JPS63240785A - アルカリセルラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なアルカリセルラーゼ及びこれを産生ずる
、バチルス属に属し、中性培地に生育する微生物に関す
る。

［従来の技術］ 繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されてき
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウトモナ
ス属、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス属
等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアクチ
ノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかしな
がら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的規
模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭［１Ｏ−３６２４０号公報）。し
かし、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼの
ほとんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な
酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分
類されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合す
るための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ
領域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有す
る、所謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラー
ゼの存在は、極めて少ないのが実情である。ここでアル
カリセルラーゼとは、至適ｐｌがアルカリ領域にあるも
のを言い、アルカリ耐性セルラーゼとは、至１ｐ＋＋は
中性から酸性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至
適ｐＨに於ける活性に比較して十分に活性を有しかつ安
定性を保持するものを言う。また、中性とはｐＨ６〜８
の範囲を言い、アルカリ性とはこれより高いｐ）ｌ範囲
をいう。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生
産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養に
よりセルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０−２８５
１５号公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細
菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産する
方法（特開昭５８−２２４８８６号公報）、好アルカリ
性バチルスＮｏ１１３９を培養してカルポジキメチルセ
ルラーゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｎ＋ｏｒｉ　、　Ｆ
、　、Ｋｕｄｏ。

Ｔ、ａｎｄ　　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、に、、Ｊ、Ｇｅｎ
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１３１゜：１３３９．（１９
８５）　）及びストレプトマイセス属の一種を用いてア
ルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−１９４
８３号公報）が報告されているに過ぎず、しかもいずれ
も工業的醗酵生産に適うものでは無かった。

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一種で
あるバチルス　エスピー　　ＫＳＭ−６３５（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、ＫＳＭ　−６３５）　　（ＦＥＲＭ　
Ｐ　−８８７２）が衣料用洗浄剤配合成分として適した
アルカリセルラーゼＫを収率良く生産すること及び更に
培養条件を選択することにより、より生産性が高まり、
アルカリセルラーゼの工業的醗酵生産が可能となること
を見出した。

［発明が解決しようとする問題点コ しかしながら、上記バチルス　エスピーに５Ｍ−５３５
の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、ｐＨをアルカ
リ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好
アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性醗酵法の歴史は
浅く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ
性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積さ
れておらず、工業的醗酵生産を行うにあたっての培地調
製、培養方法が操作上の難点となっていた。

更に、前述した報告例のうち、至適ｐｌがアルカリ領域
にある本来のアルカリセルラーゼとしては、バチルス　
Ｎ１菌株、Ｎ２菌株、Ｎ３菌株（特公昭５０−２８５１
５号公報）の生産する、至適ｐＨがそれぞれ８〜９．９
．８〜９の酵素、バチルス　Ｎｏ、１１３９の産生ずる
、至適ｐＨ９のもの及びバチルス　エスピー　ＫＳＭ　
−６３５の産生ずる至適ｐＨ１０のアルカリセルラーゼ
Ｋ（特願昭６１−２５７７７δ号）が存在するが、更に
洗浄剤組成物に配合し用いることのできる至適ｐＨがア
ルカリ側にあり、かつその作用ｐＨ範囲の広いアルカリ
セルラーゼの提供が求められていた。

［問題点を解決するための手段］ 断る実情において本発明者らは中性培地で生育し、しか
も作用の優れたアルカリセルラーゼを産生ずることので
きる菌株を得べく種々研究をおこなった。

かかる問題点を解決するには、中性領域で生育する菌株
を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニン
グする、所謂遺伝子組換えの手法を取ることも可能であ
るが、アルカリ領域に至適ｐＨを有するアルカリセルラ
ーゼを生産する中性微生物を自然界に探索し、これを分
離することがより有効である。しかして、本発明者らは
上記微生物を自然界に求めた結果、一群のバチルス属に
属する微生物は中性培地において生育するにもかかわら
ず、一定のアルカリセルラーゼを産生ずることを見出し
、本発明を完成した。

