐＨ７，２） 培地４．　バクトリトマスミルク、１０．０培地＆　バ
クトペゾトン、　１．　ｏ　；　ＫＮＯ３，０，１培地
６．　バクトベデトンｐ　１．　Ｏ；　ＮａＮＯ３。

１．０ 培地７．　バクトベプトン１０−７　；　ＮａＣ６，０
，５；ブドウ糖、　０．５　（ｐＨ７，０）培地＆　バ
クトペグトン、１．０ 培地９．　　ＴＳＩ寒天（栄研化学製）：指示量培地１
０．肉エキス、１．０；バクトベゾトン。

Ｌ　Ｏ；　ＮａＣＪ、　０−５　；可溶性澱粉。

０．２；寒天、１．５ 培地１１．　　ＮａＮ）ｆ４ＨＰＯ４ａ　４　Ｈ２Ｏ，
０，１５；　ＫＨ２ＰＯ４。

０．１；ＭｇＳＯ４１１７Ｈ２０，０，０２；　　クエ
ン酸ナトリウム、　０．２５　（ｐＨ６，８）培地１２
．クリステ：ｙ　セ：ｙ　（Ｃｈｒｉｓｔｅｎａｅｎ　
）培地（栄研化学ｍ）：指示量 培地１３．ブドウ糖、　１．０　ｉ　ＫＨ２ｐｏ、　、
　０．１　；ＭｇＳＯ４−７Ｈ，０、０，０ｓ　；　Ｋ
Ｉ：ｉ、０．０２　；窒素源、　０．１　（ｐＨ７，２
） 窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸 アンモニウムを用いた。

培地１４．キングＡ培地゛栄研″（栄研化学製）：指示
１ 培地１５．キングＢ培地”栄研”（栄研化学製）：指示
量 培地１６．　　尿素培地“栄研″（栄研化学製ン：指示
量 培地１７．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
永製薬製） 培地１８．３チ過酸化水素水 培地１９．ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量培
ｍ　２０．　　（ＮＨ４）ｚ？ｏ４．０．１　；　Ｋｆ
：：ｔｔ、　０．０２　；Ｍｇ５ｏ４・７Ｈ２０，０，
０２；酵母エキス。

０．０２ｉパクト寒天、　Ｚ　Ｏ；　ＢＣＰ（０，２％
溶液）、０．４ 培地２１．パクト・サブロー・デキストロース寒天培地
（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量 培地２２．肉エキス、０．３ｉバクトベデトン。

０．５；酵母エキス、１．０；グリセリン、２．０ ｊｌｔ１２３．フェニルアラニン　マロン酸塩培地（日
永製薬社製）：指示量 培地２４．スキムミルク、　５．０　；バクト寒天。

１．５ 培地２５．肉エキス、０．３；パクトベｆトン。

０．５；Ｌ−チロシン、０．５；バクト寒天、１．５ （菌学的性質） （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．４〜０．８μｍ　Ｘ　１．５〜５
．０μｍの桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形
の内生胞子（０，４〜０．８μｍ　Ｘ　０．８〜１．２
μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。

ダラム染色は陽性。抗酸性はない。

Φ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培′＃（培地１） 生育状態は弱い。集落の形状は円形又は不規則形であり
、表面は円滑、周縁は円滑又は葉状である。又集落の色
調は淡黄色半透明で光沢がある。

■肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育は弱く、その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半
透明である。

■肉汁液体培養（培地２） 生育する。特に上層部を混濁する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。

