JPH01218587A - 新規酵素、その製造法及び生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規生澱粉分解酵素８１０１８、その製造法及
び生産菌に関するものである。

本発明の生澱粉分解酵素８１０１８は生澱粉をよく分解
するので、発酵原料や澱粉の分解に生澱粉分解酵素８１
０１８を使用すれば発酵原料や澱粉のα化のための蒸煮
工程を省略することができ、貴重なエネルギーの節減に
つながり、発酵業界、澱粉業界、糖果界等に益するとこ
ろ大なるものがある。

（従来技術） 一般に、生澱粉は大きな結晶構造をもち、この結晶構造
のために澱粉分解酵素では容易に分解されないと考えら
れていた。

従来の発酵原料、糖原料としての生澱粉は蒸煮してα化
し、これに澱粉分解酵素を作用させて液化、糖化し１発
酵、糖爬造に使用されている。

しかし、近年、蒸煮に要する燃料費の高騰から生澱粉を
そのまま酵素で分解し、発酵、糖製造等に使用しようと
する研究が進められて来た。

従来、生澱粉分解酵素としてはＲｈ１ｚｏｐｕｓ　ｓｐ
。

の生産するグルコアミラーゼ、　Ｐａｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ１ａｎｏｓｕ＋＊　０ＧＲ−１の生産する生澱粉分解
酵素。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｋ−２７の生産するアミラー
ゼ、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ　ｒｏｌｆｓｉｉの生産する生
澱粉糖化酵素、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
　Ｆ−２の生産するアミラーゼなどが広く知られるよう
になった。

（発明が解決しようとする問題点） 従来知られている生澱粉分解酵素はいずれも生澱粉の分
解速度が遅かったり、また、その大部分がエキソ型酵素
であるなど工業生産に使用するには問題が多かった。

いまや、エネルギー節減のために、すぐれた生澱粉分解
酵素が待望されているのである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、工業的に使用して有用な生澱粉分解酵素
を得るために鋭意研究したところ、バチルス属の新規分
離株が著しるしくすぐれた生澱粉分解酵素を生産するこ
とを知った。

新たに単離した生澱粉分解酵素を酵素学的に調べたとこ
ろ、公知の生澱粉分解酵素とは相違する新規な生澱粉分
解酵素と認められ、この酵素を生澱粉分解酵素８１０１
８と命名するに至った。

また、生澱粉分解酵素８１０１８を生産する菌は胞子を
形成し１周鞭毛を有し、運動性があるなどバチルス属に
属するものとは認められたが、明確な種を確定すること
はできず、重曹をバチルスｓｐ。

８１０１８と命名した。そして、バチルスｉｐ、　８１
０１８は微工研菌寄第９８４０号として寄託された。

本発明は生澱粉を分解し、オリゴ糖、マルトース及びグ
ルコースを生成し、かつ、　α−サイクロデキストリン
及びβ−サイクロデキストリンを分解する生澱粉分解酵
素ＢＩＯ１８に関する。

また１本発明はバチルス属に属する生澱粉分解酵素８１
０１８生産菌を培養し、生澱粉分解酵素８１０１８を採
取することを特徴とする生澱粉分解酵素旧０１８の製造
法である。

更に、本発明は生澱粉分解酵素８１０１８を生産するバ
チルスｓｐ、　８１０１８に関するものである。

本発明の生澱粉分解酵素８１０１８の酵素学的性質は次
の通りである。

（１）作用及び基質特異性 （作　用） 生澱粉を分解し、オリゴ糖、マルトース、グルコースを
同時に生成する。また、α−サイクロデキストリン及び
β−サイクロデキストリンを分解する。

