JPS6342696A

JPS6342696A - 糖類の製造法

Info

Publication number: JPS6342696A
Application number: JP61186575A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Nakamura; 信之中村; Koki Horikoshi; 弘毅掘越
Original assignee: Research Development Corp of Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1986-08-08
Filing date: 1986-08-08
Publication date: 1988-02-23
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: JPH062071B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は新規な糖類の製造法に関する。更に詳しくは、
新規なサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する好熱性微
生物を培養して得られる新規な耐熱性プルラナーゼを使
用したデンプンまたはその加水分解物からの糖類の製造
法に関する。

従来の技術プルラナーゼは、ベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）らにより、
プルラリャ・プルランの生産する多糖類プルランを加水
分解する酵素として、微生物：エーロバクター・エーロ
ゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
においてはじめて見出されたものである〔バイオシミ力
　エ　バイオロジー　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）、　３６．３０９　（１９５９）、特公昭４
６−７５５９などを参照のこと〕。その後、この酵素は
、アミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合を加水
分解し、β−アミラーゼとの併用により、デンプンから
マルトースを収量よく生産することから注目され、現在
では同種の酵素が種々の微生物により生産されることが
知られている。

この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラーゼなど種々
の名称で呼ばれているが、総称してα−■、６−グルコ
シダーゼと言われている。例えば、エシェリヒア・イン
ターメディアのイソアミラーゼ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ、　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　；アプライド　マイクロ
バイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
）、　１５．４９２（１９６７）〕、ストレプトコッカ
ス・ミティスのプルラナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｍ１ｔｉｓ　　；バイオケミカル　ジャーナル（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、　１０８．３３．　（１９
６８））、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　−ｓｐ、　）　Ｎｏ、２８のイソアミラーゼ〔
ジャーナル　オブ　ザ　ファーメンテ−ジョン　テクノ
ロジー（Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈ、）、　４９．５５２　（１９７１））　、バ
チルス属のプルラナーゼ　〔アグリカルチュラル＆バイ
オロジカルケミストリー　（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、　
　Ｃｈｅｍ、）、４０．　１５１５（１９７６）　；ス
ターチ（Ｓｔａｒｃｈ）、几３４０　（１９８２）等〕
などが報告されている。

最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−１，６
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースを製造し
たり、またデンプンからマルトース、マルトトリオース
、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオースなどのマルトオリゴ糖を生産する際に、これ
ら糖の増収に有効であることが認められており、現在で
は、グルコースやマルトースの生産においてα−１，６
−グルコシダーゼがこれら糖質の製造用酵素であるグル
コアミラーゼやβ−アミラーゼと併用され、工業的にも
大量に使用されている。

更に、未だ大量生産には至っていないが、マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースに関しても、夫々の生成酵素とα−１，
６−グルコシダーゼが併用され、既にパイロットプラン
ト規模での生産が行なわれている。

しかるに、従来知られているプルラナーゼやイソアミラ
ーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼは、熱安定性に
劣り、また多くはその最適温度が４５〜５０℃程度でし
かなかった。

発明が解決しようとする問題点一般に、澱粉糖の生産は、５０℃以上の高温で、かつｐ
Ｈ４，５〜６．０の弱酸性条件下で行われているが、６
０℃以下の反応温度では反応槽中の微生物汚染による反
応ｐＨの低下を防止することは出来ず、また汚染による
ＩＩＨ低下を補償するために多量の水酸化ナトリウムや
水酸化カルシウムなどのアルカリ試薬をｐＨ調整の目的
で添加しなければならなかった。このため、生産物の脱
塩・精製のために後処理が必要となるばかりか、多大の
費用が必要となる。従って、このような微生物汚染を防
止するためには６０℃以上、好ましくは６５〜７５℃に
酵素反応の最適温度を有し、同時にｐＨ低下を調整する
ためのアルカリ剤の添加量を低減するために反応の至適
ｐ■を中性〜弱アルカリ性に有する酵素が求められてい
る。