■リドマスミルク培地（培地４） ミルクの液化は認められる。又、リドマスの変色は認め
られなかった。

（ｅ）　　生理学的性質 ■硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５，６）共に、陰性
。

■朧テスト（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ５，２）。

■狸テスト（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ５，２）。

■インドールの生成（培地８） 陰性。

■硫化水素の生成（培地９） 陰性。

■澱粉の加水分解（培地１０） 陽性。

■クエン酸の利用（培地１１．１２　）コーサ培地で陰
性、クリステンセン培地で陽性。

■無機窒素源の利用（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに陽性。

■色素の生成（培地１４　、１５　） 陰性。

［相］ウレアーゼ（培地１６） 陰性。

■オキシダーゼ（培地１７） 陽性。

０カタラーゼ（培地１８） 陽性。

０生育の範囲（培地２） 生育の温度範囲は１５〜５０℃、生育最適温度範囲は２
５〜４０℃。

生育のｐＨ範囲はｐＨ５〜１１、生育最適ｐＨ範囲はｐ
Ｈ６〜１０であった。

■酸素に対する態度 通性嫌気性。

［相］０−Ｆテスト（培地１９） 生育するが、好気嫌気共に生育悪し。

［相］糖の利用性（＋：利用する、−二利用しない） １、　　Ｌ−アラビノース　　　　＋ ２、、Ｄ−キシロース　　　　　＋ ３、Ｄ−グルコース　　　　　＋ ４、　　Ｄ−マンノース　　　　　＋ ５、７ラクトース　　　　　　＋ ６、　　Ｄ−ガラクトース　　　　＋ ７、麦芽糖　　　　　　　　　十 ＆　７ヨ糖　　　　　　　　　　　十 ９、乳糖　　　　＋ １０、トレハロース　　　　　　　− １１、　　Ｄ−ソルビット　　　　　　＋ＩＬ　　Ｄ−
マンニット　　　　　＋ 凪　イノジット　　　　　　　＋ １４グリセリン　　　　　　＋ １５、デンプン　　　　　　　　＋ ｏｖＰ培地に於けるｐＨ（培地７） ｐＨｓ、　２ ［相］食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）５粂
で生育する。

７％で生育する。

１０％で生育せず。

＠　ｐＨ５，７に於ける生育（培地２１）生育する。

［相］ゾハイドロキシアセトンの生成（培地２２）陰性
。

［相］フェニルアラニンの脱アミン化（培地２３）陰性
。

Ｏカゼインの分解（培地２４） 陽性。

０チロシンの分解（培地２５） 陰性。

以上の菌学的性質について、パーシーズ・マニュアルー
オブ・デイタミネイティブ・バクテリア１−ｏシー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ　’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）、第８
版及びザ・シーナス自バチルス（Ｔｈｅ　ＧｅｎｕｓＢ
ａｃｉｌｌｕｓ″、　Ｒｕｔｈ、　Ｅ、　Ｇｏｒｄｏｎ
著Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ａ　４
２７　、　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ　Ｄ、　Ｃ，（１９７３）　）を参照し比較、検索
した結果、本発明の菌株は、有胞子桿菌であるバチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種であると認められる。そ
して本菌株は、最近、掘越と秋葉（’　Ａｌｋａｌｏｐ
ｈｉｌｉｃＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉａｍ″、Ｊａｐａｎ
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙＰｒｅｓｓ　
（Ｔｏｋｙｏ　）　、　１９８２年刊）の主張している
、所謂好アルカリ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉ　ｌ　ｉｃ　
）微生物がｐＨ１３以上のアルカリ培地に於いて生育し
、これ以下の中性ｐＨ領域では生育出来ないのに対し、
弱酸性領域からアルカリ領域（ｐＨｓ〜１１）に於いて
生育が可能である事からこの好アルカリ性微生物とは明
らかに異なるものであり、一般的な中性で生育するバチ
ルス属微生物と判断できる。

更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較すると
、最も類縁の種としてバチルス−リケニホルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げら
れる。しかしながら、公知の菌株と本菌株とを比較する
と、硝酸塩の還元能の点に於いて相異する。更に上記公
知菌株は少なくともアルカリセルラーゼを産生じないの
で、本発明者らは本菌株を新菌株と判断し、バチルス　
エスピー　ＫＳＭ−５８０と命名して工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した（　ＦＥＢＭ　Ｐ　−９０１
３）。

