JPS6331195B2

JPS6331195B2 -

Info

Publication number: JPS6331195B2
Application number: JP59043368A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki; Mitsuo Yagisawa
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-03-07
Filing date: 1984-03-07
Publication date: 1988-06-22
Also published as: DK102785D0; DE3584182D1; EP0158435B1; DK164600C; DK102785A; JPS60186283A; DK164600B; EP0158435A3; EP0158435A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、広い最適作用PH域をもつ新規な耐熱
性プルラナーゼＡの製造方法に関するものであ
る。プルラナーゼは、Benderらにより、プルラリ
ヤ・プルランの生産する多糖類プルランを加水分
解する酵素として、エーロバクター・エーロゲネ
ス（Aerobacter aerogenes）に、はじめて見出
された［Biochem.Biophys.Acta、36、309
（1959）、特公昭46−7559など］。その後、この酵
素は、アミロペクチンのα−1.6−グルコシド結
合を加水分解し、β−アミラーゼとの併用によ
り、デンプンからマルトースを収量よく生産でき
ることから注目され、現在までに同種の酵素が
種々の微生物より生産されることが知られてい
る。この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラー
ゼなど種々の名称で呼ばれているが、総称してα
−1.6−グルコシダーゼと言われている。たとえ
ば、エツセリシア・インターメデイアのイソアミ
ラーゼ［Escherichia intermedia、Applied.
Microbiol.、15、492（1967）］、ストレプトコツカ
ス・ミテイスのプルラナーゼ［Streptococcus
mitis、Biochem.J.108、33、（1968）］、ストレプ
トマイセス・sp.No.28のイソアミラーゼ［J.
Ferment.Tech.、49、552（1971）］、バジルス属の
プルラナーゼ［Agric.Biol.Chem.40、1515
（1976）、Starch、34、340（1982）など］などが
ある。最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα
−1.6−グルコシダーゼは、デンプンからグルコ
ースの製造や、デンプンからマルトース、マルト
トリオース、マルトテトラオース、マルトペンタ
オース、マルトヘキサオースなどのマルトオリゴ
糖の生産においても、これら糖の増収に有効であ
ることが認められている。しかるに、従来、知られているプルラナーゼや
イソアミラーゼなどα−1.6−グルコシダーゼは、
一般に熱安定性に劣り（多くは最適温度45〜50
℃）、また、作用PH範囲が狭いため、グルコアミ
ラーゼのように酸性側で作用し、熱安定性に優れ
た酵素（最適作用PH4.5付近、最適作用温度60℃）
や、中性〜弱アルカリ性に最適作用PHをもつ微生
物起源マルトオリゴ糖生成酵素の、全てのアミラ
ーゼに対して使用するには技術的および経済的に
問題があつた。そこで、本発明者らは、グルコアミラーゼ、β
−アミラーゼやマルトトリオース以上のマルトオ
リゴ糖を生成するアミラーゼの、いずれのアミラ
ーゼとも併用できる。最適作用PH範囲が広く、且
つ熱安定性に優れたα−1.6−グルコシダーゼを
求めて、広く自然界から微生物の検索を行つてき
た結果、土壌中より分離し、クレブシラ・ニユー
モニア（Klebsiella pneumoniae）と同定した細
菌の生産するプルラナーゼが、最適作用PH約4.5
〜約7.5の極めて広いPH範囲にあり、また最適作
用温度も約60℃と高温側にある新規な耐熱性プル
ラナーゼであることを認め、新規な耐熱性プルラ
ナーゼＡと命名した。本発明はこの知見にもとず
いてなされたものである。すなわち、本発明は、
PH約4.5〜約7.5の広いPH範囲に最適作用PHをもつ
新規な耐熱性プルラナーゼＡを生産する、クレブ
シラ・ニユーモニアを培養し、培養物から該酵素
を採取することを特徴とするプルラナーゼの製造
方法に関するものである。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。本発明において使用される、クレブシラ・ニユ
ーモニア（Klebsiella pneumoniae）は、Begey
の細菌同定書（Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology、The Williams＆
Wilkins Co.）において、以前はエーロバクタ
ー・エーロゲネス（Aerobacter aerogenes）と
区別されていたが、第８版において、エーロバク
ター・エーロゲネスはクレブシラ・ニユーモニア