本発明のアルカリセルラーゼの代表的なものとしては、
次の酵素学的性質、 （１）　ｐＨ７〜１０の広い至適ｐ）ｌ範囲を有し、そ
の最適ｐＨはｐＨ１０近傍である。

（２）　Ｈｇ”の存在により、その活性が阻害され、Ｃ
ａ”の存在により活性化される。

（３）プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤でほと
んどその活性は阻害されない。

（４）ＣＭＣアーゼ活性（Ｃｘ活性）を主活性とし、濾
紙崩壊活性やアビセラーゼ活性（Ｃ＋活性）をも有する
。

を有するアルカリセルラーゼが挙げられる。

本発明のアルカリセルラーゼを産生ずる微生物の例とし
ては、本発明者が栃木県芳賀郡の土壌より分離し、工業
技術院微生物工業技術研究所へ寄託した、バチルス　エ
スピー　にＳＭ　−５２１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９００９）
が挙げられる。

この菌株は、下に示すような菌学的性質を示す。なお、
菌株の分類には、次に示す１〜２５の培地を用いた。（
表示は、重量％） 培地　１．肉エキス、　１．０　　、バタトベブトン。

１．０　；　　ＮａＣ１，０，５；バクト寒天。

１．５　　（ｐＨ７，２） 培地　２．肉エキス、　１．０　　、バタトベプトン。

１．０　；　　ＮａＣ１，、０，５；　（ｐｌ（７，２
）培地　３．肉エキス、　１．（１、バクトペブトン。

１．０　　；　　ＮａＣＩＬ、　０．５　　；ゼラチン
。

１．０　　（ｐＨ７，２） 培地　４．バクトリトマスミルク、　１０．０培地　５
．バクトベプトン、　１．０　；にＮＯ３，０，１培地
　６．バタトペプトン、　１．０　；　ＮａＮＯ３，１
，０培地　７．バクトベブト”、ｔ、　０．７　；　　
ＮａＣｊＺ。

０．５；ブドウ糖、　０．５　　（ｐＨ　７．０）培地
　８．バタトベプトン、１．０培 地　９．７ＳＩ寒天（宋研化学製）：指示量培地１０．
肉エキス、　１．０．バタトベブトン。

１．０　　；　　ＮａＣｕ、　０．５　　；可溶性澱粉
。

０．２；寒天、１．５ 培地１１　、　ＮａＮＨ４ＨＰＯ４１４Ｈ２０，０，１
５；ＫＨ２ＰＯ４゜０．１　：Ｍｇ５０ａ・　７）１２
０．０．０２；クエン酸ナトリウム、　０．２５（ｐＨ
６，８）培地１２．クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ　）培地（栄研化学製）；指示量 培地１３．ブドウ糖、　１．０　：　ＫＨ２ＰＯ４，０
，１：ＭｇＳＯ４’　７１１２０．０．０５　　：　Ｋ
Ｃｌ　、　０．０２　；窒素源、　０．１　　（９１（
７，２）窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸 アンモニウムを用いた。

培地１４．キングＡ培地“宋研”　（栄研化学製）：指
示量 培地１５．キングＢ培地“栄研”　（宋研化学製）：指
示量 培地１６．尿素培地“宋研”　（宋研化学製）：指示量 培地１７．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
永製薬製） 培地１８．３％過酸化水素水 培地１９．ＯＦ基礎培地（Ｄｌｆｃｏ社製）：指示量 培地２０　、　　（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０，１；にＣ
１ｌ　、　０．０２　。

ＭｇＳＯ４・７　）＋２０．０．０２；酵母エキス。

０．０２　、バクト寒天、　２．０　；　Ｂ（：Ｐ（０
，２％溶液）　、　０．４ 培地２１．バクト・サブロー・デキストロース寒天培地
（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量 培地２２．肉エキス、　０．３　　；バクトベプトン。

０．５；酵母エキス、　１．０　　；グリセリン、２．
０ 培地２３．フェニルアラニンマロン酸塩培地（田水製薬
社製）：指示量 培地２４．スキムミルク、　５．０　、バクト寒天。

１．５ 培地２５．肉エキス、　０．３　　、バタトペプトン。

０．５．Ｌ−チロシン、　０．５　　、バタト寒天、１
．５ （菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．６〜０．８μｍＸ１．０〜２．０
μｍの桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形の内
生胞子（０，４〜０．８μｍＸ１．０〜２．０μｍ）を
作る。周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は陽性。

抗酸性はない。

（ｂ）各種培地に於ける生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（培地１） 良く生育する。集落の形状は円形であ り、表面は円滑、周縁は円滑又は葉状である。又、集落
の色調は淡黄色半透明で光沢がある。

