JPS6344360B2

JPS6344360B2 -

Info

Publication number: JPS6344360B2
Application number: JP59044069A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Kobayashi; Takashi Okemoto; Keiji Kainuma; Hitoshi Hashimoto; Kozo Hara
Original assignee: Ensuiko Seito Kk; NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Current assignee: Ensuiko Seito Kk; NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1984-03-09
Publication date: 1988-09-05
Also published as: JPS60188065A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規はマルトペンタオース生成酵素お
よびその製造方法に関する。近年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめら
れているが、現在工業的に大量生産されているも
のはマルトースのみである。マルトース以外には
マルトトリオースが試薬用として、またマルトペ
ンタオースがアミラーゼ活性測定用としてそれぞ
れ少量生産されているにすぎない。しかし、最近マルトトリオース〜マルトヘキサ
オースのマルトオリゴ糖を特異的に生産する微生
物起源のアミラーゼが次々に発見され、澱粉から
各種オリゴ糖の生産が容易に行なえるようになつ
てきた。たとえばマルトペンタオースに関しては
Arch.Biochem.Biophys..，155290（1973）および
日本農芸化学会昭和57年度大会要旨集178頁に記
載の酵素が知られている。ところが、これらの酵
素は反応初期からマルトペンタオース以外の各種
糖を生成するものであり、マルトペンタオースの
みを生成するアミラーゼは未だ知られていない。本発明者らはマルトペンタオースを効率よく生
成し得る酵素を検索すべく研究を重ねた。その過
程でシユードモナス属に属する微生物を培養する
ことにより目的とするマルトペンタオース合成酵
素が得られることを見出し、本発明を完成するに
至つた。本発明は、第１に以下に示す性質を有する新規
なマルトペンタオース生成酵素に関する。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
6.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.5において至適温度は50〜55℃
であり、55℃以上の温度で15分間放置すると失
活する。 (4) 本酵素は0.4mMパラクロロ安息香酸第二水
銀および1mMモノヨードアセトアミド溶液中
で阻害を受けるが、阻害率は40〜50％である。 (5) 本酵素の分子量は72500±2500（デイスクゲル
電気泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH6.5（アンフオライン電気
泳動法による）である。第２に本発明は、シユードモナス
（Pseudomonas）属に属し、上記の性質を有する
新規なマルトペンタオース生成酵素の生産能を有
する微生物を培養し、培養物中に該酵素を蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする新規なマ
ルトペンタオース生成酵素の製造方法である。本発明の新規なマルトペンタオース生成酵素は
微生物を用いて生産され、その生産菌としてはシ
ユードモナス属に属し、上記性質を有する酵素を
生産する能力を有するものであればよく、たとえ
ばシユードモナスKO―8940がある。本発明に用
いる微生物としては本菌株とその変種、変異株に
制限されるものではなく、上記酵素の生産能を有
するものであればよい。ここで変異手段としては
常法のものでよく、たとえばラジオアイソトープ
（RI）、紫外線（UV）、ニトロソグアニジンなど