に包含されている。エーロバクター属やクレブシ
ラ属細菌がプルラナーゼを生産することについて
は、すでに本発明以前に公知である。たとえば、
Biochem.Z.、334、79（1961）、Method in
Enzymology 、555（1966）、特公昭46−7559、
Agric.Biol.Chem.、37、2821（1973）などには、
エーロバクター・エーロゲネスの生産するプルラ
ナーゼの記載があり、また、特公昭51−5072、特
公昭58−22197などには、クレブシラ・ニユーモ
ニアなどクレブシラ属の生産するα−1.6−グル
コシダーゼについての記載がある。しかし、これ
ら文献や特許公報に記載されている酵素は、いず
れも熱安定性に劣つている。すなわち、
Biochem.Z.334、79（1961）とMethod in
Enzymology 、555（1966）にはエーロバクタ
ー・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用温度
は47.5℃とあり、Agric.Biol.Chem.、37、2821
（1973）には、同じくエーロバクター・エーロゲ
ネスのプルラナーゼの最適作用温度は50℃である
と記載されている。そして、特公昭51−5072には、クレブシラ・ニ
ユーモニアの最適作用温度は45〜50℃にあり、基
質の不在下では、50℃で１時間加熱処理すると殆
んど失活すると記載されている。このように、従来、知られているエーロバクタ
ー属やクレブシラ属のプルラナーゼやα−1.6−
グルコシダーゼの最適作用温度は45〜50℃程度で
あると考えられるのに対し、本発明の新規な耐熱
性プルラナーゼＡの最適作用温度は60〜63℃の高
温側にあり、基質の不在下で50℃で１時間加熱し
ても殆んど活性の低下は認められない（第１図及
び第２図）など、熱安定性に優れた酵素である。
本酵素は基質の存在下では当然、熱安定性化さ
れ、またカルシウムなどの金属塩の存在下でも熱
安定化されるので、実用的な反応条件において
も、最低60℃の温度で反応を行なうことができ
る。一方、最適作用PHについてみてみると、エーロ
バクター・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラ
ナーゼやα−1.6−グルコシダーゼの最適作用PH
は5.0付近｛Method in Enzymology 、555
（1966）、特公昭51−5072など｝、またはPH６付近
｛Agric.Biol.Chem.、37、2821（1973）｝にあり、
いずれの場合も、特に、PH６以上においては著し
く活性が低下することが知られている。本発明以前に、比較的熱安定性に優れたα−
1.6−グルコシダーゼを生産する微生物として、
たとえば、バシルス属のプルラナーゼ｛特開昭57
−174089、Starch、34、340（1982）｝、およびス
トレプトマイセス属のイソアミラーゼ｛J.
Ferment.Technol.、49、552（1971）｝が知られて
いる。これらの微生物の生産するプルラナーゼや
イソアミラーゼの最適作用温度は約60℃にある
が、いずれも最適作用PHは5.0にあり、PH５以上
では著しく活性が低下する。以上、説明したように、本発明以前に知られて
いたエーロバクター属やクレブシラ属の酵素は熱
安定性に劣り、最適作用温度は50℃前後にあり、
また、最適作用PHも5.0または6.0の狭い範囲にあ
る。これに対し、本発明により生産されるクレブ
シラ・ニユーモニアの新規な耐熱性プルラナーゼ
Ａは、最適作用PHが約4.5〜約7.5の極めて広い範
囲にあり、そして最適作用温度は60〜63℃と極め
て熱安定性に優れた酵素であり、従来、知られて
いたエーロバクタ属やクレブシラ属の酵素とは違
つた新規な酵素と認められるものである。以下に、新規な耐熱性プルラナーゼＡの酵素的
性質についてより詳細に記載する。 (1) 作用；プルランのα−1.6−グルコシド結合
を分解してマルトトリオースを生成する。ま
た、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲンまた
はこれらの派生物のα−1.6−グルコシド結合
を分解する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH；PH約2.5〜約10
の極めて広いPH範囲で作用し、最適作用温度は
PH約4.5〜約7.5の広い範囲に認められた｛２％
プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、ト
リス緩衝液（PH5.5〜7.5）およびトリシン緩衝
液（PH７〜8.5）のもとで50℃で30分間反応、
第１図ａ｝ (3) 作用温度範囲及び最適作用温度；約75℃まで
作用し、最適作用温度は約63℃に認められた
｛２％プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH5.0）又
は0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）のもとで30分
間反応、第１図ｂ｝。 (4) 熱安定性；酵素水溶液を50℃、55℃と60℃で
加熱処理してのち、残存活性を測定した。その
