JPS60186282A - 新規な耐熱性プルラナ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、広い最適作用ｐＨ域をもつ新規なプルラナー
ゼに関するものである。

プルラナーゼは、　Ｂｅｎｄｅｒらにより、ブルラリヤ
・プルランの生産する多糖力°１プルランを加水分解４
″る酵Ａごとして、エーロバクター・エーロゲネス（Ａ
ｅｒｏｌ）ａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に、はじ
めて見出されたしＢｉｏ　−ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ、３６．　３０９　（１９５９）、特公昭４
６　７５５９など］。その後、この、膵累は、アミロペ
クチンのび−１，６−グルコシド結合を加水分解し、β
−アミラーゼとのυＦ用により、デンプンからマルトー
スを収はよく生産Ｃきることから注目され、現在までに
同が１１の１′１を素が仁々の微生物より生産されるこ
とが知ら４ｔでいる。この種の酵素はプルラナーゼ、イ
ソアミラーゼなど１上々の名称で呼ばれているが、総称
してα−１，６−グルコシダーゼとｄわれでいる。たと
えば、エラセリシア・インターメディアのイソアミラー
ゼ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、
　Ａｐｐｌｉｅｄ、　Ｍｉｃｒｏ’ｂｉｏ１．、１５．
４９２（１９６７）］、スストレプトコツススミテイス
のプルラナーゼ［５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍ１ｔ
ｉｓ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　上１０８゜：３３．（１
９６８）］、ストレプトマイセス・８１）。

ＮＯ，２８（７）イソアミラーゼ［Ｊ、　Ｆ’ｅｒＬｎ
ｅｎｔ、　’Ｌ’ｅｃｈ、、±麿、５５２　（１９７１
）］、バシルシスのプルラナーゼ　［Ａｇｒｉｃ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４　０．　１　５　１　５　（１９
７６）、５ｔａｒｃｈ、　３４．　３４０（１９８２）
など］などがある。

最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなとのｒｉ−１，
６−１”ルコシダーゼは、デンプンからグルツースの製
造や、デンプンからマルトース、マルトトリオース、マ
ルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサ
オースなどのマルトオリコ糖の生産においても、これら
糖の増収にｆ１効であることが認められている。

しかるに、従来、シ」】られているプルラナーゼやイソ
アミラーゼなどα−１，６−ゲルコジンーセは、一般に
熱安定性に劣り（多くは最４　＃Ｌ反４５〜５０℃）ま
た、作用ｐＨ範囲が狭いため、グルコアミラーゼのよう
に酸性側で作Ｊ（１シ、熱安定性に優れた酵糸（最適作
用ｐＨ４，５付近、最適作用温度６０’Ｃ）ヤ、中性〜
弱アルカリ性に最適作用ｐＨをもつ微生物起源のマルト
オリゴ糖生成酸素の、全てのアミラーゼに対して使用す
るには技術的および経り的に画題があった。

そこで、本発明石らは、グルコアミラーゼ、β−アミラ
ーゼやマルトトリオース以上のマルト”オリゴ糖を生成
するアミラーゼの、いずれのアミ）−ゼともυＦ用でき
る、最適作用ｐＨ範囲か広く、Ｌつ熱安定性に優れたα
−１，６−グルコシダーゼをからなる新規な耐熱性プル
ラナーゼに関するものである。

以下に、本発明の１八１容を更に具体的に説明する。

本発明にお゛いて使用される、クレブシラ・ニュー　モ
＝　−ｆ　（１（ｌｅｌ）ｓｉｅｎａ　ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）は、Ｂｅｇｅｙの細菌量′ｒ書（）３ｅｔｇｅ
ｙｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＤｅｔＢｒｔｎｉｎａｔｉ
ｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｒｎｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃ
ｏ、）において、以前はエーロバクターΦエーロゲネス
（Ａｅｒｏｂａｃｔ８ｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）と区別
されていたが、第８版において、エーロノ４クターーエ
ーロゲネスはクレプシラ会ニューモニアに↑シ含されて
いる。エーロバクター１β也やクレブン、　□ うｍ１１１１菌がプルラナーゼを生産することについて
は、すでに本発明以６ｊに公知である。たとえば、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｚ、、　３３　Ｃ７９（１９６１）、　
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ■、５５
５（１９６６）、特公昭４６−７５５９、Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３７　ｐ　２８２１　（
１９７３）などには、エーロバクター・エーロゲネスの
生産するプルラナーゼの記載があり、また、特公昭５１
−５０７２特公昭５Ｂ−２２１９７などには、クレブシ
ラ・ニューモニアなどクレブシラ属の生産するα−１′
、６−グルコシダーゼについての記載がある。しかし、
これら文献や特許公報に記載されている酵素□は、いず
れも熱安定性に′−Ｊ−っている。すなわち、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　。