■　肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半透
明である。

■　肉汁液体培養（培地２） 生育し温潤する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。

■　リドマスミルク培地（培地４） ミルクの液化が認められ、リドマスの変色は認められな
い。

（ｃ）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５゜共に、陰性。

■　ＭＲテスト（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ　５．０）。

■　ｖｐテスト（培地７） 陽性、陰性は、はっきりせず（ｐＨｓ、ｏ）。

■　インドールの生成（培地８） 陰性。

■　硫化水素の生成（培地９） 陰性。

■　澱粉の加水分解（培地１０） 陽性。

■　クエン酸の利用（培地ｉｆ、１２）コーサ培地及び
クリステンセン培地で、ともに陽性。

■　無機窒素源の利用（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに陽性。

■　色素の生成（培地１４．１５） 陽性。

［相］　ウレアーゼ（培地１６） 陰性。

■　オキシダーゼ（培地１７） 陰性、陽性は、はっきりせず。

＠　カタラーゼ（培地１８） 陽性。

■　生育の範囲（培地２） 生育の温度範囲は１５〜５０℃で、生育最適温度範囲は
２５〜３０℃である。

生育のｐＨ範囲はｐＨ５〜１１、生育最適ｐＨ範囲はｐ
Ｈ８〜１０である。

［相］　酸素に対する態度 通性嫌気性。

［相］　Ｏ−Ｆテスト（培地１９） 好気、嫌気共に生育する。

ｏａ　　ｉの利用性（＋：利用する、−二利用しない） １、Ｌ−アラビノース　　　　＋ ２、Ｄ−キシロース　　　　　− ３．０−グルコース　　　　　＋ ４、Ｄ−マンノース　　　　　＋ ５、フラクトース　　　　　　＋ ６、Ｄ−ガラクトース　　　　− ７、麦芽糖　　　　　　　　　十 ８゜ショ糖　　　　　　　　　　　十 ９、乳糖　　　　　　　　　　− １０、トレハロース　　　　　　　− １１、Ｄ−ソルビット　　　　　　＋ １２、Ｄ−マンニット　　　　　　＋ １３、イノジット　　　　　　　＋ １４、グリセリン　　　　　　　＋ １５、デンプン　　　　　　　　　＋ ０つ　ｖｐ培地に於けるｐＨ（培地７）ｐＨ５，０ Ｑノ　　食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） ５％、７％および１０％ＮａＣＩＬ存在中でいずれも生
育する。

Ｃつ　ｐ）１５．７に於ける生育（培地２１）生育する
。

ＱΦ　ジハイドロキシアセトンの生成（培地陰性。

フェニルアラニンの脱アミノ化（培地 陰性。

カゼインの分解（培地２４） 陽性。

チロシンの分解（培地２５） 陰性。

以上の分類学的考察から判断して、ＫＳＭ−５２１株は
容易に有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属の一種であると認められる。

そして更に、菌学的性質について、バーシーズ・マニュ
アル・オブ・ディタミネイティブ・バタテリオロジー（
Ｂｅｒｇｅｙ　”　ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８
版及びザ・ジーナス・バチルス　（″　Ｔｈｅ　　Ｇｅ
ｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ″　Ｒｕｔｈ　、　Ｅ、Ｇｏｒ
ｄｏｎ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＨａｎｄ−ｂｏｏｋ　
Ｎｏ、４２７　、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ　　、　　Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＷａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄｌｌ：、、（１９７３）　）を参
照し比較、検索すると、この菌株は、最近、掘越と秋葉
（”　Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍ”、　ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　　（Ｔｏｋｙｏ　）　、　１
９８２年刊）の主張している、所謂好アルカリ性（Ａｌ
ｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物、すなわちｐＨ８以上の
アルカリ培地に於いて生育し、これ以下の中性ｐＨ領域
では生育出来ない微生物に属するものでなく、弱酸性領
域からアルカリ領域（ｐｌ（５〜１１）に於いて生育可
能な、一般的な中性で生育するバチルス属微生物と判断
できる。

更にこの菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較する
と、最も類縁の種としてバチルス・リケニホルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げ
られる。しかしながら、公知のバチルス・リケニホルミ
スに属する菌株と本菌株とを比較すると、硝酸塩の還元
能とキシロースの資化性の点に於いて相異する。更に上
記公知菌株は少なくともアルカリセルラーゼを産生じな
いので、本菌株は新菌株と判断される。

