JPS60188061A - シユ−ドモナスｋｏ−８９４０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）
　ＫＯ−８９４０に関し、さらに詳しくはマルトペンタ
オース生成酵素の産生能を有するシュードモナス、に、
ｏ、−８９４０に関する。

近年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめられている
が、現在工業的に大量生産されているものはマルトース
のみである。マルトース以外にはマルトトリオースが試
薬用として、またマルトペンタオースがアミラーゼ活性
測定用としてそれぞれ少量生産されているにすぎない。

しかし、最近マルトトリオ−スルマルトヘキサオースの
マルトオリゴ糖を特異的に生産する微生物起源のアミラ
ーゼが次々に発見され、澱粉から各種オリゴ糖の生産が
容易に行なえるようになってきた。たとえばマルトペン
タオースに関してはＡｒｃｈ、　Ｅｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、、　１５５　、２９０　（１９７３）お
よび日本農芸化学会昭和５７年度大会要旨集１７８頁に
記載の酵素が知られている。ところが、これらの酵素は
反応初期からマルトペンタオース以外の各稲穂を生成す
るものであり、マルトペンタオースのみを生成するアミ
ラーゼは未だ知られていない。

そこで本発明者らは、デンプン類からマルトペンタオー
スを効率よく生成する酵素を産生ずる微生物の探索を行
ない、沖縄系の土壌から新しく細菌を分離し、この細菌
を培養することにより目的とするマルトペンタオース生
成酵素が得られることを見出し、この知見に基いて本発
明を完成した。

すなわち本発明は、色素を生成せず、デンプンの加水分
解が陽性であり、その分解生成物がマルトペンタオース
であり、アラビノース、キシロース、グルコース、マン
ノース、フラクトース、カラクトース、麦芽糖、シヨ糖
、乳糖、トレハロース、ソルビット、マンニット、イノ
ジット、グリセリンおよびデンプンからの酸およびガス
の生成が陰性であるシュードモナスＫＯ−８９４０に関
する。

上記特性を有する本菌は、ポテトスターチ１％。

肉エキス０．７％、ポリペプトン１％およびＮａｐｌｏ
、３％を含む培地（ｐＨ６，５）に少量の土壌を加え、
４０℃で３日間培養することにより得られ、この方法を
繰返して本菌を単離した。

以下に、シュードモナスＮＯ−３９４０の菌学的性質を
記載する。

１、形態的性質 栄養細胞の大きさは０．５〜０．７５μ×１〜３μ（０
，５μ×２μ）で桿菌であり、胞子は形成しな鞭毛は極
鞭毛であり、運動性がある。（第１図参照） ダラム染色性は陰性であり、抗酸性はない。

尚、上記の形態は肉エキス１０１．ペプトン１０、ｉｉ
ｌ、　ＮａＣ１５ｇ、寒天１５ｇ、水１　ｌ（ｐＩＩ７
．４　）の組成の培地における生育状態について観察さ
れたものである。

２、各種培地上での生育状態 肉汁寒天平板培養では点状１台状で波状、表面はしわ状
でにぷい光沢があり、半透明、色調はやや赤みのかかっ
た乳白色を示す。

肉汁寒天斜面培養では接種線上に一様に生育し、辺縁は
鋸歯状、隆起は薄く、表面は平滑あるいはしわ状で湿っ
ている。にぶい光沢があり、半透明で、やや赤味のかか
った乳白色を示す。