Ｚ、３３４．７９（１９６１）とＭｅｔｂｏｄ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ皇。

５５５（１９’６６）にはエーロバクター・エーロゲネ
スのプルラナーゼの最適作用温度は４７．５℃とあり、
Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔｎ、、３７．　２
８２１　（１９’７３）には、同じくエーロバクター・
エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用温度は５０℃で
あると記載されている。

そして、特公昭５１−５０７２には、クレブシラ・ニュ
ーモニアの最適作用温度は４５〜５０℃にあり、基りの
不在下では、５０℃で１時間ツノ１１熱例、　ｒ！ｌｉ
すると殆んど失活すると記載されている。

このように、従来、ｒｊＩられているエーロバクター属
やクレフ゛シラ屈のプルラナーゼ弔α−１，６二グルコ
シダーゼの最適作用温度は４５〜５０℃程度であると考
えられるのに対し、本発明のプルラナーゼの最適作用温
度は６０〜６３℃の高温側に゛あり、基質の不在下で５
０℃で１時間加熱しても　□′、゛。

′殆んど活性の低下は認められない（免１図及び第一。

２市）など、熱安定性に優れた酵素である。本酵　、素
は基質の存在下では当然熱安定性イしされ、またカルシ
ウムなどの金属塩の存在下でも熱安定化されるので、実
用的な反応条件においても、最低６０℃の温度で反応を
１９なうことができる。

一方、最適作用ｐＨについでみてみると、エーロバクタ
ー−エーロゲネスやクレブシラ属のプルラナーゼやσ−
１，６−グルコシダーゼの最適作用ｐ】イは５．０付近
（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　％ｌｌ
ｌ、　５５５　（１９６６）’。

特公昭５１−５０７２など）、または、ｐｉ（６付近（
ＡｇｒｉｃＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　’３７．　２８２
１　（１９７３））にあり、いずれの場合も、特に、ｐ
Ｈ５以上におい　５では著しく活性が低下することがっ
Ｊｌられでいる。

本発明以前に、比較的熱安定性に優イ１．たα−１，６
−グルコシダーゼを生産する微生物として、たとえは、
バシシス属のプルラナーゼ（特開昭５７１７４０８９゜
５ｔａｒｃｈ、３４＋　３４０　（１９８２）　）、お
よびストレプトマイセス属のイソアミラーゼ（Ｊ、　Ｆ
ｅｒｍｅｎｔ　Ｔｅｃｂｎｏｌ、＋　４９＋５５２（１
，９７１））が知られている。これらの微生’にの生産
するプルラナーゼやイソアミラーゼの最適作用温度は約
６０℃にあるが、いずれも最適作用ｐＨは５０にあり、
ｐＨ５以」二では著しく活１生が低ドする。

以１ユ、説明したように、本発明以前に知られていたエ
ーロバクター属やクレブシラ属の酵素は熱安定性に劣り
、最適作用温度は５０℃前後にあり、また、最適作用ｐ
Ｈも５．０または６．０の狭い範囲にある。これに対し
、本発明により生産されるクレフシラ・ニューモニアの
新規な１１１熱性プルラナーゼＡは、最適作用ｐＨが約
４．５〜約７．５の極めて広敗　約 い範囲にあり、そして最適作用温度は６０−７３℃と極
めて熱安定性に優れた酵素であり、従来、１．１１られ
ていたニーロバフタ属やクレブシラ１萬の酵素とは違っ
た新規な酵素と認められるものである。

