DK164600B - Termostabil pullulanase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelse deraf i en fremgangsmaade til forsukring af stivelse eller i en fremgangsmaade til fremstilling af maltose med hoej renhed - Google Patents

Description

DK 164600 B

Opfindelsen angår en hidtil ukendt termostabil pullulanase med optimal aktivitet indenfor et bredt pH-område og en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt anvendelse deraf i en fremgangsmåde til forsukring af 5 stivelse eller i en fremgangsmåde til fremstilling af maltose med høj renhed.

Pullulanase blev først opdaget af Bender et al. som et enzym, der var i stand til at hydrolysere pullu-lan, et polysaccharid dannet af Pullularia pullulan, i 10 Aerobacter aerogenese (Biochem. Biophys. Acta., 36, 309 (1959), japanske patentpublikationer SHO 46 (1971)-7559, etc). Den senere demonstration af enzymets evne til at hydrolysere a-l,6-glulcosidbindingerne i amylopectin og, når det blev anvendt sammen med β-amylase, til at danne 15 maltose ud fra stivelse i et højt udbytte har siden tiltrukket dette enzym voksende interesse. Det er kendt at enzymer af samme slags dannes af forskellige mikroorganismer. Enzymerne af denne slags har forskellige betegnelser, såsom pullulanase og isoamylase. Under et be-20 tegnes de som a-l,6-glucosidaser.

For nyligt har a-1,6-glucosidase vist sig at være virksomt til forøgelse af udbyttet af sukkerarter, som ved fremstillingen af glucose ud fra stivelse og ved fremstillingen af maltooligosaccharider, såsom maltose, 25 maltotriose, maltotetraose, maltopentaose og maltohexose ud fra stivelse.

Uheldigvis har de almindelig kendte a-l,6-gluco~ sidaser, såsom pullulanase og isoamylase utilstrækkelig termisk stabilitet, og de har optimal aktivitet ved tem-30 peraturer i området fra 45-50°C og er aktive indenfor et smalt pH-område. Der har således været tekniske og økonomiske hindringer for effektivt at anvende dem i vid udstrækning sammen med alle amylaserne, herunder de enzymer, såsom glucoamylase, som er aktive i det sure om-35 råde og udmærker sig ved termisk stabilitet (optimal aktivitet ved pH i nærheden af 4,5 og en temperatur på 2

DK 164600 B

60°C), og maltooligosacchariddannende enzymer af mikro-organisk oprindelse med optimal aktivitet ved pH-værdier i det neutrale og over i det alkaliske område.

Opfindelsen, som kræves beskyttet heri, er ud-5 sprunget af anstrengelser, der er gjort til overvinding af de ovennævnte ulemper for den kendte teknik. Ifølge opfindelsen tilsigtes det at tilvejebringe en pullu-lanase med optimal aktivitet indenfor et bredt pH-om-råde og med udmærket termisk stabilitet og en frem-10 gangsmåde til fremstilling af dette enzym. Den termo-stabile pullulanase, der tilvejebringes ifølge opfindelsen, giver den fordel, at den effektivt kan anvendes sammen med alle amylaser, herunder glucoamylase, β- -amylase og amylaser, der er i stand til at danne malto-15 triose og maltooligosaccharider af højere orden og effektivt kan danne glucose, maltose, etc. ud fra stivelse.

Opfindelsen angår derfor en termostabil pullulanase, der er ejendommelig ved, at den er aktiv indenfor 0 20 et temperaturinterval fra ca. 0 til ca. 75 C, den har en optimal temperatur for aktiviteten i intervallet fra ca.

0 0 60 C til ca. 63 C, den er aktiv indenfor et bredt pH-område i pH-intervallet fra ca. 4 til ca. 10 og har en optimal pH-værdi for aktiviteten i intervallet fra ca.

25 4,5 til ca. 7,5 og er identisk med den pullulanase, der dannes ved dyrkning af bakteriestammen Klebsiella pneu-.moniae PERM BP-721.

Opfindelsen er beskrevet nedenfor i detaljer med henvisning til tegningerne, som illustrerer specifikke 30 udførelsesformer, og hvori:

Figur 1 (a) er en graf, der viser data for aktivitet afhængigt af pH opnået for den termostabile pullulanase ifølge opfindelsen.

Figur 1 (b) er en graf, der viser data for akti-35 viteten afhængigt af temperaturen for pullulanasen ifølge opfindelsen.