を用いて行なえばよい。以下に、シユードモナスKO―8940の菌学的性
質を記載する。１形態的性質栄養細胞の大きさは0.5〜0.75μ×１〜3μ（0.5μ×
2μ）で桿菌であり、胞子は形成しない。鞭毛は極鞭毛であり、運動性がある（第１図参
照）グラム染色性は陰性であり、抗酸性はない。尚、上記の形態は肉エキス10g、ペプトン10g，
NaCl5g，寒天15g，水１（PH7.4）の組成の培
地における生育状態について観察されたものであ
る。。２各種培地上での生育状態肉汁寒天平板培養では点状、台状で波状、表面
はしわ状でにぶい光沢があり、半透明、色調はや
や赤みのかかつた乳白色を示す。肉汁寒天斜面培養では接種線上に一様に生育
し、辺縁は鋸歯状、隆起は薄く、表面は平滑ある
いはしわ状で湿つている。にぶい光沢があり、半透明で、やや赤味のかか
つた乳白色を示す。肉汁液体培養では混濁し菌膜が生成する。肉汁ゼラチン穿刺培養ではほとんど生育しない
ため、ゼラチンの液化は認められない。リトマスミルク（10％PH７）での生育状態は悪
い。 PHはややアルカリ側で凝固は認められない。３生理的性質生育PHの範囲はPH６〜９であり、PH7.5〜８が
最適である。生育温度の範囲は45℃以下であり、40℃付近が
最適である。硝酸塩を還元し、脱窒反応は陽性であるが、ガ
スの発生は認められない。 MRテスト、VP反応，ウレアーゼ反応は陰性
である。インドール，硫化水素の生成は認められない。
オキシダーゼ反応，カタラーゼ反応は陽性であ
る。クエン酸，硝酸塩，アンモニウム塩を利用して
生育する。デンプンの加水分解は陽性である。色素は生成しない。酸素に対する態度は好気性である。２％食塩で良好に生育するが３％以上では生育
しない。Ｏ―Ｆテストは好気性でわずかに生育するが、
酸の生成は認められない。アラビノース，キシロース，グルコース，マン
ノース，フラクトース，ガラクトース，麦芽糖，
シヨ糖，乳糖，トレハロース，ソルビツト，マン
ニツト，イノシツト，グリセリン，デンプンを含
む培地に生育するが、酸の生成およびガスの発生
は認められない。以上の性質より本菌株はシユードモナス属に分
類される。本発明者らは本菌株をシユードモナ
ス・エスピーKO―8940（Pseudomonas sp.KO
―8940）と命名した。本菌株は工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されており、その受託番号
はFERM Ｐ―7456である。次に、本発明の新規なマルトペンタオース生成
酵素を生産するための微生物の培養条件について
検討した。まず、基本培地として肉エキス，ポリ
ペプトン，食塩および炭素源を含むものを用い、
炭素源については第１表に示した各種物質を１％
使用した。この培地にシユードモナスKO―8940
（FERM Ｐ―7456）を植菌し、40℃で３日間振
とう培養を行なつた。このときの活性比率（マル
トースを100としたときの値）を第１表に示す。
表から明らかなように、炭素源としてはマルトー
スが最良であり、澱粉の中では米澱粉，甘藷澱粉
を用いたときにかなり高い活性が得らられた。ま
た、各種粉アメを用いたときの活性比率はDEが
高くなると共に高くなり、ハイマルトースシロツ
プではマルトースと同程度の活性が得られた。

【表】次に、窒素源について検討するため、肉エキス
0.7％，マルトース１％，食塩0.3％を含む培地に
各種物質１％を添加し、40℃で３日間振とう培養
を行なつた。このときの活性比率（硫酸アンモニ
ウムを100としたときの値）第２表に示す。表か
ら明らかなように、硫酸アンモニウムまたは硝酸
アンモニウムを用いたときに著しく高い活性が得
られた。

【表】さらに、マルトース，硫酸アンモニウムおよび
肉エキスのそれぞれの濃度について検討した結
果、最適の培地組成はマルトース0.8％，硫酸ア
ンモニウム１％および肉エキス0.8％を含むもの
であることが判明した。したがつて、培養に用い
る培地としては、上記知見を参考にして、供試菌
株が良好な活性にて目的とする酵素を生産し得る
組成のものを選定すべきである。次に、培養日数による活性変化について検討し
たところ、第３図に示すような結果が得られた。
図示した如く、培養１日で70％以上の活性が得ら
れ、３日目まで徐々に活性は上昇する。しかし、
その後は活性が減少する。したがつて、酵素の生