以上の如く、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−
１，６−グルコシダーゼに関しても、より高い最適温度
を持つ酵素の必要性が認識されており、このような目的
でストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｓｐ、、ジャーナル　オブ　ザ　ファーメンテ−ジョン
　テクノロジー（Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈ、）、　４９，５５２．　（１９７１）　）　
、クレブシェラ・ニューモニア−ｒ−（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、特開昭６０−１８６２
８３号〕、バチルス・アシドプルリティカス〔Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、　　
プロセス　バイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、　１９−４．１２９　　
（１９８４）　：］あるいはバチルス　ステアロサーモ
フィルス［Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ。

ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　ザ　アプライド　マ
イクロバイオロジー＆バイオテクノロジー（３ｕｒ、Ｊ
、八ｐｐ１１Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ、）、１７　−　１　　。

２４　（１９８３）　〕、更にはクロストリジウム　サ
ーモハイドロサルフユリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
　　ｔｈｅｒｍｏ−ｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ、
　　アプライド　エンバイアロンメンタル　？イクロバ
イオロジー（Ａｐｐｌ、　［Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）　、４９−５，１１６８　　
（１９８５）　）ｌなどの微生物が新たに検索・分離さ
れ、これらが良好な温度安定性を有し、高い至適温度を
有するα−１，６−グルコシダーゼ産生を有することを
報告している。

しかしながら、これらの微生物のうちタレブシエラ属（
特開昭６０−１８６２８３号）やバチルス属〔特開昭５
１−２６２８８号；プロセス　バイオケミストリー（Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、　１
９−４　、１２９　（１９８４）　３などのα−１，６
−グルコシダーゼの至適温度は６０℃前後であり、従来
から知られているエーロバクター　エーロゲネス［Ａｅ
ｒｏｂａｃｔｏｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（重囲は現在で
は分類学的にクレブシェラ　ニューモニアｘ　：　Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとされている
）〕やシュードモナス属［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、バ
イオシミ力　エ　バイオフィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　　）、　２￥２．４５８
　（１９７０）　）あるいはその他の微生物が生産する
酵素と比較して、より高温で作用するが、実用的には更
に高い温度で作用する酵素が求められている。

一方、バチルス　ステアロサーモフィルス（Ｂ。

Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）やクロストリ
ジウム　サーモハイドロサルフユリカム（Ｃ１，ｔｈｅ
ｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌ−ｆｕｒｉｃｕｍ）のａ−１，
６−グルコシダーゼは６５〜６７．５℃および８５℃に
至適温度を有しており、工業的意味において優れた特性
を有していると考えられるが、酵素の生産性や培養の困
難さのために実用的とは言えなかった。

このような情況の下で、高い（７０℃前後の）酵素反応
の至適作用温度を有し、しかも弱酸性〜弱アルカリ性領
域に安定ｐＨ範囲を有するα−１，６−グルコシダーゼ
の開発が強く要求されている。

また、このような酵素を開発することによって、デンプ
ンからのグルコース、マルトースあるいはマルトオリゴ
糖の製造を安価かつ高い生産性で実施することが可能と
なる。

従って、本発明の目的は上記要件を満足する新規なプル
ラナーゼを使用し、デンプンもしくはその分解生成物か
ら収率よく糖類を得る方法を提供することにある。

問題点を解決するための手段そこで、本発明者らは培養が容易であり、酵素反応の至
適温度が７０℃前後であ′す、かつ弱酸性側に至適ｐＨ
を有する、温度安定性に優れたα−１゜６−グルコシダ
ーゼを生産する微生物を得るべく鋭意検索した結果、温
泉の高温土壌中から採取された好熱性細菌であるサーマ
ス（Ｔｈｅｍｕｓ）属ニ属する新規微生物が上記目的を
達成する上で極めて有用であり、これを好気的に培養す
ることにより、培養物中に上記要件を満足する新規プル
ラナーゼが高収率で生成蓄積されることを見出し、本発
明を完成したものである。