以下に、本発明の新規な耐熱性プルラナーゼの酸素的性
質についてより詳細に記載する。

（１）作用ニブルランのび−１，６−グルコシド結合を
分解してマルトトリオースを生成する。

また、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲンまたはこれ
らの派生物のα−１，６−グルコシド結合を分解する。

（２）　作用ｐＨ範聞及び最適作ＪＩＪ　ｐＨ：　ｐＨ
約２．５　”４勺１０の極めて広いｐＨ９囲で作用し、
最３Ａ　ｊ’Ｆ　Ｊｉｌ温度はｐＨ約４．５〜約７．−
５の広い範囲に認められた（２％プ／ｌ／　ラン、０．
０５　Ｍｌ！ｌ’ｌ’ｌ’ｌ＆緩衝液（ｐＨ３〜５．５
）、トリス緩衝敢Ｉｌｌ　（ｐ１４５．５〜７．５）お
よびトリシン緩面欣（ｐＨ７〜８．５）のもとて５０℃
で３０分間反応、第１図（ａ）） （３）作用温度範囲及び最適作用温度、約７５℃まで作
用し、最適作用温度は約６３℃に認められた（２％プル
ラン、０．．０５八４ｉＪｉｔ竣緩衝液（ｐＨ５，’Ｏ
）又は０．０５Ｍｌ−リス緩衝液（ｐＨ７，０）のもと
て３０分間反応、第１図ｆｔ、＋　３゜ （４）熱安定性、酸素水溶液を５０℃、５５℃と６０℃
で加熱処理してのち、桟仔活′ｌ！Ｌを１ｌｌｌ定した
。その結果、５０℃では１時間の加熱後も失活はｔｔｉ
んど認められなかった。

５５℃の加熱では２０分の加熱で約２０％失活し、１時
間の加熱で約６０％失活した。そして、６０℃の加熱で
（１３０分間の加熱で約８０９６失活した（第２図（α
））。

ｉ５）　ｐＪ（安定性；　ｐＨ約４〜約１０の範囲で安
定であった（　０．　Ｉ　Ｍｌ’ｌ’１．酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液またはトリス緩衝液のもと、室温（２５℃）
で３時間７或置後、残存油１’ｌユを測定した（第２図
（ｂ））。

（６１阻害剤；　本酵素ハ１　ｘ　１０−３Ｍ）ＣｕＳ
Ｏ４，ＨｇＣｌ２゜ＺｎＳ’、）４．　Ｊ＋’ｅＳＯ４
により、それぞれ約９３％、約８９９夕、約８６％、約
２９％ＩＩＩ害された。同濃１丈のＡｇＮＯ３によって
は殆んど阻害されなかった。

（７）精製方Ｊ、；本酵素は培養上澄液かり硫安分画（
４０〜７０ん飽和）、１）ＥＡＥ−セファロースカラム
クロマトグラフィー（ＫＣＩＯ〜０．５Ｍでリニャーク
ラジエント溶１１：）とセファデックスＧ−２００カラ
ムクロマトグラフイーにより、クロマト的、電気泳動的
に均一まで精製することができる。

（８）分子量；セファデックスＧ−２００ゲル？Ｍ、過
法により測定した分子量は約１２万であった。

ｆ９）　力価測定法；０．１Ｍトリス緩衝液に溶解させ
た１％プルラン液（ｐｌ−１７，０’）　０．５　ｎｒ
Ｌに胎量の酵素を加え、水で全Ｊｙｔ　１　ｒｈＬとし
４０℃で反応させる。この条件で１時間に１ｍ９のグル
コースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とし
１こ。

また、本発明において使用される一ｒ、Ｉ？現な耐熱性
プルラナーゼ生産へ１の菌学的性質（よ下記に示す通り
である。

（１）形態的性°Ｕ゛；約０．８　Ｘ　約１．３　ｎ　
ｏ）桿５、ｔｕｌ　’／ｉｒ、単桿菌あるいは２連状に
連なり生１１する、運動性はなく、また胞子形成は認め
られない。

（２）培養的性１６；　肉汁寒天では、ｒニー１１！！
、で光沢のある円形状の呆落を形成する。集落の周縁は
金縁で、表面１イ【起は四状を示す。肉汁液体ｒｆ（養
では、培地全１４：に混濁を生成する。