（基質特異性） 一定量の酵素による各種生澱粉の分解度は次の通りであ
る。

即ち、基質を０．０２Ｍリン酸緩衝液に懸濁し、酵素を
加え４５℃、４時間反応後還元糖の生成量を測定し、コ
ーンを１００とした相対活性で示す。

コーン　　　　　　　　１００ ワクシ−コーン　　　　１０３ タピオカ　　　　　　　　８９ ポテト　　　　　　　　　１５ ライス　　　　　　　　１１３ 小麦　　　　　　　　　９７ （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ：　６．０±０．５ 安定ｐＨ：　４．５〜１２ （３）至適温度及び作用適温の範囲 至適温度＝５５℃ 作用適温の範囲：４０〜７０℃ （４）　ｐＨ１温度による失活条件 ｐｏａ以下、　１２以上で失活する １０ｍＨＣａＣＱ、存在下で７０℃、３０分で失活（５
）阻害、活性化及び安定化 ５−ＡＩ　（アミラーゼ阻害剤、＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｗ、、　４１．９１９（１９７７））により非き
っ抗阻害を受ける Ｃａ＋＋による活性化及び安定化 （６）分子量 ７８　、０００　（ＳＯ８−ＰＡＧＥ法による）本発明
の生澱粉分解酵素８１０１８はバチルスｓｐ。

８１０１８によって生産される。

バチルスｓｐ、　Ｂ１０１８の菌学的性質は次に示され
る。

生澱粉分解酵素８１０１８の製造に際しては、バチルス
ｇｐ、　Ｂ１０１８を生育する培地に接種し、２０〜５
０℃で２５〜４０時間通気攪拌培養することによって、
培地中に著量の生澱粉分解酵素８１０１８を生産させる
ことができる。

培地としては、グルコース、マルトース、澱粉、コーン
スターチ等の炭素源、ポリペプトン、肉エキス、尿素、
アンモニア、無機窒素化合物等の窒素源、酵母エキス、
コーンスタープリカーなどの栄養素等から選ばれたもの
を適宜含むものがよい。

好ましくは、各種生澱粉のうちの１種または、数種を培
地に添加するのがよい。

得られた培養液は菌体を分離し、上清に生澱粉分解酵素
８１０１８を含有しているので、上清をそのまま酵素液
として使用することもできる。

また、酵素は上清から硫安沈澱法によって沈澱させて、
透析したりして粗酵素を得ることができ。

更には、透析内液をＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマ
トグラフィー、セファデックス０７５カラムクロマトグ
ラフイー、ＣＭセルロースカラムクロマトグラフィーな
どにかけて精製酵素を得ることもできる。

次に本発明の実施例、使用例を示すが、α−アミラーゼ
活性は年波の方法（（Ｆｕｗａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。

４１、５８３１９５４））に従って比活性として測定し
た。

タンパク質の測定はＬｏｖｒｙの方法（０，Ｈ，Ｌｏｗ
ｒｙ　ａｔａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　
１９３．２６５（１９５１））により、牛血清アルブミ
ンを標準として測定した。

実施例１ バチルスｓｐ、　Ｂ１０１８．　ＦＥＲＭ　Ｐ−９８４
０を５００ｍＱ三角フラスコ１０本中で、　グルコース
１．０％！ポリペプトン１．０％、生コーンスターチ０
．５％、　肉エキス０゜５％、酵母エキス０．２％（ｐ
Ｈ７，０）の組成を有する培地１００ｍＭにそれぞれ植
菌し、４５℃、３６時間振盪培養した。

得られた培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分
）して菌体を除き培養上清８２０ａ＋Ｑを得た。

この培養上清に４９６ｇの硫酸アンモニウムを加え。

０．８飽和とし、４℃で一夜放置後、タンパク質を沈殿
させ１．１３ｇ（比活性５８０　Ｕ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）を得た。

得られたタンパク質を５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ！
（８，０）に溶解し、５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）　＋　２　ｍＭ塩化カルシウムに対し透析し
た。

この透析内液をＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグ
ラフィーにかけ吸着させ、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐｔ
ｔａ、ｏ）で溶出する両分を回収した。この回収画分９
２ｍ　Ｑに硫酸アンモニウム５６ｇ（０，８飽和）を加
え、４℃、１２時間放置後、タンパク質を沈殿させた。