3

DK 164600 B

Figur 2 (a) er en graf, der viser termostabiliteten af pullulanasen ifølge opfindelsen.

Figur 2 (b) er en graf, der viser pH-stabiliteten af pullulanasen ifølge opfindelsen.

5 Mikroorganismer, der er vidt udbredte i naturen, blev screenet til eftersøgning af en a-1,6-glucosidase med optimal aktivitet i et bredt pH-område og udmærket termisk stabilitet. Som et resultat opdagedes pullulanasen, der dannes af en bakterie isoleret fra slam og er 10 identificeret som Klebsiella pneumoniae FERM BP-721, som værende en hidtil ukendt termostabil pullulanase med optimal aktivitet i et overordentligt bredt pH-område fra ca. 4,5 til 7,5 og en optimal aktivitet ved en temperatur over ca. 60°C. Opfindelsen er fuldendt på basis af 15 denne viden. Mere specifikt angår opfindelsen en termostabil pullulanase med en optimal aktivitet i et bredt pH-område fra ca. 4,5 til ca. 7,5 og en fremgangsmåde til fremstilling af denne termostabile pullulanase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker 20 stammen Klebsiella pneumoniae FERM BP-721 i et kulturmedium og opsamler den ovennævnte termostabile pullulanase fra det fermentativt oparbejdede kulturmedium.

I tidligere udgaver af Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, The Williams & Wilkins Co., var 25 Klebsiella pneumoniae klassificeret som Aerobacter aerogenes. I den nuværende 8. udgave af denne bog omfatter Klebsiella pneumoniae Aerobacter aerogenes. Det faktum, at bakterier af slægten Aerobacter og slægten Klebsiella danner pullulanase var kendt for fagfolk.

30 F.eks. er pullulanase dannet af Aerobacter aerogenes nævnt i Biochem. Z. 334, 7 9 (19 61 ), Method in Enzymo- logy, VIII, 555 (1966), japansk patentpublikation SH0 46(1971)-7559, Agric. Biol. Chem. , 3J_, 2821 (1973 ), etc., a-1,6-glucosidasen, dannet af bakterier af slægten 35 Klebsiella, herunder Klebsiella pneumoniae, er nævnt i japansk patentpublikation SHO 51(1976)-5072, japansk 4

DK 164600 B

patentpublikation SHO 58(1983)-22197, etc.. Enzymerne beskrevet i disse referencer og patentpublikationer har alle utilstrækkelig termisk stabilitet. I Biochem.

Z., 334, 79 (1961) og Method in Enzymology, VIII, 555 5 (1966), beskrives den optimale temperatur for aktivite ten af pullulanasen fra Aerobacter aerogenes at være 47,5°C. I Agric. Biol. Chem. , 37_, 2821 (1973), skrives det, at den optimale temperatur for aktiviteten af det samme enzym er 50°C.

10 I japansk patentpublikation SHO 51(1976)-5072, er der en angivelse gående ud på, at Klebsiella pneumoniae har en optimal temperatur for aktiviteten i området fra 45-50°C, og at den i det væsentlige inaktiveres efter 1 times henstand ved 50°C i fravær af substrat.

15 Som beskrevet ovenfor har man anset de hidtil kendte pullulanaser og a-1,6-glucosidaser dannet af bakterier af slægten Aerobacter og slægten Klebsiella for at have optimale temperaturer for aktiviteten omkring 45-50°C. Derimod har den termostabile pullulanase ifølge 20 opfindelsen sin optimale temperatur for aktiviteten i så højt et temperaturområde som 60-63°C, og den viser praktisk talt ikke tegn på inaktivering selv efter 1 times opvarmning til 50°C i fravær af substrat (fig.

1 og 2). Dette enzym udmærker sig således ved dets ter-25 miske stabilitet. Dette enzym stabiliseres naturligvis i tilstedeværelse af substrat. Det stabiliseres også termisk i tilstedeværelse af metalsalte, såsom calciumsalte. Også under praktiske reaktionsbetingelser kan enzymet derfor undergå en reaktion ved temperaturer på 30 mindst 60°C.

Den optimale pH-værdi for aktiviteten ligger for pullulanase og a-1,6-glucosidase fra Aerobacter aerogenes og bakterier af slægten Klebsiella i nærheden af 5,0 (Metod in Enzymology, VIII, 555 (1966) japansk patent-35 publikation SHO 51(1966)-5072, etc.), eller i nærheden af 6 (Agric. Biol. Chem., 37, 2821 (1973)). I begge til- 5

DK 164600 B

fælde er disse enzymer kendt for at lide af alvorlige aktivitetstab, især ved en pH-værdi der er større end 6.