肉汁液体培養では混濁し菌膜が生成する。

肉汁ゼラチン穿刺培養ではほとんど生育しないため、ゼ
ラチンの液化は認められない。

リドマスミルク（１０％ｐＨ７）での生育状態は悪い。

ｐＨはややアルカリ側で凝固は認められない。

３、生理的性質 生育ｐＨの範囲はｐＩ（６〜９であり、ｐＨ７，５〜８
が最適である。

生育温度の範囲は４５℃以下であり、４０℃付近が最適
である。

硝酸塩を還元し、脱窒反応は陽性であるが、ガスの発生
は認められない。

ＭＲテス）、ＶＰ反応、ウレアーゼ反応は陰性である。

インドール、硫化水素の生成は認められな（・。

オキシダーゼ反応、カタラーゼ反応は陽性である。

クエン酸、硝酸塩、アンモニウム塩を利用して生育する
。

デンプンの加水分解は陽性である。

色素は生成しない。

酸素に対する態度は好気的である。

２％食塩で良好に生育するが３％以上では生育しない。

０−Ｆテストは好気的でわずかに生育するが、酸の生成
は認められない。

アラビノース、キシロース、クルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトース、麦芽糖。

シヨ糖、’ＪＬｍ、）レバロース、ソルビット。マンニ
ット、イノジット、グリセリン、デンプンを含む培地に
生育するが、酸の生成およびガスの発生は認められない
。

以上の性質をＢｅｒｇｅｙｌｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
（第８版）の分類基準により検索すると、本菌はシュー
ドモナス属に分類される。本菌をシュードモナス属に属
する既知の類縁菌と比較すると、以下のような差異が認
められる。

第１表 十：陽性、−：陰性、ｄ：菌株により反応が異なる。・
：不明■　シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓ、　ａ
ｅｒｕｇｉｎ０８ａ　）■　シュードモナス・フルオレ
センス（Ｐｓ、。ｆ／ｕｏｒｅｓ５ｑ−ｎｓ　）■　シ
ュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓ、、ｍａ／１ｏｐ
ｈμユ八）■　シュート箋ナス・ストウラエリ　（ヱｓ
、５ｔｕｔｚｅｒｉ　）■　シュードモナス・シュード
マレイ（Ｐｓ、ｐｓｅｕｄｏｍａ／Ｊμ↓）■本菌 上表から明らかなようＫ、本菌は類縁菌とは諸性質が異
なっており、本菌に最も類似しているシュードモナス・
ストウラエリは上記性質のほか外観的にも相違点がある
。すなわち、肉汁寒天斜面培養においてシュードモナス
・ストウラエリは辺縁２表面ともに滑らかであり、赤味
を帯びているのに対し、本菌は辺縁は鋸歯状で、表面も
しわ状であり、やや赤味のかかった乳白色である。その
ほか、本菌は各種の糖を含む培地で生育するが、酸を生
成しない点で既知の類縁菌と明らかな差異がある。

したがって、本菌は新菌であると考えられ、本発明者ら
は本菌をシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　８ｐ、　）　ＫＯ−８９４０と命名した。本菌
は工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＮ　Ｐ−７
４５６として受託されている。

本発明の微生物は新規なマルトペンタオース生成酵素を
生産する能力を有している。本酵素を生産するための微
生物の培養条件について検討した。

まず、基本培地として肉エキス、ポリペプトン。

食塩および炭素源を含むものを用い、炭素源については
第２表に示した各種物質を１％使用した。

この培地にシュード％　；）−スＫＯ−８９４０（ＦＥ
ＢＭ　Ｐ−７４５６）を植菌し、４０℃で３日間振と５
墳養を行なった。このときの活性比率（マルトースを１
００としたときの値）を第２表に示す。表から明うカな
ように、炭素源としてはマルトースが最良であり、デン
プンの中では米デンプン、甘藷デンプンを用いたときに
かなり高い活性が得られた。

また、各種粉アメを用いたときの活性比率はＴ）Ｂが高
くなると共に高くなり、ハイマルトースシロップではマ
ルトースと同程度の活性が得られた。

７・′ ／″′ 第　２　表 炭　素　源　ＩＵ／罰　活性比率 グ　ル　コ　−　ス　０．０　１　１．５７ラクトース
　０．０２　２．９ シユクロース　０．０３　４．４ マ　ル　ト　−　ス　０．６　８　１　０　０ハイマル
トースシロツプ　０．６　７　９　８．５アミｏ−ス（
ＤＰ　１００）　０．２４　３５．３可溶性デンプン　
０．２２　３２．４ 馬鈴１デンプン　０．１５　２２．１ 甘藷デンプン　０．３０　４４．１ 米　デ　ン　プ　ン　０．４　２　６　１．８タピオカ
デンプン　０．１０　１４．７トウモロコンデンプン　
０．１０　１４．７モチトウモロコシデンブン　０．１
　５　２　２．１小麦デンプン　Ｏ。

サゴデンプン　０．１４　２０．６ サイクロデキストリン粉アメ　０．４　１　６　０．３
コーンスチープリカ−０，２３３３，８次に、窒素源に
ついて検討するため、肉エキス０．７％、マルトース１
％１食塩０．３％を含む培地に各種物質１％を添加し、
４０℃で３日間振と５培養を行なった。このときの活性
比率（硫酸アンモニウムを１００としたときの値）を第
３表に示す。表から明らかなように、硫酸アンモニウム
または硝酸アンモニウムを用いたときに著しく高い活性
が得られた。