すなわち、本発明の糖類の製造法は以下の理化学的性質
を有する新規耐熱性プルラナーゼ：（イ）作用アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する；（
ロ）基質的異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
加水分解する；（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐａｌ範囲至適ｐＨは５．５〜６．０であり、５０℃、３０分間の
加熱条件下ではｐＨ５〜９の範囲内で安定である；（ニ
）温度に対する安定性ｐＨ６，０，３０分間の処理では６０℃まで安定である
；（ホ）作用適温の範囲７０℃近傍に至適作用温度を有する；（へ）失活条件５０℃、３０分間の処理条件ではｐｔ１４および１１で
完全に失活し、また、ｐＨ６，０，３０分間の処理では
８０℃で完全に失活する；（ト）阻害および活性化銅、水銀、亜鉛およびＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテ
トラアセテート）で阻害され、カルシウムで安定化され
る；（チ）ゲル濾過法による分子量１２８、０００±５，０００　　；をエキソ型あるいはエンド型アミラーゼと併用し、デン
プンもしくはその加水分解生成物に作用させることを特
徴とするものである。

本発明の方法において上記の新規耐熱性プルラナーゼは
サーマス属に属する微生物を好気的に培養することによ
り、該酵素を培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型
酵素として生成蓄積せしめ、これを分離・精製すること
を特徴とする方法によって得ることができる。

本発明において使用する新規耐熱性プルラナーゼ生産菌
株はいずれも本発明者等により新たに天然界から検索・
単離されたものである。これらの菌株をバージニーズ・
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　５ｙｓ
ｔｅ＋＋＋ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　、
第１巻に従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
であり、運動性がなく、ダラム染色陰性であり３６℃以
下および７５℃以上では生育できず、生育の最適温度が
６５℃前後であることからサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）
属に属すると考えられた。

しかしながら、これまでにこのサーマス属に属する微生
物の中でプルラナゼを菌体外生産するものは知られてい
ないので、本発明の耐熱性プルナラーゼ生産菌株は新規
なものであると考えた。

以下の第１表に単離した三種の耐熱性プルラナーゼ生産
菌の菌学的諸性質を示す。

なお、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に夫々
、ＦＢＲＭ　Ｐ−８８８１（ＡＭＤ−６）　、ＦＥＲＭ
　Ｐ−８８８２（ＡＭＣ−２２）およびＦＥＲＭ　Ｐ−
８８８３（ＡＭＤ−２８）として寄託している。

本発明において使用する新規な耐熱性プルラナーゼの製
造法につきさらに詳しく説明する。

上記のような耐熱性プルラナーゼ生産菌を適当な培地に
接種し、その生育温度の観点から３７〜７４℃、好まし
くは５５〜６５℃にて４８〜９６時間、好気的に培養す
ることにより培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型
酵素として該プルラナーゼが生成蓄積される。

本方法に用いられる培地は安価に人手し得る公知の各種
材料を使用することができる。例えば、窒素源としては
、コーン・ステイープ・リカー、ポリペプトン、大豆粕
、フスマ、ゼラチン、肉エキス、酵母エキス、硫酸アン
モニウム、酢酸アンモニウム、尿素、アミノ酸液、など
であり、炭素源としては水飴、マルトース、各種デンプ
ン、可溶性デンプン、デンプン液化液、デキストリン、
プルランなどである。

また、これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えば
マグネンウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩や各種ビタミン類を必要により添加する。

本発明の上記方法において使用するのに適した培地は、
例えば１％プルラン、１％大豆粕、０．１％に２８Ｐ○
１．０．０４％ＭにＳＯ，・７Ｈ２０を含有する液体培
地である。

また、上記方法で使用する微生物の生育ｐＨは弱酸から
弱塩基性の範囲内であるので、適当なｐＨ調整剤を用い
て培地のｐＨを調整する必要がある。そのために種々の
緩衝液を用いることができるが、０．２〜１％程度の炭
酸カルシウムを用いることが特に便利である。

既に述べたように、本発明において有用な新規微生物は
細胞吸着型の酵素および菌体外分泌型の酵素を産生ずる
。これらは夫々以下のような操作に従って分離・精製す
ることができる。

即ち、上記のような組成の培地中で、上記条件下で培養
した後、培養液から菌体外分泌型酵素を、また菌体から
細胞吸着型酵素を夫々回収する。培養上澄中に蓄積され
る菌体外分泌型酵素は、遠心分離により菌体を除去した
後に得られる粗酵素液の形で、また、細胞吸着型酵素は
遠心分離により得た菌体自体を用いることが経済的に有
利であるが、これをさらに精製して使用することもでき
る。