Som a-1,6-glucosidaser fra mikroorganismer, der 5 er kendte som værende i stand til at danne a-1,6-glucosidase med relativ høj termisk stabilitet, kan der nævnes pullulanasen fra slægten Bacillus (offentliggjort japansk patentansøgning SHO 57(1982)-174089 og Starch, 34, 340 (1982)) og isoamylasen fra slægten Streptomyces 10 (J. Ferment. Technol., 49^, 552 (1971)). Skønt den optimale temperatur for aktiviteten af pullulanasen og isoamylasen dannet ved hjælp af disse mikroorganismer er omkring 60°C, har disse enzymer en optimal pH-værdi for aktiviteten på ca. 5,0, og de lider alvorlige tab af 15 aktivitet ved en pH-værdi over 5.

Som beskrevet ovenfor udviser enzymet af slægten Aerobacter og slægten Klebsiella, som var kendt for fagfolk, dårlig termisk stabilitet, og det har en optimal temperatur for aktiviteten på ca. 50°C og en optimal pH-20 værdi for aktiviteten i et smalt område fra ca. 5,0 til 6,0. Derimod har den termostabile pullulanase fra Klebsiella pneumoniae dannet ifølge opfindelsen en optimal pH-værdi for aktiviteten i et overordentligt bredt område fra ca. 4,5 til ca. 7,5 og en optimal temperatur 25 for aktiviteten fra 60°C til 63°C. På grund af den enestående termiske stabilitet har man erkendt, at det er et hidtil ukendt enzym, der er forskelligt fra de hidtil kendte enzymer fra slægten Aerobacter og slægten Klebsiella.

30 De enzymatiske egenskaber for pullulanasen ifølge opfindelsen vil blive beskrevet i detaljer nedenfor.

1. Virkning.

Enzymet hydrolyserer den a-1,6-glucosidiske 35 binding af pullulan og danner maltotriose. Det hydrolyserer desuden den a-1,6-glucosidiske binding af sti-

DK 164600B

6 velse, amylopectin, glycogen og derivater deraf.

2. pH-aktivitetsområde og optimal pH-værdi for aktiviteten.

5 Enzymet har vist sig at være aktivt over et ekstremt bredt pH-område fra ca. 4 til ca. 10, og det har optimal temperatur for aktiviteten i et bredt pH-område fra ca. 4,5 til ca. 7,5 (modstå 30 minutters reaktion ved 50 °C i tilstedeværelse af 2% pullulan og

10 0,05 M acetatbuffer (pH 3 til 5,5), trisbuffer (pH

5,5-7,5) og tricinbuffer (pH 7-8,5).

3. Temperaturområde og optimal temperatur for aktiviteten.

15 Enzymet har vist sig at være aktivt ved tem peraturer op til 75°C, og det har optimal temperatur for aktiviteten ved ca. 63°C (modstå 30 minutters reaktion i tilstedeværelse af 2% pullulan og 0,05 M acetatbuffer (pH 5,0) eller 0,05 M trisbuffer (pH 7,0); fig. 1 (b)).

20 4. Termisk stabilitet.

Under et eksperiment, som omfattede, at temperaturen i en vandig opløsning af dette enzym blev holdt på 50°C, 55°C og 60°C, hvorefter opløsningen blev .

25 testet for resterende aktivitet, viste det sig, at enzymet praktisk talt ikke led tab af aktivitet efter l times opvarmning til 50°C, at det tabte ca. 20% af aktiviteten efter 20 minutters opvarmning og ca. 60% af aktiviteten efter 1 times opvarmning til 55°C, og at det 30 tabte ca. 80% af aktiviteten efter 30 minutters opvarmning til 60°C (fig. 2 (a)).

5. pH-Stabilitet.

Enzymet har vist sig at bevare stabilitet ved en 35 pH-værdi i området fra ca. 4 til ca. 10 (ved et eksperiment, der omfattede trin, hvor man lod enzymet henstå 7

DK 164600 B

ved stuetemperatur (20°C) i 3 timer i tilstedeværelse af 0,1 M acetatbuffer, phosphatbuffer eller trisbuffer og testede for resterende aktivitet, fig. 2 (b)).