第　３　表 ペ　プ　ト　ン　０．６４　１　５．８ポリペプトン　
０．３５　８．６ カ　ゼ　イ　ン　０．４　８　１　１．９カザミノ酸　
０．２１　５．２ ポテトプロテイン　００ 酢酸アンモニウム　００ 硫酸アンモニウム　４．０５　１００ 硝酸アンモニウム　３．４２　８４．４尿　素　０　０ 無添加　Ｏｏ さらに、マルトース、硫酸アンモニウムおよび肉エキス
のそれぞれの濃度について検討した結果、最適の培地組
成はマルトース０．８％、硫酸アンモニウム１％および
肉エキス０．８％を含むものであることが判明した。し
たがって、培養に用いる培地としては、上記知見を参考
にして、供試菌株が良好な活性にて目的とする酵素を生
産し得る組成のものを選定すべきである。

次に、培養日数による活性変化について検討したところ
、第３図に示すような結果が得られた。

図示１−だ如く、培養１日で７０％以上の活性が得られ
、３日目まで徐々に活性は上昇する。しかし、その後は
活性が減少する。したがって、酵素の生産には１〜３日
間の培養が適当であり、通常は３日間培養した後、培養
液中の不溶分等を遠沈除去して得た上澄を粗酵素として
用いればよい。なお、培養売件については目的とする酵
素の生産量が最大となるように選定すべきである。また
、培養液から酵素を採取・精製するには既知の方法を適
当に組合せて行なえばよい。

酵素の精製は各種の方法により行なうことが出来るが、
その１例を示すと、次の通りである。

４℃の低温で、粗酵素液に硫酸アンモニウムを加え、０
．２〜０．５飽和で沈殿する両分を集め、１０ｍＭ　Ｉ
Ｊン酸緩箭液（ｐＨ７，５）に溶解する。この酵素液を
同縁ｔ’ｉ液に対して一晩透析したものについて以後の
操作を行なう。なお、この硫安塩析での回収率は約８０
％である。次に、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト
グラフィー、ゲル瀝過クロマトグラフィーなどにより精
製してディスクゲル電気泳動的に単一バンドを示す標品
を得ることができる（第２図）。

このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の性質を検
討した。結果を以下に示す。

＋１）　作用 本酵素を可酸性デンプンに作用させたときの反応経過は
第４図および第５図に示したとおりである。図から明ら
かなように、本酵素は反応初期にマルトペンタオースを
生成し、その後時間の経過と共にマルトースとマルトト
リオースに水解される。

したがって、マルトペンタオースを効率的に生産するに
は、本酵素を、たとえばメンプランリアクターのような
容器中で液化デンプンに作用させ、生成糖を限外ｐ過膜
を用いて反応系外に取り出す方法を採用することが望ま
しい。

本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下のオリゴ
糖を基質にした場合、次の通りである。

なお、略号はＧ□ニゲルコース、　ＧＱ：マルトース。

Ｇａ’マルトトリオース、・・・Ｇ、：マルトペンタオ
ース、・・・Ｇ８：マルトオクタオースを示す。

Ｇ８：　→Ｇｓ　＋　Ｇ＠ Ｇフ　：　ｏ−ｏ−ｏ−ｏ−（）−（）−Ｃグ　→　Ｇ
ｓ　＋　ＧＱＧｓ’０（）（）−□−０−Ｖ　→Ｇ、　
＋　Ｇ。

Ｇ、’　ｕ−１→Ｇ８＋　Ｏ。

Ｇ４：０Ｏ−Ｏ−Ｇ５　→Ｇ９　＋　Ｇ１１Ｇ、　、　
ＧＱ：作用しない この作用形式から、Ｇ９とＧｓの混合物を生産し、酵母
によりＧ９を消化させてＧ、を製品としたり、またＧ９
と０８の混合物を製品とすることもできる。

このように、重合度が小さい基質を用いた場合、本酵素
はいわゆるＥＸＯ型のアミラーゼとしての作用を示すが
、重合度の大きいデキストリンにはＥｎｄｏ型のアミラ
ーゼとして作用する。したがって、デンプンは本酵素の
作用によって切り残しはなく大部分がＧδまたはＧＱと
Ｇ８に変換する。この際、プルラナーゼ等の枝切り酵素
を共存させれば、Ｇ６の収率な向上させることができる
。