そのために、例えば硫安等による塩析、エタノーノペア
セトン、イソプロパツール等による溶媒沈澱法、限外濾
過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な酵
素精製法により精製することができる。

以下に、本発明において有用なプルラナーゼの好ましい
精製法の１例につき更に詳しく説明する。

好熱性細菌サーマス属に属する例えばＡＮＤ−２８菌株
を１％プルラン、１％大豆粕、０．１％に２ＨＰＯ４，
０，０４％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，２５％炭酸カル
シウムを含む培地に植菌し、６０℃にて７２時間、通気
量１ｖ、ｖ、ｍ、　２５Ｏｒ、ｐ、ｍ、で好気的に培養
して得られる培養液を１０．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、、
４℃にて連続遠心して菌体を除き、約５１の−Ｌ澄液を
得る。次いで、該上澄液に固形硫酸アンモニウムを添加
し、８０％飽和とし、４℃で一夜放置する。生じた沈澱
を濾過により集め、１０ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７
，０＞に溶解させた後、同緩衝液に対して一夜４℃で透
析する。透析により生じる沈澱は遠心分離により除き、
得られる上澄液を１０ｍＭ　’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに吸着さ
せ、０〜０゜８ＭのＮａＣ１を含む上記と同様な緩衝液
の濃度勾配法によって酵素を溶出させる。溶出した活性
画分を集め平均分画分子量３０．０００の限外濾過膜を
用いて濃縮した後、０．１Ｍ食塩を含む上記同様のリン
酸緩衝液を用いて一夜透析する。次いで、該透析酵素を
同様に０．１Ｍ食塩を含む上記リン酸緩衝液で平衡化し
たセファクリルＳ−２００カラムに充填し、０．１Ｍ食
塩を含む同緩衝液で溶出する。

活性画分を集め限外濾過膜を用いて濃縮した後、ショデ
ックス（Ｓｈｏｄｅｘ）　ＷＳ−２００３カラムを用い
る高速液体クロマトグラフ法にて再度クロマトグラフィ
ーに付して活性画分を集める。かくして得られる精製酵
素はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動くゲル濃
度７．５％）的に単一であり、活性収率は約２１％であ
った。なお、本発明の方法において有用なＡＭＤ−６菌
株およびＡＭ［］−２２菌株のプルラナーゼについても
同様な方法で精製可能である。

さらに、細胞吸着型酵素は、例えばトライトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）Ｘ−１００あるいはドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）などの界面活性剤で菌体を洗浄することにより
容易に溶離するので遠心分離により集菌した菌体を０．
０５〜０．５％（Ｗ　／Ｖ）程度の該界面活性剤で処理
した後、遠心分離して得られる上澄から上記と同様な方
法により精製できる。

勿論、培養液の遠心分離処理前に、培養液中に上記のよ
うな界面活性剤を添加して、予め細胞吸着型酵素を培養
液中に溶離させ、次いで上記の精製・分離操作を行って
、これら両者を同時に回収することも可能である。

なお、上記方法により得られる細胞吸着型酵素と菌体外
分泌型酵素の理化学的性質は、はぼ同一である。

更に、プルラナーゼの活性測定法並びに活性表示法は以
下の通りである。

即ち、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐｉ−１６，０）に溶
解させた３％（ｗ／ｖ）のプルラン溶液Ｑ、　３ｍｌに
酵素液０．０５ｍ１を混合し、６０℃で３０分間反応さ
せた後、ＤＮＳ試液〔ジエイ、アール、サマー、ジー、
イー、ソマーズ、″ラボラトリ−イクスペリメンツ　イ
ンバイオロジカル　ケミストリー″、アカデミツクプレ
ス、＝ニーヨーク（Ｊ、　　Ｒ，Ｓｕｍｍｅｒ、　Ｇ、
Ｅ、Ｓｏｍｅｒｓ、”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｂｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、３４３５頁、　　１９４４年〕
　１ｍ１を加えて反応を止める。ついで、沸騰水浴中で
５分間加熱した後急冷し、３ｍｌの水を加えて十分に攪
拌する。同様に処理した０、　３５ｍ１の０．５ｍｇ　
／ｍｌグルコース溶液を標準とし、その着色度をクレト
ーサ７−７７　（Ｋｌｅｔｔ−３％ｍｍｅｒｓｏｎ）型
光電比色計フィルターＮｏ、５２を用いて測定する。酵
素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μｍｏｌｅの
マルトトリオース生成に相当する還元力を有する酵素量
を１単位とした。