産には１〜３日間の培養が適当であり、通常は３
日間培養した後、培養液中の不溶分等を遠沈除去
して得た上澄を粗酵素として用いればよい。な
お、培養条件については目的とする酵素の生産量
が最大となるように選定すべきである。また、培
養液から酵素を採取・精製するには既知の方法を
適当に組合せて行なえばよい。酵素の精製は各種の方法により行なうことが出
来るが、その１例を示すと、次の通りである。４℃の低温で、粗酵素液に硫酸アンモニウムを
加え、0.2〜0.5飽和で沈澱する画分を集め、
10mMリン酸緩衝液（PH7.5）に溶解する。この
酵素液を同緩衝液に対して一晩透析したものにつ
いて以後の操作を行なう。尚、この硫安塩析での
回収率は約80％である。次に、DEAE―セルロー
スカラムクロマトグラフイー，ゲル過クロマト
グラフイーなどにより精製してデイスクゲル電気
泳動的に単一バンドを示す標品を得ることができ
る（第２図）。このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の
性質を検討した。結果を以下に示す。 (1) 作用本酵素を可溶性澱粉に作用させたときの反応経
過は第４図および第５図に示したとおりである。
図から明らかなように、本酵素は反応初期にマル
トペンタオースを生成し、その後時間の経過と共
にマルトースとマルトトリオースに水解される。したがつて、マルトペンタオースを効率的に生
産するには、本酵素を、たとえばメンブランリア
クターのような容器中で液化澱粉に作用させ、生
成糖を限外過膜を用いて反応系外に取り出す方
法を採用することが望ましい。本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下
のオリゴ糖を基質にした場合、次の通りである。
なお、略号はG₁：グルコース，G₂：マルトース，
G₃：マルトトリオース，G₅：マルトペンタオー
ス，G₈：マルトオクタオースを示す。 G₈：〇―〇―〇―〇―〇―〇―〇―○／→G₅＋G₃ G₇：〇―〇―〇―〇―〇―〇―○／ →G₅＋G₂ G₆：〇―〇―〇―〇―〇―○／ →G₅＋G₁ G₅：○―〇―〇―〇―○／ →G₃＋G₂ G₄：〇―〇―〇―○／ →G₂＋G₂ G₃，G₂：作用しないこの作用形式から、G₂とG₃の混合物を生産し、
酵母によりG₂を消化させてG₃を製品としたり、
またG₂とG₃の混合物を製品とすることもできる。このように、重合度が小さい基質を用いた場
合、本酵素はいわゆるExo型のアミラーゼとして
の作用を示すが、重合度の大きいデキストリンに
はEndo型のアミラーゼとして作用する。したが
つて、澱粉は本酵素の作用によつて切り残しはな
く大部分がG₅またはG₂とG₃に変換する。この際、
プルラナーゼ等の枝切り酵素を共存させれば、
G₅の収率を向上させることができる。 (2) 作用至適PHおよびPH安定性反応液組成を基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 各種のPHの緩衝液（100mM） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、45℃で15分間反応させて還元力を測定し、
最高値を100として表わしたときの結果を第６図
に示す。図から明らかなように、本酵素の至適PH
は６〜７である。また、PH安定性については、本酵素液１mlに各
種PHの10mM緩衝液（PH４〜６：酢酸緩衝液，PH
６〜８：リン酸緩衝液，PH８〜９：トリス―塩酸
緩衝液，PH９〜10：炭酸ソーダ緩衝液） 0.1mlを加え、45℃で60分間静置した後、各0.1ml
ずつを採り100mMリン酸緩衝液（PH6.5）0.4mlお
よび２％基質液0.5mlを加えて45℃にて30分間反
応させ、残存酵素活性を測定した。結果を第７図
に示す。第７図に示したように、本酵素はPH6.5
〜9.0の範囲で安定である。 (3) 酵素力価の測定法酵素の活性は、可溶性澱粉（メルク社製，分析
用）を還元して基質として用い、ソモジー・ネル
ソン法により還元力を測定し、45℃で１分間に１
マイクロモル等量のグルコシド結合を切断する酵
素量を1IU（国際単位）とした。 (4) 作用至適温度と温度安定性反応液組成を基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 100mMリン酸緩衝液（PH6.5） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、各種の温度で15分間反応させて還元力を測