5 6. Inhibitorer.

Enzymet inhiberes henholdsvis ca. 93%, ca. 89%, ca. 86% og ca. 29% af CuS04, HgCl2, ZnC03 og FeS04, anvendt i koncentrationer på 1 x 10-iM. Det inhiberes praktisk talt ikke af AgN03 anvendt i samme kon-10 centration.

7. Fremgangsmåde til oprensing.

Enzymet kan opnås ud fra supernatanten af fermenteringsvæsken og oprenses til chromotografisk og 15 eletroforetisk renhed ved hjælp af ammoniumsulfatfrak-tionering (40-70% mætning), DEAE-Sephalose kolonne-chromatografi (lineær gradienteluering fra 0-0,5 M af KC1) og Sephadex G-200 kolonnechromatografi.

20 8. Molekylvægt.

Enzymets molekylvægt bestemt ved Sephadex G-200 gel filtreringsmetoden er ca. 120.000.

9. Fremgangsmåde til bestemmelse af enzymaktiviteten.

25 Enzymet sættes i en passende mængde til 0,5 ml af en 1%'s pullulanopløsning (pH 7,0) opnået ved opløsning af pullulan i 0,1 M trisbuffer. Blandingen spædes op til et totalvolumen på 1 ml med vand og inkuberes ved 40 °C.

Den mængde af enzymet, som kræves til opnåelse af en 30 reduktion, ækvivalent med 1 ymol af glucose efter 1 minuts henstand under de ovennævnte betingelser, defineres som én enhed.

De mycologiske egenskaber af den hidtil ukendte, termostabile, pullulanasedannende bakterie, der skal 35 anvendes ifølge opfindelsen, vil blive beskrevet nedenfor.

8

DK 164600 B

1. Morphologiske egenskaber.

Stavformet bakterie med størrelse på ca. 0,8 x ca. 1,3 μ i sædvanligvis individuel vækst eller vækst, hvor de er knyttet sammen parvis, ikke bevægelige og 5 ikke sporedannende.

2. Kulturens egenskaber.

Bakterien danner, når den dyrkes på bouillonagar, cirkulære kollonier med hvid glans. Kollonierne er helt 10 afgrænsede og har i centrum hævede overflader. Bakterien vokser, når den dyrkes i bouillonmedium, med ensartet turbiditet.

3. Fysiologiske egenskaber.

15 Temperatur for vækst - bakterien vokser ved tem peraturer op til 50°C og vokser optimalt ved ca. 43°C.

pH for vækst - bakterien vokser ved pH-værdier i området fra ca. 5 til ca 9. Den har optimal vækst i nærheden af pH 7.

20 Gramfarvning - negativ.

Oxygenbehov - fakultativt anaerobe.

Catalase - positiv.

Oxidase - negativ.

β-Galactosidase - positiv.

25 Reduktion af nitrater - positiv.

Udnyttelse af carbonhydrater - bakterien udnytter glycose, adonitol, L-arabinose, inositol, mannitol, L-rhamnose, 30 etc. og danner syrer.

Udnyttelse af citronsyre - positiv.

Udnyttelse af malonsyre - positiv.

Methylrødtreaktion - negativ.

35 VP-reaktion - positiv.

Hydrolyse af arginin - positiv.

9

DK 164600 B

Gelatinesmeltning - negativ.

Hydrogensulfiddannelse - positiv.

Indolreaktion - negativ.

Decarboxylering af lysin - positiv.

5 Decarboxylering af ornithin - positiv.

Ureasereaktion - positiv.

Dannelse af phenylpyrodruesyre ud fra phenylalanin - negativ.

10 Ud fra de mycologiske egenskaber beskrevet oven for har man ved bedømmelse på rette måde med reference til Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8.

udgave (The Williams & Wilkins Co., 1974) identificeret denne bakterie som en stamme af Klebsiella pneumoniae.

15 Denne Klebsiella pneumoniae blev deponeret ved

Fermentation Researsh Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industri, den 12. januar, 1984 under FERM-P-7387, og den blev desuden deponeret ved samme institut i overensstem-20 melse med Budapesttraktaten den 26. februar, 1985 og betegnet FERM BP-721.