本発明の方法において糖類の製造に有用なデンプンとし
ては特に制限されず、貯蔵炭水化物として各種高等植物
の種子、根茎等の貯蔵器官に貯蔵された任意のもの、も
しくはその酸または他の酵素による分解生成物であり得
、例えば米（ウルチ米、モチ米）、小麦、トウモロコシ
、モチトウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、サゴ、
タピオカ、バナナの他、分解生成物として水アメ等を容
易に入手できるものとして例示できる。

更に、上記の新規耐熱性プルラナーゼと共に併用される
アミラーゼとしてはエキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシ
ダーゼ、β−アミラーゼ、エキソマルトトリオヒドロラ
ーゼ、エキソマルトトリオヒドロラーゼ、エキソマルト
へキサオヒドロラーゼ等のエキソ型アミラーゼ、あるい
はα−アミラーゼ、イソアミラーゼもしくは上記以外の
プルラナーゼなどのエンド型アミラーゼがいずれも使用
出来、これらは２種以上の混合物として使用することも
できる。これら酵素は上記の如く、微生物の培養液（粗
酵素液）または菌体自体として使用する他、精製酵素と
して、更には公知の酵素固定化法により適当な担体上に
固定化し、回収・再利用可能な、ものとした後使用して
もよいことは勿論である。

プルラナーゼとアミラーゼとを併用する場合、始めから
これらを共存させても、また予めプルラナーゼで分解し
、その分解生成物を更にアミラーゼの作用に付してもよ
い。

本発明の糖類の製造方法では、使用する新規耐熱性プル
ラナーゼの至適温度（あるいは安定温度範囲内）にて、
至適ｐＨ（あるいは安定ｐＨ範囲内）の下で実施する。

また、その使用量は特に制限はないが、反応速度、生産
性など経済的な観点から、分解すべき糖類基質１ｇにつ
き０．１ｍ５単位で使用することが好ましい。尚、アミ
ラーゼについては従来と同様である。

作」プルラナーゼはアミロペクチンのα−１，６−グルコシ
ド結合を加水分解し、またβ−アミラーゼと併用した場
合にはデンプンからマルトースを高収率で生産できる。

このマルトースは澱粉ａの一種で麦芽糖とも呼ばれ、一
般に甘味剤、栄養剤などとして有用なものである。

既に詳しく述べたように、デンプンもしくはその分解生
成物からマルトースあるいはマルトオリゴ糖を生成する
加水分解反応においては、該反応を高温度下にて中性〜
弱酸性条件下で行なうことが量産性、経済性の点で有利
であるとされている。

即ち、低温での反応では反応槽中の微生物汚染が著しく
、そのため反応ｐＨが著しく低下することが知られてお
り、これを回避するためにアルカリ試薬の添加が余儀な
くされ、それに伴う操作上の難点が生じる。また、この
反応で使用する酵素は高温安定性を有し、しかもその生
産性、収量などといった、製造上の観点からも経済的に
有利なものでなければならないが、この要求をいずれも
満足する酵素はこれまでのところ知られていなかった。

上記デンプン等の加水分解による有用糖類の生酸反応に
おける各挿難点は、本発明者等が新たに検索・単離した
微生物の生産する新規な耐熱性プルラナーゼを使用する
ことによって、いずれも解決された。

本発明の方法において使用する耐熱性プルラナーゼの理
科学的、酵素化学的諸性質と従来公知の微生物由来のα
−１，６−グルコシダーゼとを比較して第２表に示す。

特開昭６３−４２６９Ｇ（９）即ち、第２表から明らかな如く、まず本発明のプルラナ
ーゼは約７０℃に酵素反応の至適温度を有しており、ま
た至適ｐＨも弱酸性〜中性領域にある。

