JPH029798B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の目的］ 本発明は新規なマルトペンタオース生成酵素を
用いてマルトペンタオースを製造する方法に関す
る。 ［従来技術及び発明が解決しようとする問題点］ 近年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめら
れているが、現在工業的に大量生産されているも
のはマルトースのみである。マルトース以外には
マルトトリオースが試薬用として、またマルトペ
ンタオースがアミラーゼ活性測定用としてそれぞ
れ少量生産されているにすぎない。 しかし、最近マルトトリオース〜マルトヘキサ
オースのマルトオリゴ糖を特異的に生産する微生
物起源のアミラーゼが次々に発見され、澱粉から
各種オリゴ糖の生産が容易に行なえるようになつ
てきた。たとえばマルトペンタオースに関しては
Arch.Biochem.Biophys.、155、290（1973）およ
び日本農芸化学会昭和57年度大会要旨集178頁に
記載の酵素が知られている。ところが、これらの
酵素は反応初期からマルトペンタオース以外の各
種糖を生成するものであり、マルトペンタオース
のみを生成するアミラーゼは未だ知られていな
い。 本発明者らはマルトペンタオースを効率よく生
成し得る酵素を検索すべく鋭意研究を重ねた。そ
の過程でシユードモナス属に属する微生物を培養
することにより目的とするマルトペンタオース合
成酵素が得られ、この酵素を用いることによりマ
ルトペンタオースが効率よく得られることを見い
出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は澱粉、澱粉の組成画分およ
び澱粉の分解反応生成物のうちの少なくとも１種
の物質に下記の性質を有する新規なマルトペンタ
オース生成酵素を作用させることを特徴とするマ
ルトペンタオースの製造方法に関するものであ
る。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
6.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.5において至適温度は50〜55℃
であり、55℃以上の温度で15分間放置すると失
活する。 (4) 本酵素は0.4ｍＭパラクロロ安息香酸第二水
銀および１ｍＭモノヨードアセトアミド溶液中
で阻害を受けるが、阻害率は40〜50％である。 (5) 本酵素の分子量は72500±2500（デイスクゲル
電気泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH6.5（アンフオライン電気
泳動法による）である。 本発明に用いるマルトペンタオース生成酵素は
微生物を用いて生産され、その生産菌としてはシ
ユードモナス属に属し、上記性質を有する酵素を
生産する能力を有するものであればよく、たとえ
ばシユードモナスKO−8940（FERM Ｐ−7456）
とその変種、変異株がある。ここで変異手段とし
ては常法のものでよく、たとえばラジオアイソト
ープ（RI）、紫外線（UV）、ニトロソグアニジン
などを用いて行なえばよい。以下、シユードモナ
スKO−8940の菌学的性質を記載する。 １ 形態的性質 栄養細胞の大きさは0.5〜0.75μ×１〜3μ（0.5μ
×2μ）で桿菌であり、胞子は形成しない。 鞭毛は極鞭毛であり、運動性がある。 グラム染色性は陰性であり、抗酸性はない。 尚、上記の形態は肉エキス10ｇ、ペプトン10
ｇ、NaCl5ｇ、寒天15ｇ、水１（PH7.4）の
組成の培地における生育状態について観察され
たものである。 ２ 各種培地上での生育状態 肉汁寒天平板培養では点状、台状で波状、表
面はしわ状でにぶい光沢があり、半透明、色調
はやや赤みのかかつた乳白色を示す。 肉汁寒天斜面培養では接種線上に一様に生育
し、辺縁は鋸歯状、隆起は薄く、表面は平滑あ
るいはしわ状で湿つている。 にぶい光沢があり、半透明で、やや赤味のか
かつた乳白色を示す。 肉汁液体培養では混濁し菌膜が生成する。 肉汁ゼラチン穿刺培養ではほとんど生育しな
いため、ゼラチンの液化は認められない。 リトマスミルク（10％PH７）での生育状態は
悪い。PHはややアルカリ側で凝固は認められな
い。 ３ 生理的性質 生育PHの範囲はPH６〜９であり、PH7.5〜８
が最適である。 生育温度の範囲は45℃以下であり、40℃付近
が最適である。 硝酸塩を還元し、脱窒反応は陽性であるが、
ガスの発生は認められない。 MRテスト、VP反応、ウレアーゼ反応は陰
性である。 インドール、硫化水素の生成は認められな
い。 オキシダーゼ反応、カタラーゼ反応は陽性で
ある。 クエン酸、硝酸塩、アンモニウム塩を利用し
て生育する。 デンプンの加水分解は陽性である。 色素は生育しない。 酸素に対する態度は好気性である。 ２％食塩で良好に生育するが３％以上では生