（２）　作用至適ｐＥおよびｐｍ安定性反応液組成を とし、４５℃で１５分間反応させて還元力を測定し、最
高値を１００として表わしたときの結果を第６図に示す
。図から明らかなように、本酵素の至適ｐＨは６〜７で
ある。

また、ｐＨ安定性については、本酵素液１Ｍに各種ｐｕ
の１０　ｍ’Ｍ緩衝液（ｐＨ４〜６：酢酸緩衝液。

ｐＨ６〜８ニリン酸緩衝液、ｐｕｓ〜９ニドリス−塩酸
緩衝液＋ｐＨ９〜１０：炭酸ソーダ緩衝液）０．１１Ｉ
Ｌｅを加え、４５℃で６０分間静置した後、各ｏ、ｉ　
ｙずつを採り１００　ｍＭリン酸Ｂ衝液（ｐＨ６，５）
　０．４　ＷＬｌおよび２％基質液０．５　ｄを加えて
４５℃にて３００分間反応せ、残存酵素活性を測定した
。結果を第７図に示す。第７図に示したように、本酵素
はｐｕ　６．５〜９．０の範囲で安定である。

（３）　酵素力価の測定法 酵素の活性は、可溶性デンプン（メルク社製。

分析用）を還元して基質として用い、ソモジー・　・ネ
ルノン法により還元力を測定し、４５℃で１分間に１マ
イクロモル等量のグルコシド結合を切断する酵素量をＩ
ＩＵ（国際単位）とした。

（４）作用至適温度と温度安定性 反応液組成を とし、各種の温度で１５分間反応させて還元力を測定し
、最高値を１００として表わしたときの結果を第８図に
示す。図から明らかなように、本酵素の作用至適温度は
５０〜５５℃である。

またｐＪ１６．５で各種温度に１５分間静置した後、４
５℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結果を第９
図に外す。第９図から明らかなように、５５℃以上では
急激に失活する。

（５）阻害、活性化および安定化 本酵素は０．４ｍＭバララクロロ安息香酸第二水銀およ
び１　ｍＭモノヨードアセトアミド溶液中では阻害を受
けるが、阻害率は４０〜５０％であり高（はない。

次に、各種金属イオン（１ｍＭＪ度）の影響は水銀、亜
鉛、銅および欽による阻害率が８０％以上という高い値
を示し、鉄で５０％である。また、カルシウムイオンは
本酵素の耐熱性を５℃高める。

（６）　分子量 ディスクゲル電気泳動法によって得られた本酵素の分子
量は７２５００土２５００である。

（７）等電点 アンフオライン電気泳動法によってめられた等電点はｐ
Ｈ６，５である。

（８）結晶構造および元素分析 本酵素については未だ結晶標品が得られていないが、電
気泳動で単一バンドを示す精製標品を得ている。

以上に示した性質を有する本酵素は従来のＵ１素と全く
異なる作用を示し、マルトペンタオースを大量に生成す
る新規な酵素である。本発明者らは、本酵素ヲ１　、４
−α−Ｄ−グルカンマルトペンタオハイドロラーゼと命
名した。

前述したように、本酵素はアミロース、可溶性澱粉、各
゛種澱粉に作用してマルトペンタオースを生成する。し
たがって、澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の分解反応
生成物のうちの少な（とも１種の物質に本酵素を作用さ
せることにより、マルトペンタオースが生成・蓄積する
。反応を行なうにあたり、本酵素の性質を考慮してマル
トペンタオースの生成量が最大となるような条件を選シ
己すべきである。ここで澱粉としては、たとえば馬鈴ｉ
、せＭ、）ウモロコシ、モチトウモロコシ、大麦、小麦
、米、タピオカ、サゴなどの任意の原料から得られるも
のを使用することができる。また、澱粉の組成画分とし
ては、たとえばアミロース。

アミロペクチンなどがあり、澱粉の分解反応生成物とし
ては、たとえば白色デキストリン、黄色デキストリン、
ブリティッシュガムなどの焙焼デキス）　ＩＪン；酸化
澱粉、低粘性変性（酵素、酸１機械高速攪拌等の処理に
よる）澱粉などの化工澱粉ｉリン酸澱粉、酢酸澱粉など
で代表される澱粉エーテル、りＱ粉エステルなどの澱粉
誘導体；放射線や中性子線を照射したり高周波処理ある
いは湿熱処理した澱粉などの物理的処理澱粉；α−澱粉
などを挙げることができる。これらの澱粉類は単独もし
くは２種以上を組合せて用いる。