Eksempler på nitrogenkilder, der kan anvendes til fremstilling af den hidtil ukendte termostabile pullu-lanase ved hjælp af denne bakterie, omfatter organiske 25 nitrogenkilder, såsom pepton, kødekstrakt og majsstøbevæske, og uorganiske nitrogenkilder repræsenteret ved ammoniumsalte, såsom urinstof, ammoniumchlorid, ammoniumsulfat og ammoniumphosphat, nitrater såsom natriumnitrat og kaliumnitrat. Blandt nitrogenkilderne opremset 30 ovenfor udgør urinstof en særlig ønskelig nitrogenkilde.

Som carbonkilder er majsstivelse, kartoffelstivelse, stivelse fra søde kartofter, glutinøs majsstivelse, glutinøs risstivelse og produkter afledt deraf 35 sædvanligvis anvendelige. Særligt ønskelige er poly-saccharider, såsom glutinøs majsstivelse, glutinøs ris- 10

DK 164600 B

stivelse og amylopectin, som er rig på forgreninger i carbonkæden. Til et kulturmediet indeholdende et sti-velsesagtigt polysaccharid tilsættes lactose. Lactosen er rigeligt effektiv, når den tilsættes til mediet i en 5 mængde på ca. 0,1%. Sædvanligvis er mængden af pullula-nase, der dannes, 2-3 gange så stor, når der tilsættes lactose i en mængde på ca. 0,5-1%, som når der ikke tilsættes lactose.

Foruden de ovennævnte nitrogen- og carbonkilder-10 tilsættes phosphat- og magnesiumsalte og små mængder af metalsalte, såsom calcium- og mangansalte, som supplement til kulturmediet.

Dyrkningen udføres ved en pH-værdi i området fra 0 5-9 og ved en temperatur i området fra 20-45 C, sædvan-15 ligvis aerobt i en eller to dage.

Den termostabile pullulanase dannes ekstracellu-lært, og der dannes i det væsentlige ikke enzymer, der er skadelige for anvendelsen af pullulanasen, såsom a-amylase. Ved afslutning af dyrkningen, kan enzymet 20 derfor let udvindes fra kulturmediet ved filtrering eller centrifugering af kulturmediet, hvorved celler skilles fra, og udvinding af opkoncentrering af super-natanten, eller eventuelt ved udsaltning af enzymet, som f.eks. med ammoniumsulfat eller natriumsulfat, eller 25 udfældning af enzymet ved tilsætning af et organisk opløsningsmiddel, såsom acetone, isopropanol, ethanol . eller methanol. Kommerciel fremstilling af dette enzym kan derfor udføres hensigtsmæssigt ud fra en økonomisk betragtning.

30 Idet den termostabile pullulanase har optimal pH-værdi for aktiviteten i et bredt område fra ca. 4,5 til ca. 7,5 og udmærker sig ved sin termiske stabilitet som beskrevet ovenfor, kan man endvidere lade den reagere effektivt sammen med en vilkårlig af de kendte amy-35 laser, herunder med glycoamylase til fremstilling af glucose ud frå stivelse, med β-amylase af både vegeta-

DK 164600B

11 bilsk og bakteriel oprindelse til* fremstilling af maltose ud fra stivelse, med amylase fra bakterier af slægten Bacillus til fremtilling af maltotriose (optimal pH for aktiviteten 6,0 til 6,5), med amylase fra bakte-5 rier af slægten Pseudomonas til fremstilling af maltote-traose (optimal pH-værdi for aktiviteten 6,5-8; Arch. Biochem. Biophys., 145, 105 /1971)), med amylase fra bakterier af slægten Bacillus til fremstilling af malto-pentaose (optimal pH-værdi for aktiviteten mellem 5 og 10 8; Arch. Biochem. Biophys., 155, 290 (1973)), og med amylase til fremstilling af maltohexose (optimal pH-vær-di for aktiviteten mellem 6,8 og 8,0; Biochem. Biophys.

Acta., 410, 333 /1975)) eller Agric. Biol. Chem., 46, 1539 (1982)) under de optimale betingelser, der er givet 15 for den specifike amylase, der skal anvendes.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til forsukring af stivelse, som er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 3 angivne, samt en fremgangsmåde til fremstilling af maltose med høj renhed, 20 som er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 angivne.