上記したような菌株を用いて本発明のアルカリセルラー
ゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養
すれば良い。培地中には、責化し得る炭素源及び窒素源
を適当量含有せしめておくことが好ましい。この炭素源
及び窒素源については特に制限はないが、その例として
は、窒素源としてコーングルテンミール、大豆粉、コー
ンスチーブリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマ
メディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、バイブ
ロ、アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕
、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジブ
ロン、ゼスト、アシックスなどが挙げられる。又、炭素
源としては、籾殻、麩、濾紙、一般紙順、おが屑等の植
物繊維質、廃糖蜜、転化糖、ＣＭＣ，アビセル、セルロ
ース綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素源
、例えば、アラビノース、グルコース、マンノース、フ
ラクトース、麦芽糖、ショ糖、マンニット、ソルビット
、イノジット、グリセリン、可溶性デンプンや責化し得
る有機酸、例えば、クエン酸や酢酸などが挙げられる。

また、その他、リン酸、Ｍｇ”、　Ｃａ”、　Ｍｎ”、
　Ｚｎ２°、　Ｇｏ”、　Ｎａ”　。

Ｋ＋等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養
源を培地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リセルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び
精製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分離
又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養液か
ら除去して粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液
は、そのまま使用することもできるが、必要に応じて、
塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素
を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製酵素
として使用することも可能である。

斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼの代表的
なものとしては、アルカリセルラーゼに−５２１と命名
されたものが挙げられ、以下このものを例に取り本発明
を更に説明する。

なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行い、次
の緩衝液を用いた。

ｐＨ３〜８　　マクルベイン緩衝液 ｐＨ　　８〜１１　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐ）１１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液 酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ｍｇＣＭＣ（Ａ−０１Ｌ、出画国策バルブ社）、１
００μｍｏｌ各ｆ重緩衝ン夜（マクルべイン、リン酸、
グリシン−ＮａＯＨ等）を含む基質溶液０．９＋ｎｊ２
に０．１ｍｊＺの酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応
した、反応後、３．５−ジニトロ−サリチル酸（３、５
−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（Ｄ
ＮＳ）　）法ニテ還元ｎの定量を行った。すなわち、反
応液、１．０ｍｊｌにＤＮＳ試薬１．０ｍｌを加え、５
分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０ｍ１ｌ
の脱イオン水を加えて希釈した。これを波長５３５ｎｍ
で比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に
１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵
素量を１！＃位とした。

（２）ｐ−ニトロフエニルセロビオシド分解活性０．１
μｍｏｌ　ｐ−ニトロフエニルセロビオシド（シグマ社
）、１００μｍｏｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を含
む反応液１．ＯｍｆＬ中に適当量の酵素液を３０℃で作
用させた後、Ｉ　Ｍ　Ｎ８２ＣＯｓを０．３ｍｍ　、脱
イオン水を１．７ｍ℃順次加え、遊離するｐ−ニトロフ
ェノールを４００　ｎｍで比色定量した。酵素力価は、
上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノ
ールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセル、セルロース粉末、及び濾紙分解活性 ２０　ｍｇアビセル（メルク社）、２００μｍｏｌ　’
Ｊリン酸緩衝液ｐＨ　７．０）を含む反応液２．０ｍｌ
１中に適当量の酵素液を加え、３０℃、２５　Ｏｒｐｍ
で据とうしながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（
５℃、３０００　ｒｐｍ　。

２０分）を行い、その上清１．０ｍＪ２を３．５−ジニ
トロ−サリチル酸（３、５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉ
ｃｙｌｌｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）法にて還元糖の定
量を行った。セルロース粉末分解活性はセルロース粉末
（東洋濾紙社）を、濾紙分解活性は濾紙（セルラーゼ活
性度検定用濾紙、東洋Ｎｏ、５１−特）を用い、アビセ
ラーゼ活性の時と同様に行った。酵素力価は、上記の条
件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元
糖を生成する酵素量を１単位とした。

（４）セロビアーゼ活性 １０＋ｎｇセロビオース（関東化学社）、１００μｍｏ
ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を含む反応液１．０ｍ
ｌ内に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１００
℃、２分間処理して酵素を失活させた後、生成グルコー
ス量をムロターゼーＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔ
ｅ５ｔ、和光純薬工業社）で測定した。酵素力価は、上
記の条件下で１分間に２μｍｏｌのグルコースを生成す
る酵素量を１車位とした。