反応終了後、加熱して酵素を失活させて反応を停止し、
反応液から常法によってマルトペンタオースを得ること
ができる。

マルトペンタオースは現在、α−アミラーゼ活性測定用
基質として診断薬、試薬などへの用途があり、本酵素が
本発明によって安価に生産されれば、食品をはじめ各種
用途も拓けるものと期待される。マルトペンタオースは
溶解性に優れ、甘味がなく、ボディ感があるので製菓用
劇料として有用であり、また消化・吸収性が良いので、
幼児。

老人、患者用の滋養食としての利用も可能である。

次に、本発明の微生物によるマルトペンタオース生成酵
素の製造例を゛示す。

製造例１ シュードモナスＫＯ−８９４０（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４５
６）ヲ肉エキス０．８％、硫酸アンモニウム１％、マル
トース帆８％の斜面寒天培地に接種し、４０℃で２日間
培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成の液体培地
（１００＃α培地１５０　ＱｍＪ三角フラスコ）に移し
、４５℃で３日間通気振と５培養を行なった。

培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶物を遠沈
除去して上澄を得、これを粗酵素とした。

この粗酵素液の活性は３．８　ＩＵ／ｄであった。

製造例２ シュードモナスＫＯ−８９４０（ＦＥＢＭ　Ｐ−７４５
６）の培養液を少量とり、常法によりＲＩ、ＵＶ、ニト
ロソグアニジンで処理した後、平板培養を行ないアミラ
ーゼ活性の高いコロニーをとった。これを肉エキス０．
８％、硫酸アンモニウム１％、マルトース０．８％の培
地で４５℃にて３日間培養し、その後の燥作は製造例１
と同様にした。本粗酵素液の活性は８．ＯＩＵ／ｍ／、
であった。

参考例１ 馬鈴第澱粉を細菌液化型酵素（ＢＬＡ　）により液化し
、ヨウ素−澱粉反応が青色で失活処理し、基質濃度１０
％、マルトペンタオース生成酵素（製造例２０粗酵素液
）　１　１Ｕ／ｇ基質、　ｐＩ１５．Ｑ、　４５０Ｃで
６時間攪拌しながら反応せしめマルトペンタオースを３
０％含む反応液を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナスＫＯ−８９４０のネガティブ染
色による電子細微鋭写真、第２図は精製酵素のディスク
ゲル電気泳動写真、第３図は培養日数による活性変化と
ｐＨ変化を示すグラフ、第４図はマルトペンタオース生
成酵素の反応経過（１’ＩＵ／ｇ基質）を示すグラフ、
第５図を１本酵素の反応経過（Ｉ　ＩＵ／］　０ｍ９基
質）を示すグラフ、第６図は本酵素の至適ｐＨを示すグ
ラフ、第７図は本酵素のｐＩ（安定性を示すグラフ、第
８図は本酵素の至適温度を示すグラフ、第９図は本酵素
の温度安定性を示すグラフである〇 特許出願人　農林水産省食品総合研究所長塩水港精糖株
式会社 第１図 第２図 第３図 ０　１　２３４５ 鉗慶８ａ。 第４図 Ｇ・・も Ｇ２・　− ５ｔ　Ｏ５ｌｏ　１５　２０　３０４５　６０９０　！
２０　Ｓｔ反応・時間（サラ 第５図 Ｇ１噸−Φ Ｇ２・　０・・・・・・ Ｓｔ　Ｏｆ　２　５　１ｏ　３０　６０１２０１８０３
６０　Ｓｔ反応Ｖ令聞を側 第６図 Ｈ 第７図 ５７９１１ 第８図 ２０　３０　４０　５０　６０　７０ 過展（”Ｃ） 第９図 ２０　３０　４０　５０　６０ 遥度（”Ｃ） 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 色素を生成せず、デンプンの加水分解が陽性であり、そ
   の分解生成物がマルトペンタオースであす、アラビノー
   ス、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトー
   ス、ガラクトース、麦芽糖。 シヨ！、乳！、）レバロース、ソルビット、マンニット
   、イノジット、グリセリンおよびデンプンからの酸およ
   びガスの生成が陰性であるシュードモナスＫＯ−８９４
   ０゜