結果、50℃では１時間の加熱後も失活は殆んど
認められなかつた。55℃の加熱では20分の加熱
で約20％失活し、１時間の加熱で約60％失活し
た。そして、60℃の加熱では30分間の加熱で約
80％失活した｛第２図ａ｝。 (5) PH安定性；PH約４〜約10の範囲で安定であつ
た｛0.1M酢酸緩衝液、リン酸緩液またはトリ
ス緩衝液のもと、室温（25℃）で３時間放置
後、残存活性を測定した｛第２図ｂ｝。 (6) 阻害剤；本酵素は１×10^-3MのCuS₄、
HgCl₂ZnSO₄、FeCO₄により、それぞれ約93
％、約89％、約86％、約29％阻害された。同濃
度のAgNO₃によつては殆んど阻害されなかつ
た。 (7) 精製方法；本酵素は培養上澄液から硫安分画
（40〜70％飽和）、DEAE−セフアロースカラム
クロマトグラフイー（KCl0〜0.5Mでリニヤー
グラジエント溶出）とセフアデツクスＧ−200
カラムクロマトグラフイーにより、クロマト
的、電気泳動的に均一まで精製することができ
る。 (8) 分子量；セフアデツクスＧ−200ゲル濾過法
により測定した分子量は約12万であつた。 (9) 力価測定法；0.1Mトリス緩衝液に溶解させ
た１％プルラン液（PH7.0）0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし40℃で反応させる。
この条件で１時間に１mgのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。また本発明において使用される新規な耐熱性プ
ルラナーゼＡ生産菌の菌学的性質は下記に示す通
りである。 (1) 形態的性質；約0.8×約1.3μの桿菌、通常、
単桿菌あるいは２連状に連なり生育する、運動
性はなく、また胞子形成は認められない。 (2) 培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のあ
る円形状の集落を形成する。集落の周縁は全縁
で、表面隆起は頭状を示す。肉汁液体培養では、培地全体に混濁を生成す
る。穿刺培養では、寒天高層の上層、中部、深部
ともに糸状に生育が認められ、寒天表面にも集
落の形成が認められる。 (3) 生理的性質生育温度；約50℃の温度まで生育するが、最適
生育温度は約43℃。生育PH；PH約５〜約９の範囲で生育する。最適
生育PHは７付近。グラム染色；陰性。酸素に対する態度；通性嫌気性。カタラーゼ；陽性。オキシダーゼ；陰性 β−ガラクトシダーゼ；陽性硝酸塩の還元；陽性炭水化素の利用；グルコース、アドニトール、
Ｌ−アラビノース、エクスリン、イノシトー
ル、マンニトール、Ｌ−ラムノースなどを利
用し酸を生成する。クエン酸の利用；陽性マロン酸の利用；陽性メチルレツド反応；陰性 VP反応；陽性アルギニンの加水分解；陽性ゼラチンの液化；陰性硫化水素の生成；陽性インドール反応；陰性リジンの脱炭酸；陽性オルニチンの脱炭酸；陽性ウレアーゼ反応；陽性フエニールアラニンからのフエニルピルビン酸
の生成；陰性以上の菌学的性質について、Bergey's
Manual of Determinative Bacteriologyの第８
版（The Williams＆Wilkins Co.1974年）を参
照し、本菌をクレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoniae）の一菌株と同定する
のが適当と考えた。本菌は工業技術院微生物工業
技術研究所において、Klebsiella pneumoniae
FERMP−7387として寄託されている。本菌による新規な耐熱性プルラナーゼＡを生産
するためには、窒素源として、ペプトン、肉エキ
ス、カゼイン、コーンステイープ・リカーのよう
な有機窒素源あるいは尿素、硫酸アンモニウム、
硝酸塩などの無機窒素化合物と、炭素源として、
デンプン、アミロペクチン、デキストリン、マル
トース、グルコース、乳糖などを一種または一種
以上、そしてこれに補足する栄養源として、リン
酸塩、マグネシウム塩、塩化カリウムと、マンガ
ン塩、カルシウム塩、鉄塩などの金属塩を含む培
地が使用される。培養は、PH５〜９、温度20〜45℃で、通常、好
気的に行われる。新規な耐熱性プルラナーゼＡは殆んど菌体外に
生産されることと、α−アミラーゼなどのデンプ
ン糖化において有害となる酵素は殆んど生産され
ないため、培養後は、濾過または遠心分離により
除菌し、上澄液を回収して、これを濃縮するか、
あるいは必要に応じて、硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウムなどによる塩析によるか、または、ア
セトン、イソプロパノール、エタノール、メタノ
ールなどの有機溶剤を加えて酵素を沈澱物として
収得するなどの手段により、容易に培養物から酵
素を回収することができる。本発明以前に知られているAerobacter属や
Klebsiella属の生産するプルラナーゼやイソアミ
ラーゼなどα−1.6−グルコシダーゼは、菌体内
に多量の酵素を蓄積する（例えば、特公昭46−
7559、特公昭51−5072など）ため、培養終了後、
菌体から酵素を抽出回収する装作が必要であると
いう問題があるが、本発明により生産される新規
な耐熱性プルラナーゼＡは、殆んどすべて菌体外