従って、澱粉の酵素分解反応を高温でしかも中性領域近
傍で実施することが可能となる。この事実は、微生物汚
染を確実に防止することを保証し、また汚染に基＜ｐＨ
低下を補償する目的でアルカリ試薬を添加する必要もな
（なり、その結果、脱塩等の後処理が不要となるのでコ
ストパーフォーマンスにおける大巾な改善が期待できる
。更に、高温での反応が可能なことから反応速度の改善
が期待でき、これは分解生成物の量産性を保証する。

一方、該プルラナーゼの製法の観点からしても、本発明
で使用する新規微生物においては、菌体（細胞吸着型酵
素）および培養液中（菌体外分泌型酵素）の両者から有
用なα−１，６−ゲリコシダーゼを単離することができ
る。従って、収率が高く、培養操作も簡単であり、特に
菌体外分泌型酵素の場合には精製・分離操作が簡単であ
り、酵素の製法としては極めて有利である。尚、細胞吸
着型酵素においても、界面活性剤の使用により菌体から
容易に溶離でき、その後は菌体外分泌型酵素と同様に精
製・分離できる。

かくして、本発明の方法によれば澱粉の酵素分解のため
に有用なプルラナーゼを安価かつ大量に供給でき、また
かくして得られる酵素により工業的に大規模な澱粉糖の
生成を有利に実施できる。

実施例以下、実施例に従って本発明の新規耐熱性プルラナーゼ
を用いたデンプンまたはその分解生成物からの有用な糖
類の製造法につき更に具体的に説明する。

しかしながら、本発明の範囲は以下の実施例によって何
隻制限されるものではない。

実施例１好熱性細菌サーマスＮｏ、　ＡＭＤ−５（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ｓｐ、Ｎ。

ＡＭＤ−６：　ＦＥＲＭ　Ｐ−８８８１）菌株を５００
ｍ１容の三角フラスコ中のプルラン１％、大豆粕１％、
Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、Ｍｇ　Ｓ　０４　・７　Ｈ２Ｏ
０，０４％およびＣａＣＯ３０，２５％を含む培地（ｐ
Ｈ７，０）　１００ｍ１に植菌し、７０℃で３０時間２
０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で回転振とう培養した後、トリド
ア　（Ｔｒ＋ｔｏｎ）Ｘ−１００を０．４％添加し、３
７℃で２０時間、２０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で回転振とう
して細胞吸着型酵素を細胞表層から溶離抽出した。つい
で１２．０００　ｇ　。

４℃で３０分間遠心分離して菌体を除き、９．２単位／
ｌＴｌ１の粗酵素液３９ｍ１を得た。次いで平均分画分
子量３０．０００の限外濾過膜を用いて、これを濃縮し
、１７５単位／ｍｌのプルラン分解活性を有する濃縮粗
酵素液を約５ｍｌ得た。尚、酵素の活性単位は上記方法
によって測定したく以下同様）。

ついで、５ｍｌの３５％（Ｗ／Ｖ）とうもろこしデンプ
ン懸濁液を細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（大和化成
株製、タライスターゼＴ−５）を用いて１０５℃で液化
した後、ただちに１２５℃で３０分間オートクレーブし
、Ｄ、Ｅ　（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ
：　直接還元糖に対する全固定物の割合）Ｘ８のデンプ
ン液化液を得た。　該デンプン液化液に対し、３単位／
ｇデンプンのリゾプス属のグルコアミラーゼ（新日本化
学株製、スミチーム、３．０００単位／ｇ）およびデン
プン１ｇあたり１単位のＡＭＤ−６菌の前述の方法で調
製した濃縮粗酵素液（プルラナーゼ）を添加し、ｐＨ５
〜５．５．５５℃で６０時間反応させた。尚、比較対照
として、プルラナーゼを添加せず他は同様な条件で反応
させた。

ついで、反応終了後の糖液に対して、０．２％（Ｗ／Ｖ
）の活性炭を添加し、沸騰水浴中で５分間加熱した後、
０．４５μｍポアサイズのメンブランフィルタ−で濾別
して得られる糖液中のグルコース含有量をショデックス
（Ｓｈｏｄｅｘ）　ＫＳ−８旧カラムを用いる高速液体
クロマトグラフ法で測定した結果、プルラナーゼ無添加
図では９４，４％であったが、添加区では９６．１％で
あった。