（酵素学的性質） （１）作用 ＣＭＣ、セルロース粉末、濾紙、アビセル等の繊維素に
よく作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元
糖を生成する。

（２）基質特異性 本酵素は、ＣＭＣのほかにも、セルロース粉末、アビセ
ル、濾紙及びｐ−ニトロフエニルセロビオシド、セルビ
オースに対する活性を有していた。

（３）作用ｐ　ｔｌ　＆　ヒ至ｉａｐ　Ｈ作用ｐＨ範囲
は、３〜１２．５と極めて広範囲であった。最適ｐＨは
、７〜１０と幅広く、ｐＨ４，５〜１０．５の範囲に於
いても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を
有しており、従って過去に研究されたアルカリセルラー
ゼの中でも最もアルカリ側で充分活性が発揮される酵素
と言える（第１図）。

（４）　ｐＨ安定性 各々のｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測
定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐＨ５〜１２で
極めて安定で失活せず、ｐｉ４．５〜１２．５に於いて
も、約５０％以上の活性を維持していた。本酵素は、こ
のように高アルカリ領域に於いても充分に安定である（
第２図）。

（５）最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であフた。又、４５〜６５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた。（
第３図）。

（６）温度安定性 至適ｐＨに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存
活性を測定した結果、４０℃では安定しており、５５℃
に於いても約５０％の残存活性を有していた（第４図）
。

（７）分子量 本酵素をセファデックス　Ｇ−１００ （Ｓｅｐｈａｄａｘ　　Ｇ　−１００）によるゲル濾過
法に基づき分子量を測定したところ、約３．１万であっ
た。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン （ＡＩｌ”、　Ｆｅ”、　Ｂａ”、　Ｃａ”、　Ｃｄ”
、　（：ｏ”。

Ｃｒ”、　Ｇｕ”、　Ｆｅ”、　）Ｉｇ”、　Ｍｎ”、
　Ｍｏ”。

Ｎｉ”、　Ｐｂ”；　Ｚｎ”、　Ｌｉ”　、に＋　、　
Ｎａ　＋　）を活性測定時に共存させて、その影響を検
討した（　Ｋ”　、　Ｎａ”については濃度を５０ｍＭ
とし、他のイオンについては、１ｍＭとした）。その結
果、Ｈｇ　３　＋で阻害が、Ｃａ２＋により活性化が認
められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ
、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレンセカ
ンダリアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす影響を調
べた。本酵素を界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、１
５分間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの界
面活性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強力
なデタージエントであるソデイウム・ドデシルサルフェ
ートによっても活性の阻害は認められなかった。

（１０）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ社
）を、活性測定時に共存（０，１ｍｇ／ｍｕ　）させて
その影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対して
も強い耐性を有することがわかった。

（１１）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、　　トリポリリ
ン酸ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に共存
させ、その影響を検討したが、はとんど阻害は認められ
なかった。

［発明の効果コ 本発明のアルカリセルラーゼは、従来のアルカリセルラ
ーゼに比較して高アルカリ側（ｐＨ１０）に最適ｐＨを
有している。その上、ｐＨ７，Ｑ〜１０の広範囲に於い
て、至適ｐＨを有しており、更に広い範囲に於いて極め
て安定である。

また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄
剤配合成分によってもほとんど阻害を受けない。したが
って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有利に使
用することができるものである。

更に、本発明の微生物は中性で生育するので、好アルカ
リ性菌株と比べ容易にアルカリセルラーゼを工業的に生
産することができる。

［実施例］ 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯（約０．５ｇ）、
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した
。この熱処理液の上滑を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの
溶解に基ずく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣア
ーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を液体培地（培地
２）に接種し、３０℃で３日間振どう培養した。培養後
、遠心分離した上清ン夜についてＣＭＣアーゼ活性を、
　ｐＨ３〜１３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。

上述の方法により、本発明のＫＳＭ−５２１株（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−９００９）を取得することが出来た。