に生産されるため、培養物からの該酵素の回収は
容易であり、工業的に同酵素を製造する際に商業
的に有利に実施することができる。このことも本
発明の大きな特徴として挙げることができる。また、新規な耐熱性プルラナーゼＡは前述の如
く、最適作用PHが約4.5〜約7.5の広い範囲にあ
り、また熱安定性に優れた酵素であるため、現
在、知られているデンプンからグルコースを生産
するグルコアミラーゼ、デンプンからマルトース
を生産する植物または細菌のβ−アミラーゼはも
とよりマルトトリオースを生成するバシルス属ア
ミラーゼ（最適作用PH6.0〜6.5、特許出願中）、
マルトテトラオースを生成するシユードモナス属
アミラーゼ｛最適作用PH6.5〜８、Arch.
Biochem.Biophys.、145、105（1971）など｝、マ
ルトペンタオースを生成するバシルス属アミラー
ゼ｛最適作用PH５〜８、Arch.Biochem.Biophys.
155、290（1973）｝、マルトヘキサオースを生成す
るアミラーゼ｛最適作用PH6.8または8.0、
Biochem.Biophys.Acta、410、333（1975）また
はAgric.Biol.Chem.、46、1539（1982）｝など、い
ずれのアミラーゼとも、それぞれのアミラーゼの
最適条件下で反応をおこなうことができる。以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。実施例１尿素0.35％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、可溶性デンプン２％、KCl0.5％、
MnCl₂5×10^-5M、CaCl₂1×10^-3Mからなる培地
50mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法により
殺菌後、クレブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
pneumonise）FERMP−7387を接種し、30℃で
２日間振温培養した。培養後、遠心分離機により
除菌し、得られた上澄液について生産された新規
な耐熱性プルラナーゼＡの活性を測定した結果、
培地ml当り5.6単位であつた。実施例２実施例１の培地において、可溶性デンプンの代
りにアミロペクチン（トウモロコシ）２％を添加
した培地について、実施例１と同様にして培養し
た結果、生産された耐熱性プルラナーゼは、培地
ml当り、10.8単位であつた。この結果及び実施例１の結果から明らかな通
り、デンプンよりもアミロペクチンを用いた方が
酵素の生産量が増加できることがわかつた。実施例３実施例１で使用したと同じ組成の培地３を５
容ジヤーフアーメンターに入れ、常法により殺
菌後、クレブシラ・ニユーモニアFERMP−7387
を接種し、通気量１／min回転数250rpmで培
養した。培養後、遠心分離機により除菌し、硫安
70％飽和になるように加え、生成した沈澱物を粗
酵素として回収した。得られた酵素剤を用い、ア
ミラーゼと併用してデンプンの糖化を行つた。 DE1.4の液化デンプン液（固形物として１ｇ）
に、市販の大豆β−アミラーゼ300単位｛Agric
Biol.Chem.、40、1515（1976）の測定法によつ
た｝と上記方法により得たクレブシラ・ニユーモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼＡを１または２
単位加え、PH6.0、55℃で反応させた。得られた
糖化物の糖組成は高速液体クロマトグラフ法によ
り定量した。結果は第１表に示す通りであつた。実施例４ DE7.7の液化デンプン液に、市販のグルコアミ
ラーゼと実施例２で調製した新規な耐熱性プルラ
ナーゼＡを１単位加え、固形分濃度30％、全容量
10mlとして、PH5.0、温度60℃で糖化した。糖化
液の糖組成の分析は高速液体クロマトグラフ法に
よつた、得られた結果を第２表に示す。表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ
ーゼＡの添加によりグルコースの収量が増加し
た。ここでG2、G3はそれぞれグルコースの２量
体、３量体を示す。実施例５ DE4.2の液化デンプン液（固形分として１ｇ）
に、バシルスspYT−1004（微工研菌寄第5854号）
の生産するマルトトリ【表】【表】【表】オース生成アミラーゼ２単位と実施例２で調製し
た新規な耐熱性プルラナーゼＡを1.5単位を加え、
水で全量10mlとし、PH7.0、温度50℃で糖化した。
糖化液の糖組成を分析した結果は第３表に示す通
りであつた。表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ
ーゼＡを添加することにより、マルトトリオース
の収量が著しく増加した。

【図面の簡単な説明】

第１図ａとｂ、第２図ａとｂは、それぞれクレ
ブシラ・ニユーモニアの生産する新規な耐熱性プ
ルラナーゼの最適作用PH、最適作用温度、熱安定
性とPH安定性を示している。

Claims

【特許請求の範囲】

１耐熱性プルラナーゼを生産するクレブシラ・
ニユーモニアを培養し、培養物から新規な耐熱性
プルラナーゼＡを採取することを特徴とする新規
な耐熱性プルラナーゼＡの製造方法。