φ刺培養では、寒天ｉｂ層の」二層、中８１；、深部と
もに糸状に生白が認めらＩＬ、寒天多面にも集落の形成
か認められる。

１３１　生理的性質 生１ダ温度；約５０゛Ｃの温１１ｖまで生育するか、最
適生育温度は約４３”Ｃ０ 生育ｐＨ；ｐｆ（約５〜約９の範囲で生育する。

最適生育１）１（は７付近。

ダラム染色；陰性。

酸素にｉＪする態度；辿°ｉ／Ｆ峠気性。

カタラーゼ；陽性。

オキシダーゼ；陰性 β−ガラクトシダーゼ；陽性 硝酸塩の還元；鴻跣 炭水化物の利用；□　グルコース、アドニト−ル、Ｌ−
アラビノース、エクスリン、イノシトール、マンニトー
ル、Ｌ−ラムノースなどを利用し酸を生成する。

クエン酸の利用；陽性 マロン酸の利用；陽性 メチルレッド反応；陰性 ｖｐ反応；陽性 アルギニンの加水分解；陽性 ゼラチンの液化；陰性 硫化水素の生成；陽性 インドール反応；陰性 リジンの脱炭酸；１−性 オルニチンの脱炭酸；陽性 ウレアーゼ反応；１褐性 フェニールアラニンからのフェニルピルピン酸の生成；
陰性 以上の菌学的性質について、１３ｅｒｇｃ＋ｙ’ｓ　Ｌ
ｖｉａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第８版（゛昆ｅ　Ｗｉｌｌｉａ
＋’ｎｊ＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　ｃｏ、　１９７４年）を
参照し、本薗をタレブシラ働ニューモニア（ＩＧｅｂｓ
ｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の−菌株と同定当
するのが適当と１６えた。本函は工よ（ｙ術院微生物工
業！支術１１Ｊ１究所においてＩ（ｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ス、カゼイン、コーンステイープ・リカーのような有機
窒素源あるいは尿素、硫酸アンモニウム、硝酸塩などの
１１１（械窒素化合物と、炭素源として、デンプン、ア
ミロペクチン、デキストリン、マルトース、グルコース
、乳糖などを一神または一棟以ヒ、そしてこれに補足す
る栄養源として、リン酸塩、マグネシウム塩、塩化カリ
ウムと、マンガン塩、カルシウム塩、鉄塩などの金属塩
を含む培」也がｆ吏用される。

ン、インプロパツール、エタノール、メタノールなどの
有機溶剤を、加えて酵素を沈娠声として収１４する、な
どの手段により、容易に培養物から酵オｓを回収するこ
とができる。

本発明以前に知られているＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属やＫ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の生産するプルラナーゼやイソア
ミラーセなどα−１，６−グルコシダーゼは１．菌１本
内に多４１．の酵生産されるため、竺養物からの該ｎｔ
累の！ｉＪ収は容　゛な耐熱性プルラナーゼは、殆んど
すべて菌ト１り外に易であり、工業的に同酵素を製造す
る際に萌業的に有利に実施することができる。このこと
も本発明の大きな特徴として享げることができる。

また、新規な赴１熱性プルラナーゼは前述の如（、最適
作用ｐＩ−１が約４．５〜約７．５の広いｌｉ）囲にあ
り、また熱安定性に優れた酸素であるため、現任、ル１
られているデンプンからグルコースを生産するグルコア
ミラーゼ、デンプンからマルトースを生産する桶′吻ま
たは細菌のβ−アミラーゼはもとより、マルトトリオー
スを生成するバシルス属アミラーゼ（最λ〜作用ｐｉ−
ｉ５．　Ｏ〜６，５、特許用１頭中）、マルトテトラオ
ースを生成するシュードモナス属７′ミラーゼ（最メ１
で４作ＩＩＩ　ｐＨ６，５〜８、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

ｎ１ｏｐｈｙｓ、　１４５　１０５（１９７１）など）
、マルトペンタオースを生成するバシルス属アミラーゼ
（最適作用ｐＴ−Ｔ　５〜８　、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１５５．２９０（１９７
３））、マルトヘキサオースを生成するｆミラ＝ｆ’（
最適（”ｉ：　Ｊｌｌ　ｐＨ６，８または８．０　、Ｂ
ｉｏｃｂｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ　Ａｃｔａ　、１１０．　３３３（
１９７５）　またはＡｇｒｉｃ、　１３ｉｏ１．Ｃｈｅ
ｔｎ、、　４６．　］　５３９（１９８２）　）など、
いずれのアミラーゼとも、それぞれのアミラーゼの最適
条件下で反応をおこなうことができる。