定し、最高値を100として表わしたときの結果を
第８図に示す。図から明らかなように、本酵素の
作用至適温度は50〜55℃である。またPH6.5で各種温度に15分間静置した後、45
℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結果を
第９図に示す。第９図から明らかなように、55℃
以上では急激に失活する。 (5) 阻害，活性化および安定化本酵素は0.4mMパラクロロ安息香酸第二水銀
および1mMモノヨードアセトアミド溶液中では
阻害を受けるが、阻害率は40〜50％であり高くは
ない。次に、各種金属イオン（1mM濃度）の影響は
水銀，亜鉛，銅および銀による阻害率が80％以上
という高い値を示し、鉄で50％である。また、カ
ルシウムイオンは本酵素の耐熱性を５℃高める。 (6) 分子量デイスクゲル電気泳動法によつて得られた本酵
素の分子量は72500±2500である。 (7) 等電点アンフオライン電気泳動法によつて求められた
等電点はPH6.5である。 (8) 結晶構造および元素分析本酵素については未だ結晶標品が得られていな
いが、電気泳動で単一バンドを示す精製標品を得
ている。以上に示した性質を有する本酵素は従来の酵素
と全く異なる作用を示し、マルトペンタオースを
大量に生成する新規な酵素である。本発明者ら
は、本酵素を１，４―α―Ｄ―グルカンマルトペ
ンタオハイドロラーゼと命名した。前述したように、本酵素はアミロース，可溶性
澱粉，各種澱粉に作用してマルトペンタオースを
生成する。したがつて、澱粉，澱粉の組成画分お
よび澱粉の分解反応生成物のうちの少なくとも１
種の物質に本酵素を作用させることにより、マル
トペンタオースが生成・蓄積する。反応を行なう
にあたり、本酵素の性質を考慮してマルトペンタ
オースの生成量が最大となるような条件を選定す
べきである。ここで澱粉としては、たとえば馬鈴
薯、甘藷，トウモロコシ，モチトウモロコシ，大
麦，小麦，米，タピオカ，サゴなどの任意の原料
から得られるものを使用することができる。ま
た、澱粉の組成画分としては、たとえばアミロー
ス，アミロペクチンなどがあり、澱粉の分解反応
生成物としては、たとえば白色デキストリン，黄
色デキストリン，ブリテイツシユガムなどの焙焼
デキストリン；酸化澱粉，低粘性変性（酵素，
酸，機械高速撹拌等の処理による）澱粉などの化
工澱粉；リン酸澱粉，酢酸澱粉などで代表される
澱粉エーテル，澱粉エステルなどの澱粉誘導体；
放射線や中性子線を照射したり高周波処理あるい
は湿熱処理した澱粉などの物理的処理澱粉；α―
澱粉などを挙げることができる。これらの澱物類
は単独もしくは２種以上を組合せて用いる。反応終了後、加熱して酵素を失活させて反応を
停止し、反応液から常法によつてマルトペンタオ
ースを得ることができる。マルトペンタオースは現在、α―アミラーゼ活
性測定用基質として診断薬，試薬などへの用途が
あり、本酵素が本発明によつて安価に生産されれ
ば、食品をはじめ各種用途も拓けるものと期待さ
れる。マルトペンタオースは溶解性に優れ、甘味
がなく、ボデイ感があるので製菓用材料として有
用であり、また消化・吸収性が良いので幼児，老
人，患者用の滋養食としての利用も可能である。次に、実施例により本発明を説明する。実施例１シユードモナスKO―8940（FERM Ｐ―7456）
を肉エキス0.8％，硫酸アンモニウム１％，マル
トース0.8％の斜面寒天培地に接種し、40℃で２
日間培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成
の液体培地（100ml培地／500ml三角フラスコ）に
移し、45℃で３日間通気振とう培養を行なつた。培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶
物を遠沈除去して上澄を得、これを粗酵素とし
た。この粗酵素液の活性は3.8IU／mlであつた。実施例２シユードモナスKO―8940（FERM Ｐ―7456）
を培養液を少量とり、常法によりRI.UV.ニトロ
ソグアニジンで処理した後、平板培養を行ないア
ミラーゼ活性の高いコロニーをとつた。これを肉