実施例２好熱性細菌サーマスＮαＡＭＤ−２２（Ｔｈｅｒｍｕｓ
　ｓｐ、　Ｎ。

八Ｍｉｌｌ−２２：Ｉ”ＥＲＭ　Ｐ−８８８２＞菌株を
５００ｍ１容の三角フラスコ中の可溶性デンプン１％、
コーン・ステイープ・リカー４％、酵母エキス０．２％
、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０
２％を含む培地（ｐＨ６Ｎ００ｍ１に植菌し、５０℃で
７２時間、２０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ。

で回転振とう培養した。培養液を１２，０００ｇ、　４
℃で３０分間遠心分離して得られる培養上澄９３ｍ１中
には３．５単位／ｍｌの菌体外分泌型プルラナーゼが含
まれていた。さらに遠心分離により得られる菌体を、０
．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む２５ｍ１の５ＱｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁させ、３０℃で１８時間
、２００ｒ、　ｐ、　ｍ、で回転振とう抽出した後、１
２．０００　ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られ
る上澄２２ｍ１中には３１．２単位／ｍｌの細胞吸着型
プルラナーゼが含まれていた。

該培養上澄（菌体外分泌型）液およびＳＯ３溶出液（細
胞吸着型）を混合した後、平均分画分子量３０、０００
の限外濾過膜を用いて濃縮し１０７．５単位／ｍ１のプ
ルラン分解活性を有する濃縮粗酵素液約３ｍｌを得た。

ついで、２１Ｔ１１の３５％＜Ｗ／Ｖ）馬鈴薯デンプン
懸濁液を細菌液化型α−アミラーゼ（大和化成株製、タ
ライスターゼ　し−１）を用いて９０℃で液化した後、
直ちに１２５℃で３０分間オートクレーブし、ＤＢ。

１０のデンプン液化液を得た。

該デンプン液化液の固形物に対し、０．０６％のアスペ
ルギルス属のグルコアミラーゼ〔ノボ（ＮＯＶＯ）社製
、ＡＭＧ３００Ｌ　〕およびデシン２１１ｇり１単位の
ＡＩＡＤ−２２菌の濃縮粗酵素液（プルラナーゼ）を添
加し、ｐＨ５，６０℃で５０時間反応させた。

尚、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同様な処
理を行った。

ついで、得られる糖液を実施例１と同様な方法で脱色、
濾過し、糖液中のグルコースの含有量を高速液体クロマ
トグラフ法で測定した結果、プルラナーゼ無添加図では
９４．３％であったが、添加区では９５．８％であった
。

実施例３好熱性細菌サーマスＮｏへＭＯ−２８（Ｔｈｅｒｍｕｓ
　ｓｐ、八ＭＯ−２８：　ＦＥＲＭＰ〜８８８３）菌株
を１０！容のジャーファーメンタ−中の可溶性デンプン
１％、マルトース０．２％、コーン・ステイープ・リカ
ー３％、大豆粕１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏ
ｓ・７Ｈ２００，０２％、ＣａＣｌ２０．００５％、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２００、００３％を含む培地（ｐＨ７）
６ｆに、予め、実施例１で述べた培地を用いてＮｏ、　
ＡＭＤ−２８菌株を６０℃で１８時間前培養して得られ
る種菌液１８０ｍ１を添加し、６０℃で２５Ｏｒ、ｐ、
ｍ、　、通気量１　ｖ、　ｖｏｍ、で７２時間通気攪拌
培養した。培養終了後、温度を３７℃に下げ、５Ｄ３０
．１％（Ｗ／Ｖ）を添加して、更に１８時間攪拌した。

ついで、１０．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、、４℃で連続遠
心して菌体を除いた後、平均分画分子量３０．０００の
限外濾過膜を用いて約１０倍に濃縮した。ついで、該濃
縮液に固型硫酸アンモニウムを８０％飽和ま゛で添加し
、４℃で一夜放置した。本操作により生じた沈澱を濾過
により集め、減圧下、室温で乾燥して３．５ｇの１６２
．０００単位／ｇのプルラン分解活性をもつ粗酵素粉末
を得た。