上記の菌株を用いてアルカリセルラーゼに一５８０ｔ−
得るには、培地に該菌株を接種し、常法に従って培養す
れば良い。培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を
適当量含有せしめておくことが好ましい。この炭素源及
び窒素源については特に制限はないが、その例としては
、窒素源としてコーングルテンミール、大豆粉、コーン
スチーデリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメ
ディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイゾロ
、アソノＱワー、コーンソイピーンミール、コーヒー粕
、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアゾゾ
ロン、ゼスト、アゾツクスなどが挙げられる。又、炭素
源としては、籾殻、麩、濾紙、−紋紙類、おが屑などの
植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルホキツメチルセルロ
ース（ＣＲＣ）　、アビセル、セルロース綿、キシラン
、ペクチンに加え、資化し得る炭素源、例えば、アラビ
ノース、キシロース、グルコース、カラクトース、マン
ノース、７ラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、マンニ
ット、ソルビット、グリセリン、可溶性デンプンや貴化
し得る有機酸、例えば酢酸やクエン酸などが挙げられる
。また、その他、リン酸、Ｆｉｉｇ”　、Ｃａ”　、Ｍ
ｎ”＋　　、Ｚｎ”＋　、Ｃｏ”十、Ｎａ十、に＋など
の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培
地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるセルラ
ーゼ　Ｋ−５８０の採取及び精製は、一般の酵素の採取
及び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠
心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培
養液から除去して粗酵素液金得ることが出来る。この粗
酵素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応
じて、塩析法、沈澱　（法、限外濾過法等の分離手段に
より粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して
、ａ展酵素として使用することも可能である。

斯くシて得られた本発明のアルカリセルラーゼ　Ｋ−５
８０は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵素
活性の測定は、以下の方法に従って行ない、用いた緩衝
液は次の通りである。

ｐＨ３〜８　　マクルベイン緩衝液 ｐＨ８〜１１　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 酵素活性測定法： １）　　Ｃ１１ｉＣアーゼ活性 １０ＱＣＭＩＩ：　（Ａ−０１Ｌ　、出隅国策／Ｑ　ル
プ社）、１００μｍｏｌ　各種緩衝液（マクルベイン、
リン酸、グリシン−ＮａＯＨ等）（ｉ：含む基質溶液０
．９艷にｏ、　ｉ−の酵素溶液を加え、３０℃、２０分
反応した、反応後、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３
、５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ　
（ＤＮＳ　）　　）法にて還元糖の定量を行った。

すなわち、反応液１．０　ｍＡにＤＮＳ試薬１．０−を
加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．
０−の脱イオン水を加えて希釈した。

これを波長５３５　ｎｍで比色定量した。酵素力価は、
上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当
する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

（２）　　ｐ−二トロフェニルセロビオシド分解活性α
１μｍｏｌ　ｐ−ニトロフェニルセロヒオシド（シグマ
社）、１００μｍｏｌｌＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　
ｆ含む反応液１．０−中に適当量のＣＭＣアーゼを３０
℃で作用させた後、１ＭＮａ２ＣＯ３を０．３−１脱イ
オン水ヲ１．７−順次加、ｔ、遊ｍするｐ−ニトロフェ
ノール’１４００画で比色定量した。酵素力価は、上記
の条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−二トロフェノール
を遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセル、セルロース粉末及び濾紙分解活性 ２０■アビセル（メルク社）、２００μｍｏｌリン酸緩
衝液（ＰＨ７，０）　’に含む反応液２．０１ｎ！。

中に適当量のＣＭＣアーゼを加え、３０℃、２５０　ｒ
ｐｍで振とうしながら作用させた。反応後、冷却遠心分
離（５℃、３０００ｒｐｍ。

２０分）を行い、その上清１．０−を３，５−ジニトロ
−サリチル酸（３、５−ｄｉｎｉｔｒｏ　−５ａｌｉｃ
ｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ　）　　）法にて還元糖
の定ｉを行った。セルロース粉末分解活性はセルロース
粉末（東洋濾紙社）を、濾紙分解活性は濾紙（セルラー
ゼ活性検定用濾紙、東洋墓５ｌ−４１７Ｆ）を用い、ア
ビセラーゼ活性の時と　１同様に行った。酵素力価は、
上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当
する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