以下に、実施例により本発明の詳細を、況・シ１する。

実施例　１ 尿素０．３５％、Ｋ２　ＨＰＯ４０，０５％、ｆｖｌｇ
ｓＯｌ　−７Ｊｉ２’Ｊ０．０５％、可溶性デンプン２
％、ＫＱ　Ｑ、　５　％　、ＭｎＱ２５　Ｘ　１０−５
Ｍ、ＣａＯ２１Ｘ　１０−３Ｍカラナル培ｊｌｉｌＪニ
５０耐を２００１＋１１容三角フラスコに入れ、常法に
より゛　殺菌後、クレブシラ・ニューモニア（ＩＧｅｂ
ｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍＯｎｉａ”）　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　
Ｐ　７３８７を接種し、３０℃で２日間振温培養した。

培養後、遠心分離機により除菌し、得られた」二澄液に
ついて生産された新規な耐熱性プルラナーゼ活性をＪｌ
ｌ定した結果、培地ｍｌ当り５．６単位であった。

実施例　２ 実施例１で使用したと同じ組成の培ノ、ｍ３ｔを５を容
ジャーファーメンタ−に入れ、常法により殺菌後、クレ
ブシラ・ニューモニアＦ　Ｅ　ＲＭＰ−７３ｇ７を接種
し、通気’Ａ　Ｉ　Ｌ　／ｍｉｎ　回転数２５０　ｒｐ
ｒｎで培養した。培養後、遠心分離機により除菌し、１
匝安７０％飽和になるように加え、生成した沈澱物１）
Ｅｌ、４のｉｌｋ化デンプン液（固形物として１Ｇ）に
、市販の大けβ−アミラーゼ３００単位（ＡｇｒｉｃＢ
ｉｏｌ；Ｃｈｔ＋＋ｎ、、　４０．　１５１５　（１９
７６）のｊｉｌＪ疋法によった）と」二記方法により得
たクレブシラ・ニューモニアの新規な耐熱性プルラナー
ゼを１または２’ｔｉｔ位疾加え、ｐｉ−１６，０，５
５℃で反応させた。

得られた糖化物の糖屯成は高速液体クロマトグラフ法に
より定徂した。結果は第１表に示す辿りであった。

実施例　３ Ｄ　Ｅ　７．７の液化デンプン液に、市販のグルコアミ
ラーゼと実施例２で調製した新規な耐熱性プルラナーゼ
を１　、ｊｌｔｌＩ／、加え、固形分濃度３０％、全容
砥］Ｑｍｊとして、ｐｉ（５，Ｏ１温度６０℃で糖化し
た。

糖化液の糖糸１１成の分析は高速液体クロマトグラフ：
、）；によった。得られた結果を第２表に示す。

表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ−ゼの添
加によりグルコースの収量が増加した。

ここでＧ２、Ｇ３はそれぞれグルコースの２量１本、３
量体を示す。

た新規な耐熱性プルラナーゼ１．５単位を加え、水で全
量１０ｍＬとし、ｐＨ７，０、温度５０℃で糖化した。

糖化液の糖組成を分析した結果は第３表に示す通りであ
った。

表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナーゼを添
加することにより、マルトトリオースの収量が著しく増
加した。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）と（ｂ）、第２図（ａ）と（ｂ）は、それ
ぞれクレブシラ・ニユーモニアの生産する新規な耐熱性
プルラナーゼの最適作用ｐＨＳ最適作用温度、熱安定性
とｐＨ安定性を示している。 痺１邸Ｃ幻　。 ４５、．６　“　。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 作用温度範囲が約０〜約７５℃、最適作用温度範囲が約
   ６０〜約６３℃、作用ｐＨ範囲が約２．５〜約１０、最
   適作用ｐＨ範囲が約４．５〜約７．５からなる新規な耐
   熱性ブルラナーゼ。