ついで、実施例２と同様な方法で液化したＤＥ、　２．
５の２５％（Ｗ／Ｖｙ馬鈴薯デンプン液化液（５ｍｌ）
に対し、１５単位／ｇデンプンの大豆β−アミラーゼ（
長潮生化学工業製、１０．０００単位／ｇ）および前述
の方法で得たＡＭＤ−２８菌のプルラン分解酵素粉末を
アンプ２１ｇ当たり３単位添加し、ｐＨ６，６，６５℃
で４０時間反応させた。

なお、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同様な
処理を行った。次いで得られる糖液を実施例１と同様な
方法で脱色・濾過し、糖液中のマルトースの含有量を実
施例１と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結
果、プルラナーゼ無添加区では６０．３％であったが、
添加区では８７．５％であった。

実施例４実施例３で得た２５％（ｗ／ｖ）馬鈴薯デンプン液化液
に対し２単位／ｇ・デンプンのシュードモナスシュテッ
ツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　５ｔｅｔｚｅｒｉ
）のマルトテトラオース生成アミラーゼ（日本食品化工
製、２０．０００単位／ｇ）および実施例３で得たＡＮ
Ｄ−２８菌のプルラナーゼ粉末をアンプ２１ｇ当たり２
単位添加し、ｐＨ６，５，５５℃で３０時間反応させた
。

なお、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同様な
処理を行った。

次いで、得られる糖液を実施例１と同様な方法で脱色・
濾過し、糖液中のマルトテトラオース含有量を実施例１
と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結果、プ
ルラナーゼ無添加区では４４．８％であったが、添加区
では６２．１％であった。

発明の効果以上詳しく述べたように、本発明によれば高温度域（７
０℃前後）に酵素反応の至適温度を有し、しかも弱酸性
〜弱塩基性領域に安定ｐＨ範囲を有するα−１，６−グ
ルコシダーゼを使用したことにより、このものの前記諸
特性に基き、澱粉の酵素分解反応の収率、効率を大巾に
改善することが可能となる。しかも、余分な試薬の必要
性を排除し、脱塩などの後処理をも不要とするので工程
の経済性も著しく向上する。

更に、本発明の方法によれば、使用する新規微生物が菌
体並びに培養液両者に上記の優れた諸特性を有するα−
１，６−グルコシダーゼを簡単な工程で、しかも高収率
で得ることを可能とすることから酵素自体のコストを著
しく低減する。

かくして、本発明は安価かつ大規模での澱粉糖の製造を
可能とするので工業的に極めて大きな意義を有するもの
である。

特許出願人　　　新技術開発事業団中村　信之掘越　弘毅

Claims

【特許請求の範囲】

（１）以下の理化学的性質を有する新規耐熱性プルラナ
ーゼ：（イ）作用アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する；（
ロ）基質特異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
加水分解する；（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲至適ｐＨは５．５〜６．０であり、５０℃、３０分間の
加熱条件下ではｐＨ５〜９の範囲内で安定である；（ニ
）温度に対する安定性ｐＨ６．０、３０分間の処理では６０℃まで安定である
；（ホ）作用適温の範囲７０℃近傍に至適作用温度を有する；（ヘ）失活条件５０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ４および１１で完
全に失活し、また、ｐＨ６．０、３０分間の処理では８
０℃で完全に失活する；（ト）阻害および活性化銅、水銀、亜鉛およびエチレンジアミンテトラアセテー
トで阻害され、カルシウムで安定化される；（チ）ゲルろ過法による分子量１２８，０００±５，０００をエキソ型もしくはエンド型アミラーゼと併用して、デ
ンプンもしくはその加水分解物に作用させることを特徴
とする糖類の製造法。
（２）上記プルラナーゼが細胞吸着型酵素である特許請
求の範囲第１項記載の糖類の製造法。
（３）上記プルラナーゼが菌体外分泌型酵素である特許
請求の範囲第１項記載の糖類の製造法。
（４）上記プルラナーゼが細胞吸着型酵素と菌体外分泌
型酵素との混合物である特許請求の範囲第１項記載の糖
類の製造法。
（５）上記プルラナーゼが該プルラナーゼ生産能を有し
、サーマス属に属する微生物、微工研菌寄第８８８１号
、同第８８８２号または同第８８８３号を培養し、採取
したものであることを特徴とする特許請求の範囲第１〜
４項のいずれか１項に記載の糖類の製造法。