（４）　　セロピアーゼ活性　　　　　　　　　　　　
（１０Ｑセロビオース（関東化学社）、 １００　μｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　ｆ含む
反応液１．０−中に適当量のＣＭＣアーゼを３０℃で作
用させた後、１００℃、２分処理しＣＭＣ。

アーゼを失活させた後、生成グルコース量をムロターゼ
−ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔｅ５ｔ　、和光紬
薬工業社）で測定した。酵素力価は、上記の条件下で１
分間に２μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１単
位とした。

（酵素学的性質） ］１）作用 ＣＭＣ，セルロース、濾紙、アビセル等の繊維素によく
作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を
生成する。

２）　基質特異性 本酵素は、ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル
、及び濾紙に対する活性を有していた。

３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１２．５と極めて広範囲にわたる
。最適ｐＨは、７〜１０と幅広く、４５〜１０．５の範
囲に於いても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対
活性を有しており、従って過去に研究されたアルカリセ
ルラーゼの中でも最もアルカリ側で充分活性が発揮され
る酵素と言える。（第１図）。

（４）　　ｐＨ安定性 各々のＰＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測
定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐＨ４，５〜１
２で極めて安定で失活せず、ｐＨ３，５〜１２．５に於
いても、約５０％以上の活性を維持していた。本酵素は
、このように高アルカリ領域に於いても充分に安定であ
る（第２図）。

（５）最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６５℃であった。又、５０〜７５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた。（
第３図）。

また、１５℃においても３０℃における活性の４０畳以
上の活性を有していた（第４図）。

（６）　　温度安定性 至適ｐＨに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存
活性を測定した結果、５５℃では安定しており、６５℃
に於いても約５０％の残存活性を有していた（第５図）
。

（７）分子量 本酵素をセファデックス　Ｇ　−１００（５ｅｐｈａ−
ｄｅｘＧ−１００）によるグル巷濾過法に基づき分子量
を測定したところ、約１．８万及び５．０万であった。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（ＡＪｓ＋。

Ｆｅ’十　、Ｂａ”十、Ｃａ”士、Ｃｄ”＋　、Ｃｏ”
　、Ｃｒ”　、Ｃｕ”　。

Ｆｅ”　、Ｈｇ”　、Ｍｎ”　、Ｍｏ”　、Ｎｉ”　、
Ｐｂ”　、Ｚｎ”　。

Ｌｉ中、　Ｋ’　、　Ｎａ＋）全活性測定時に共存させ
て、その影響を検討した（　Ｋ’　、　Ｎａ＋について
は濃度を５０ｍＭとし、他のイオンについては、１−と
した）。その結果、Ｈｇ２＋　で阻害が、Ｂａ”　、　
Ｃａ２”　、　Ｃａス”　、　Ｃｄ”＋により活性化が
認められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、　Ａｓ、　ＥＳ。

ＡＯ８，α−ＳＦＥ、　ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチ
レンセカンダリアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす
影＃を調べた。本酵素を界面活性剤０、０５　優溶液で
３０℃、１５分間処理後、活性測定を行った。その結果
、何れの界面活性剤によっても阻害を受けなかった。強
力なデターゾエントであるソデイクム・ｒデシルサルフ
ェートによっても活性の阻害は認められなかった。

００　　ゾロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ　−２１（昭和電工
）、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ
社）を、活性測定時に共存（０，１凰ｇ／−）させてそ
の影響ｔ；、Ｉ４べたところ、何れのプロテアーゼに対
しても強い耐性を有することがわかった。

Ｕυ　キレート剤の影響 キレート剤　ＥＤＴＡ、　ｇＧＴＡ、　）リ一リリン酸
ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に共存させ
、その影＃を検討したが、阻害は認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼ　Ｋ−５８０は、従来のア
ルカリセルラーゼに比較して高アルカリ側（ｐＨ１０）
に至適ｐＨヲ有している。