得られたタンパク質を更に５０１１Ｍトリス・塩酸緩衝
液（ｐＨ５，６）　＋　２　ｍＭ塩化カルシウム溶液に
対し透析した。

透析内液を更にセファデックスＧ７５カラムクロマトグ
ラフイーにかける。次いで活性画分に０．８飽和になる
ように硫安を加えタンパク質を沈殿させた。

得られたタンパク質を１０ｍＭ−酢酸緩衝液（ｐＨ５，
６）に溶解し、同一緩衝液に対し透析し透析内液をＣト
セルロース力ラムクロマトグラフィーにかけ吸着させ食
塩の濃度勾配（０−０，３Ｍ）を有する１０ｍＭ酢酸緩
衝液で溶出し、活性画分を集め、精製生澱粉分解酵素８
１０１８６．６−ｇ（収率１５．６％、比活性１５４０
０Ｕ／ａｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を得た。

実施例２ 実施例１で得られた硫酸アンモニウム０．８飽和沈澱物
を透析後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフ
ィーにかけ、第１図の溶出曲線を得た。

第１図におけるフラクションＮα３〜１５を集め。

更に硫酸アンモニウム０．８飽和でタンパク質を沈殿さ
せ、透析後、セファデックスＧ７５カラムクロマトグラ
フイーにかけ、第２図の溶出曲線を得た。

第２図におけるフラクションＮα２５〜４５を集め、再
度硫酸アンモニウム０．８飽和で沈殿させ、透析後側セ
ルロースカラムクロマトグラフィーにかけ。

第３図の溶出曲線を得た。第３図におけるフラクション
Ｎα３５〜３９を集め、凍結乾燥し、精製生澱粉分解酵
素Ｂ１０１８粉末を得た。

使用例１ 精白生米の粉末１ｇ（澱粉７７．４％、水分１４．５％
、その他８．１％）をリン酸緩衝液５００ＩＩＩｎに懸
濁し、実施例１で得られた生澱粉分解酵素８１０１８を
１０ｍｇ加え攪拌しながら、４５℃、４時間反応させた
。対照として、同様に生米粉末１ｇを０．０２Ｍリン酸
緩衝液５００ｍＱに懸濁し攪拌しながら４５℃、４時間
反応させた。

反応終了後、試験、対照各々の区分の反応液を１１００
０Ｏｒｐ、５分遠心分離することによって上澄液４８０
ｍＵと沈澱物に分けた。

各々の上澄はベーリンガー・マンハイム山之内（株）製
のグルコース測定キット（製品番号７１６２５１）でグ
ルコース量を測定した。沈澱物は１００℃、２時間乾燥
し、未分解部分の乾燥重量を測定した。

試験区分の未分解残渣の乾燥重量は３５０ｍｇであった
。同様、対照区分の乾燥重量は８４０ｍｇであった。

また、各々の上澄中のグルコース量は試験区分２、１ｍ
ｇ／ｌｏｏｍ１２であり、対照区分からは検出されなか
った。

従って、精白生米中の澱粉のうち生澱粉分解酵素８１０
１８によって約６５％、５００ｍｇが溶解したことにな
る。このうち、約２％がグルコースとして検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２におけるＤＥＡＥ−セルロースカラム
クロマトグラフィーの溶出曲線を示す図で、第２図は同
じくセファデックスＧ７５カラムクロマトグラフイーの
溶出曲線を示す図で、第３図は同じ＜ＣＭセルロースカ
ラムクロマトグラフィーの溶出曲線を示す図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）生澱粉を分解し、オリゴ糖、マルトース及びグル
   コースを生成する生澱粉分解酵素Ｂ１０１８。
2. （２）バチルス属に属する生澱粉分解酵素Ｂ１０１８生
   産菌を培養し、生澱粉分解酵素Ｂ１０１８を採取するこ
   とを特徴とする生澱粉分解酵素Ｂ１０１８の製造法。
3. （３）生澱粉分解酵素Ｂ１０１８を生産するバチルスｓ
   ｐ．Ｂ１０１８。