エキス0.8％，硫酸アンモニウム１％，マルトー
ス0.8％の培地で45℃にて３日間培養し、その後
の操作は実施例１と同様にした。本粗酵素液の活
性は8.0IU／mlであつた。応用例１馬鈴薯澱粉を細菌液化型酵素（BLA）により
液化し、ヨウ素―澱粉反応が青色で失活処理し、
基質濃度10％，マルトペンタオース生成酵素（実
施例２の粗酵素液）１ IU／ｇ基質，PH6.0.45℃
で６時間撹拌しながら反応せしめマルトペンタオ
ースを30％含む反応液を得た。応用例２応用例１のようにして液化馬鈴薯澱粉液を作
り、基質濃度20％，マルトペンタオース生成酵素
（実施例２の粗酵素液）１ IU／ｇ基質，PH6.0，
45℃で限外過器〔東洋紙(株)製、UHP―76（膜
はUK―10）〕中で窒素ガスで圧力をかけながら
反応させてマルトペンタオースを80％以上含む糖
液を得た。収率は12時間反応で出発基質の60％で
あり、得られた糖液は逆浸透膜で20％にまで濃縮
することができた。応用例３プルラナーゼを1IU／5g基質に加えたこと以外
は応用例２と同様に操作し、12時間の反応でマル
トペンタオースを80％以上含む糖液を収率65％で
得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はシユードモナスKO―8940の形態を示
すネガテイブ染色による電子顕微鏡写真、第２図
は精製酵素のデイスクゲル電気泳動写真、第３図
は培養日数による活性変化とPH変化を示すグラ
フ、第４図はマルトペンタオース生成酵素の反応
経過（１ IU／ｇ基質）を示すグラフ、第５図
は本酵素の反応経過（1IU／10mg基質）を示すグ
ラフ、第６図は本酵素の至適PHを示すグラフ、第
７図は本酵素のPH安定性を示すグラフ、第８図は
本酵素の至適温度を示すグラフ、第９図は本酵素
の温度安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の性質を有する新規なマルトペンタオー
ス生成酵素。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
6.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.5において至適温度は50〜55℃
であり、55℃以上の温度で15分間放置すると失
活する。 (4) 本酵素は0.4mMパラクロロ安息香酸第二水
銀および1mMモノヨードアセトアミド溶液中
で阻害を受けるが、阻害率は40〜50％である。 (5) 本酵素の分子量は72500±2500（デイスクゲル
電気泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH6.5（アンフオライン電気
泳動法による）である。２シユードモナス属に属し、下記の性質を有す
る新規なマルドペンタオース生成酵素の生産能を
有する微生物を培養し、培養物中に該酵素を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする新規な
マルトペンタオース生成酵素の製造方法。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
6.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.5において至適温度は50〜55℃
であり、55℃以上の温度で15分間放置すると失
活する。 (4) 本酵素は0.4mMパラクロロ安息香酸第二水
銀および1mMモノヨードアセトアミド溶液中
で阻害を受けるが、阻害率は40〜50％である。 (5) 本酵素の分子量は72500±2500（デイスクゲル
電気泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH6.5（アンフオライン電気
泳動法による）である。３シユードモナス属に属する新規なマルトペン
タオース生成酵素の生産菌がシユードモナスKO
―8940（FERM Ｐ―7456）である特許請求の範
囲第２項記載の製造方法。４シユードモナス属に属する新規なマルトペン
タオース生成酵素の生産菌を、炭素源としてマル
トース、マルトースを含む水アメ、澱粉および可
溶性澱粉のいずれかを含む培地に培養する特許請
求の範囲第２項記載の製造方法。