育しない。 Ｏ−Ｆテストは好気性でわずかに生育する
が、酸の生成は認められない。 アラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽
糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、ソルビツ
ト、マンニツト、イノシツト、グリセリン、デ
ンプンを含む培地に生育するが、酸の生成およ
びガスの発生は認められない。 以上の性質より本菌株はシユードモナス属に分
類される。本発明者らは本菌株をシユードモナ
ス・エスピーKO−8940（Pseudomonas sp.KO−
8940）と命名した。本菌株は工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されており、その受託番号は
FERM Ｐ−7456である。 次に、新規なマルトペンタオース生成酵素を生
産するための微生物の培養条件について検討し
た。まず、基本培地として肉エキス、ポリペプト
ン、食塩および炭素源を含むものを用い、炭素源
については第１表に示した各種物質を１％使用し
た。この培地にシユードモナスKO−8940
（FERM Ｐ−7456）を植菌し、40℃で３日間振
とう培養を行なつた。このときの活性比率（マル
トースを100としたときの値）を第１表に示す。
表から明らかなように、炭素源としてはマルトー
スが最良であり、澱粉の中では米澱粉、甘藷澱粉
を用いたときにかなり高い活性が得られた。ま
た、各種粉アメを用いたときの活性比率はDEが
高くなると共に高くなり、ハイマルトースシロツ
プではマルトースと同程度の活性が得られた。

【表】 次に、窒素源について検討するため、肉エキス
0.7％、マルトース１％、食塩0.3％を含む培地に
各種物質１％を添加し、40℃で３日間振とう培養
を行なつた。このときの活性比率（硫酸アンモニ
ウムを100としたときの値）を第２表に示す。表
から明らかなように、硫酸アンモニウムまたは硝
酸アンモニウムを用いたときに著しく高い活性が
得られた。

【表】 さらに、マルトース、硫酸アンモニウムおよび
肉エキスのそれぞれの濃度について検討した結
果、最適の培地組成はマルトース0.8％、硫酸ア
ンモニウム１％および肉エキス0.8％を含むもの
であることが判明した。したがつて、培養に用い
る培地としては、上記知見を参考にして、供試菌
株が良好な活性にて目的とする酵素を生産し得る
組成のものを選定すべきである。 次に、培養日数による活性変化について検討し
たところ、培養１日で70％以上の活性が得られ、
３日目まで徐々に活性は上昇する。しかし、その
後は活性が減少する。したがつて、酵素の生産に
は１〜３日間の培養が適当であり、通常は３日間
培養した後、培養液中の不溶分等を遠沈除去して
得た上澄を粗酵素として用いればよい。なお、培
養条件については目的とする酵素の生産量が最大
となるように選定すべきである。また、培養液か
ら酵素を採取・精製するには既知の方法を適当に
組合せて行なえばよい。 酵素の精製は各種の方法により行なうことが出
来るが、その１例を示すと、次の通りである。 ４℃の低温で、粗酵素液に硫酸アンモニウムを
加え、0.2〜0.5飽和で沈澱する画分を集め、10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.5）に溶解する。この酵素
液を同緩衝液に対して一晩透析したものについて
以後の操作を行なう。尚、この硫安塩析での回収
率は約80％である。次に、DEAE−セルロースカ
ラムクロマトグラフイー、ゲル過クロマトグラ
フイーなどにより精製してデイスクゲル電気泳動
的に単一バンドを示す標品を得ることができる。 このようにして得た精製酵素の性質を検討し
た。結果を以下に示す。 (1) 作用 本酵素を可溶性澱粉に作用させたときの反応
経過は第１図および第２図に示したとおりであ
る。図から明らかなように、本酵素は反応初期
にマルトペンタオースを生成し、その後時間の
経過と共にマルトースとマルトトリオースに水
解される。 したがつて、マルトペンタオースを効率的に
生産するには、本酵素を、たとえばメンプラン
リアクターのような容器中で液化澱粉に作用さ
せ、生成糖を限外過膜を用いて反応系外に取
り出す方法を採用することが望ましい。 本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以
下のオリゴ糖を基質にした場合、次の通りであ
る。なお、略号はG₁：グルコース、G₂：マル
トース、G₃：マルトトリオース、G₅：マルト
ペンタオース、G₈：マルトオクタオースを示
す。

【表】 この作用形式から、G₂とG₃の混合物を生産
し、酵母によりG₂を消化させてG₃を製品とし
たり、またG₂とG₃の混合物を製品とすること
もできる。 このように、重合度が小さい基質を用いた場
合、本酵素はいわゆるExo型のアミラーゼとし
ての作用を示すが、重合度の大きいデキストリ