その上、ｐＨ４５〜１０．５の広範囲に於いて、至適ｐ
Ｈにおける活性の５０％以上の活性を有してお９更にｐ
Ｈ４，５〜１２に於いても極めて安定である。

また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄
剤配合成分によってもほとんど阻害を受けない。したが
って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有利に使
用することができるものである。

更に、本発明の菌株、バチルス　エスピーＫＳＭ−５８
０は中性で生育する菌株であるので、好アルカリ性菌株
と比べ容易にアルカリセルラーゼを工業的に生産するこ
とができる。

〔実施例〕

以下、実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。

実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯（約Ｏ，Ｓ　ｔ　
）　、滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処
理した。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用
寒天培地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃
にて３日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣ
ＭＣの溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、Ｃ
ＭＣアーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地２の
液体培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養
後、遠心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、
ｐＨ３〜１３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌を
スクリーニングした。

上述の方法により、本発明のバチルス　エスピー　ＫＳ
Ｍ　−５８０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−９０１３）を取得する
ことが出来た。

培地１．　　ＣＭＣ２％ ？リペゾトン　　　　　０・５係 酵母エキス　　　　　０．０５％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｎａ２ＨＰＯ４＊　１２Ｈ２００，２５％Ｍｇ５ｏ４・
７Ｈ，ＯＯ，０２％ 寒天　　　０．７５秀 ｐＨ６，８ 培地２−ＣＭＣ１％ ？リペグトン　　　　　１％ 酵母エキス　　　　　０．５％ 皿、ＰＯ４０，１％ Ｎａ２ＨＰＯ４＠　１　ｚｎ、ｏ　　　　ｏ、　２５％
Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，００，０２％ ｐＨ６，８ 参考例１ 実施例１で得たバチルス　エスピー　ＫＳＭ−５８０株
を同実施例の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪
培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液
を得た。この粗酵素液１ｊに対してドライアイス−エタ
ノール中で、３１のエタノールを加え、生じた沈澱を遠
心分離し、更に凍結乾燥を行ない、乾燥粉末として、ア
ルカリセルラーゼ　Ｋ−５８０（比活性　３３単位／ｆ
）ｌｌｆを得た。

＊　酵素活性はｐＨ９に於ける測定値である。

参考例２ ＣＭＣを蔗糖に代え、？リペゾトンを７悌Ｃ８Ｌに代え
る以外は実施例１の液体培地２と同じ組成の培地にバチ
ルス　エスピー　ＫＳＭ−５８０株を接種し、３０℃で
２日間振盪培養した。この培養物を遠心分離し、得られ
た上清のＣＭＣアーゼ活性を測定したところ６０単位／
ｌであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素反応ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第２図は、酵素処理ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、３０℃の活性を１００としたときの２０℃及
び１５℃の活性を示す図面である。 第５図は、酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 以上 第１図 反応ｐＨ 第２図 処理ｐＨ 第３図 温度（匂 第４図 （％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の酵素学的性質を有するアルカリセルラーゼＫ−
   ５８０。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、セルロース、ろ紙、アビ
   セル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、グ
   ルコース等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロースの他にも、セ ルロースパウダー、アビセル、及びろ紙に対する活性を
   有する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１２．５である。最適ｐＨは、７
   〜１０であり、４．５〜１０．５の範囲に於いても至適
   ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨを４．５〜１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ３．
   ５〜１２．５に於いても、約５０％以上の活性を維持す
   る。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわた り、その至適温度は６５℃である。又、５０〜７５℃の
   範囲に於いても、至適温度での活性の５０％以上を有す
   る。 （６）分子量 約１．８万と約５万に分子量のピークを有する（セフア
   デツクスＧ１００を用いるゲル濾過法による）。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋により阻害され、Ｂａ＾２＾＋、Ｃａ＾２
   ＾＋、Ｃｏ＾２＾＋、Ｃｄ＾２＾＋により活性化される
   。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
   鹸、ポリオキシエチレンセカンダリアルキルエーテルは
   ほとんど活性を阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、トリポリリン酸ソーダ
   、ゼオライトは活性を阻害しない。