培地１．　　ＣＭＣ２％ ポリペプトン　　０．５％ 酵母エキス　　　０．０５％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｎａ２）ＩＰｏ、　４２）１２０　０．２５％ＭｇＳＯ
４・７Ｈ２００，０２％ 寒　　　　　　　　　　　０．７５％ ｐＨ６，８ 培地２．　　ＣＭＣ１％ ポリペプトン　　１％ 酵母エキス　　　０．５％ にＨ２ＰＯ４０，１％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２００，２５％ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２００，０２％ ｐＨＩｉ、８ 実施例２゜ 実施例１で得たバチルス　エスピー　ＫＳＭ−５２１株
を同実施例の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振ど
う培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素
液を得た。この粗酵素液１℃に対してドライアイス−エ
タノール中で、３ｆｔのエタノールを加え、生じた沈澱
を遠心分離し、更に凍結乾燥を行い、乾燥粉末として、
アルカリセルラーゼに−５２１（比活性＊２０！＃位／
ｇ）９ｇを得た。

＊　酵素活性はｐＨ９に於ける測定値である（以下同じ
）。

実施例３゜ ＣＭＣを１％ショ糖に代え、ポリペプトンを７％ＣＳＬ
に代える以外は実施例１の液体培地２と同じ組成の培地
にＫＳＭ−５２１株を接種し、３０℃で２日間振どう培
養した。この培養物を遠心分離し、得られた上清のＣＭ
Ｃアーゼ活性を測定したところ１００車位／ｆｌであっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルカリセルラーゼに−５２１の酵素反応ｐ
Ｈと相対活性の関係を示す図面である。 第２図は、同酵素の処理ｐＨと相対活性の関係を示す図
面である。 第３図は、同酵素の反応温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第４図は、同酵素の処理温度と相対活性の関係を示す図
面である。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス属に属し、中性培地で生育する微生物の生
   産する、アルカリ側に至適ｐＨを有するアルカリセルラ
   ーゼ。 ２、次の酵素学的性質を有するものである特許請求の範
   囲第１項記載のアルカリセルラーゼ。 （１）ｐＨ７〜１０の広い至適ｐＨ範囲を有し、その最
   適ｐＨはｐＨ１０近傍である。 （２）Ｈｇ＾２＾＋の存在により、その活性が阻害され
   、Ｃａ＾２＾＋の存在により活性化される。 （３）プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤でほと
   んどその活性は阻害されない。 （４）ＣＭＣアーゼ活性を主活性とし、濾紙崩壊活性、
   アビセラーゼ活性（Ｃ＿１活性）をも有する。 ３、アルカリセルラーゼが次の酵素学的性質を有し、Ｋ
   −５２１と命令されたものである特許請求の範囲第１項
   記載のアルカリセルラーゼ。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、セルロー ス、濾紙、アビセル等の繊維素によく作用 し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を生成
   する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセ ル、濾紙及びｐ−ニトロフエニルセロビオシド、セロビ
   オースに対する活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１２．５である。最適ｐＨは、７
   〜１０であり、４．５〜１０．５の範囲に於いても至適
   ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ４．５〜１
   ２．５に於いても、約５０％以上の活性を維持する。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわた り、その至適範囲は６０℃である。又、４５〜６５℃の
   範囲に於いても、至適温度での活性の５０％以上を有す
   る。 （６）分子量 約３．１万（セフアデックスＧ１００を用いるゲル濾過
   法による）。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋により阻害され、Ｃａ＾２＾＋で活性化さ
   れる。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α− ＳＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダリ
   ーアルキルエーテルはほとんど活性を阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、トリポリ リン酸ソーダ、ゼオライトは活性を阻害しない。 ４、アルカリ側に至適ｐＨを有するアルカリセルラーゼ
   を生産する、バチルス属に属し、中性培地で生育する微
   生物。 ５、生産したアルカリセルラーゼが次の酵素学的性質を
   有するものである特許請求の範囲第４項記載の微生物。 （１）ｐＨ７〜１０の広い至適ｐＨ範囲を有し、その最
   適ｐＨはｐＨ１０近傍である。 （２）Ｈｇ＾２＾＋の存在により、その活性が阻害され
   、Ｃａ＾２＾＋の存在により活性化される。 （３）プロテアーゼ、界面活性剤及びキレート剤でほと
   んどその活性は阻害されない。 （４）ＣＭＣ分解活性（Ｃｘ活性）を主活性とし、濾紙
   崩壊活性とアビセラーゼ活性（Ｃ＿１活性）をも有する
   。 ６、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）
   ＫＳＭ−５２１と命名され、微工研菌寄第９００９号と
   して寄託された特許請求の範囲第４項記載の微生物。