ンにはEndo型のアミラーゼとして作用する。
したがつて、澱粉は本酵素の作用によつて切り
残しはなく大部分がG₅またはG₂とG₃に変換す
る。この際、プルラナーゼ等の枝切り酵素を共
存させれば、G₅の収率を向上させることがで
きる。 (2) 作用至適PHおよびPH安定性 反応液組成を 基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 各種のPHの緩衝液（100ｍＭ） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、45℃で15分間反応させて還元力を測定
し、最高値を100として表わしたときの結果を
第３図に示す。図から明らかなように、本酵素
の至適PHは６〜７である。 また、PH安定性については、本酵素液１mlに
各種PHの10ｍＭ緩衝液（PH４〜６：酢酸緩衝
液、PH６〜８：リン酸緩衝液、PH８〜９：トリ
ス−塩酸緩衝液、PH９〜10：炭酸ソーダ緩衝
液）0.1mlを加え、45℃で60分間静置した後、
各0.1mlずつを採り100ｍＭリン酸緩衝液（PH
6.5）0.4mlおよび２％基質液0.5mlを加えて45℃
にて30分間反応させ、残存酵素活性を測定し
た。結果を第４図に示す。第４図に示したよう
に、本酵素はPH6.5〜9.0の範囲で安定である。 (3) 酵素力価の測定法 酵素の活性は、可溶性澱粉（メルク社製、分
析用）を還元して基質として用い、ソモジー・
ネルソン法により還元力を測定し、45℃で１分
間に１マイクロモル等量のグルコシド結合を切
断する酵素量を1IU（国際単位）とした。 (4) 作用至適温度と温度安定性 反応液組成を 基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 100ｍＭリン酸緩衝液（PH6.5） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、各種の温度で15分間反応させて還元力を
測定し、最高値を100として表わしたときの結
果を第５図に示す。図から明らかなように、本
酵素の作用至適温度は50〜55℃である。 またPH6.5で各種温度に15分間静置した後、
45℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結
果を第６図に示す。第６図から明らかなよう
に、55℃以上では急激に失活する。 (5) 阻害、活性化および安定化 本酵素は0.4ｍＭパラクロロ安息香酸第二水
銀および１ｍＭモノヨードアセトアミド溶液中
では阻害を受けるが、阻害率は40〜50％であり
高くはない。 次に、各種金属イオン（１ｍＭ濃度）の影響
は水銀、亜鉛、銅および銀による阻害率が80％
以上という高い値を示し、鉄で50％である。ま
た、カルシウムイオンは本酵素の耐熱性を５℃
高める。 (6) 分子量 デイスクゲル電気泳動法によつて得られた本
酵素の分子量は72500±2500である。 (7) 等電点 アンフオライン電気泳動法によつて求められ
た等電点はPH6.5である。 (8) 結晶構造および元素分析 本酵素については未だ結晶標品が得られてい
ないが、電気泳動で単一バンドを示す精製標品
を得ている。 以上に示した性質を有する本酵素は従来の酵素
と全く異なる作用を示し、マルトペンタオースを
大量に生成する新規な酵素である。本発明者ら
は、本酵素を１，４−α−Ｄ−グルカンマルトペ
ンタオハイドロラーゼと命名した。 前述したように、本酵素はアミロース、可溶性
澱粉、各種澱粉に作用してマルトペンタオースを
生成する。したがつて、澱粉、澱粉の組成画分お
よび澱粉の分解反応生成物のうちの少なくとも１
種の物質に本酵素を作用させることにより、マル
トペンタオースが生成・蓄積する。反応を行なう
にあたり、本酵素の性質を考慮してマルトペンタ
オースの生成量が最大となるような条件を選定す
べきである。ここで澱粉としては、たとえば馬鈴
薯、甘藷、トウモロコシ、モチトウモロコシ、大
麦、小麦、米、タピオカ、サゴなどの任意の原料
から得られるものを使用することができる。ま
た、澱粉の組成画分としては、たとえばアミロー
ス、アミロペクチンなどがあり、澱粉の分解反応
生成物としては、たとえば白色デキストリン、黄
色デキストリン、ブリテイツシユガムなどの焙焼
デキストリン；酸化澱粉、低粘性変性（酵素、
酸、機械高速撹拌等の処理による）澱粉などの化
工澱粉；リン酸澱粉、酢酸澱粉などで代表される
澱粉エーテル、澱粉エステルなどの澱粉誘導体；
放射線や中性子線を照射したり高周波処理あるい
は湿熱処理した澱粉などの物理的処理澱粉；α−
澱粉などを挙げることができる。これらの澱粉類
は単独もしくは２種以上を組合せて用いる。 反応終了後、加熱して酵素を失活させて反応を
停止し、反応液から常法によつてマルトペンタオ
ースを得ることができる。 ［実施例］ 次に、実施例により本発明を説明する。 製造例 １ シユードモナスKO−8940（FERM Ｐ−7456）
を肉エキス0.8％、硫酸アンモニウム１％、マル
トース0.8％の斜面寒天培地に接種し、40℃で２
日間培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成
の液体培地（100ml培地／500ml三角フラスコ）に
移し、45℃で３日間通気振とう培養を行なつた。 培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶
物を遠沈除去して上澄を得、これを粗酵素とし
た。この粗酵素液の活性は3.8IU／mlであつた。 製造例 ２ シユードモナスKO−8940（FERM Ｐ−7456）
の培養液を少量とり、常法によりRI、UV、ニト
ロソグアニジンで処理した後、平板培養を行ない
アミラーゼ活性の高いコロニーをとつた。これを
肉エキス0.8％、硫酸アンモニウム１％、マルト
ース0.8％の培地で45℃にて３日間培養し、その
後の操作は製造例１と同様にした。本粗酵素液の
活性は8.0IU／mlであつた。 実施例 １ 馬鈴薯澱粉を細菌液化型酵素（BLA）により
液化し、ヨウ素−澱粉反応が青色で失活処理し、
基質濃度10％、マルトペンタオース生成酵素（製
造例２の粗酵素液）1IU／ｇ基質、PH6.0、45℃で
６時間撹拌しながら反応せしめマルトペンタオー
スを30％含む反応液を得た。 実施例 ２ 実施例１のようにして液化馬鈴薯澱粉液を作
り、基質濃度20％、マルトペンタオース生成酵素
（製造例２の粗酵素液）1IU／ｇ基質、PH6.0、45
℃で限外過器［東洋紙(株)製、UHP−76（膜は
UK−10）］中で窒素ガスで圧力をかけながら反
応させてマルトペンタオースを80％以上含む糖液
を得た。収率は12時間反応で出発基質の60％であ
り、得られた糖液は逆浸透膜で20％にまで濃縮す
ることができた。 実施例 ３ プルラナーゼを1IU／５ｇ基質に加えたこと以
外は実施例２と同様に操作し、12時間の反応でマ
ルトペンタオースを80％以上含む糖液を収率65％
で得た。 ［発明の効果］ マルトペンタオースは現在、α−アミラーゼ活
性測定用基質として診断薬、試薬などへの用途が
あり、本発明によつて安価に生産されれば、食品
をはじめ各種用途も拓けるものと期待される。ま
た、マルトペンタオースは溶解性に優れ、甘味が
なく、ボデイ感があるので製菓用材料として有用
であり、消化・吸収性が良いので幼児、老人、患
者用の滋養食としての利用も可能である。 したがつて、このようなマルトペンタオースを
澱粉類から効率よく製造することができる本発明
の方法は産業上極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はマルトペンタオース生成酵素の反応経
過（1IU／ｇ基質）を示すグラフ、第２図は本酵
素の反応経過（1IU／10mg基質）を示すグラフ、
第３図は本酵素の至適PHを示すグラフ、第４図は
本酵素のPH安定性を示すグラフ、第５図は本酵素
の至適温度を示すグラフ、第６図は本酵素の温度
安定性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の分解反応
   生成物のうちの少なくとも１種の物質に下記の性
   質を有する新規なマルトペンタオース生成酵素を
   作用させることを特徴とするマルトペンタオース
   の製造方法。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
   粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
   ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
   などに作用してマルトペンタオースを生成す
   る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
   6.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.5において至適温度は50〜55℃
   であり、55℃以上の温度で15分間放置すると失
   活する。 (4) 本酵素は0.4ｍＭパラクロロ安息香酸第二水
   銀および１ｍＭモノヨードアセトアミド溶液中
   で阻害を受けるが、阻害率は40〜50％である。 (5) 本酵素の分子量は72500±2500（デイスクゲル
   電気泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH6.5（アンフオライン電気
   泳動法による）である。 ２ 澱粉の組成画分がアミロースまたはアミロペ
   クチンである特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。 ３ 澱粉の分解反応生成物が化工澱粉である特許
   請求の範囲第１項記載の製造方法。