Pullulanasen ifølge opfindelsen kan således anvendes i en fremgangsmåde til fremstilling af maltose med høj renhed ud fra stivelse, sammen med enzymer fra 25 en bakterie af slægten Bacillus, der danner et sammensat enzym ved kombination af β-amylase og a-1,6-glycosidase, der er nødvendige til fremstilling af maltose ud fra stivelse (britisk patent nr. 1.446.009). Dette sammensatte enzym gør det muligt at fremstille maltose i et 30 højt udbytte ud fra forskellige slags stivelse. Under fremstillingen af maltose ved forsukring af stivelse ved anvendelse af det ovennævnte sammensatte enzym kan udbyttet af maltose øges, når denne forsukring udføres i tilstedeværelse af den termostabile pullulanase ifølge 35 opfindelsen. Denne forøgelse af udbytte af maltose kan muligvis forklares af det faktum, at den termostabile 12

DK 164600 B

pullulanase ifølge opfindelsen og a-l,6-glycosidasen, der stammer fra slægten Bacillus, adskiller sig lidt fra hinanden i aktivitetsspecificitet og komplementerer hinanden ved hydrolysering af a-l,6-glucosidiske bindinger.

5 Forsukringen af stivelse ved anvendelse af enzy met ifølge opfindelsen udføres med forklistret stivelse DE-værdi (indeks for graden af nedbrydning af stivelse, udtrykt i % af den reducerende sukker bestemt som glucose i fast stof), der ikke er større end 10, anvendt i 10 en koncentration på mellem 10 og 40% ved en pH-værdi på mellem 5 og 7 og ved en temperatur i intervallet fra 50-60 °C.

Opfindelsen vil nedenfor blive beskrevet mere detaljeret med henvisning til udførelseseksempler.

15

Eksempel 1 I en Erlenmeyerkolbe med et indre volumen på 200 ml steriliseredes 50 ml af et kulturmedium indeholdende 0,35% urinstof, 0,05% K2HP04, 0,05% MgS04-7H2Q, 2% op-

20 løselig stivelse, 0,5% KCl, 5 x 10-5M MnCl2 og 1 x 10~^M

CaCl2 på sædvanlig måde, og kulturmediet blev inkuberet med en stamme af Klebsiella pneumoniae FERM BP-721 0 og underkastet inkubering ved 30 C i to dage. Ved afslutningen af dyrkningsperioden blev kulturvæsken cen-25 trifugeret til fjernelse af celler og opnåelse af super-natanten. Supernatanten blev testet for pullulanaseak-tivitet. Herved blev aktiviteten fundet til at være 5,6 enheder pr. ml af kulturmediet.

30 Eksempel 2

Fremgangsmåden fra eksempel 1 blev gentaget, bortset fra at 2% amylopectin (fra majsstivelse) blev tilsat i stedet for opløselig stivelse. Herved dannedes pullulanasen i en mæmgde på 10,8 enheder pr. ml af kul-35 turmediet.

Af resultaterne vist her og i eksempel 1 fremgår det, at udbyttet af enzymet er større, når der anvendes

DK 164600B

13 amylopectin, end når der anvendes stivelse.

Eksempel 3 I en fermenteringsbeholder med et indre volumen 5 på 5 liter steriliseredes 3 liter af et kulturmedium med samme sammensætning som anvendt i eksempel 1 på sædvanlig måde, og mediet blev inokuleret med en stamme af Klebsiella pneumoniae FERM BP-721 og underkastet inkube-ring under betingelser med en luftningshastighed på 10 1 liter/min. og en rotationshastighed på 250 omdrejninger pr. minut. Efter dyrkningen blev kulturvæsken centrifugeret til fjernelse af celler. Den således opnåede supernatant blev mættet med ammoniumsulfat til 70%, og det dannede bundfald blev udvundet som råenzym.

15 Det opnåede enzym blev anvendt sammen med amylase til forsukring af stivelse.

Til en flydende stivelse med DE = 1,4 (indeholdende 1 g som fast stof) tilsattes 300 enheder af en kommercielt tilgængelig sojabønne-p-amylase (som bestemt 20 ved fremgangsmåden foreslået i Agric. Biol. Chem., 40, 1515 /1976)) og 1 eller 2 enheder af pullulanase af Klebsiella pneumoniae opnået ved fremgangsmåden beskrevet ovenfor, og man lod reaktionen forløbe ved pH 6,0 og 0 55 C. Sukkersammensætningen af det opnåede forsukrede 25 produkt blev bestemt ved analyse ved brug af "highspeed" væskechromatografi. Resultaterne var som vist i tabel 1.

DK 164600 B

14

Tabel l

Pullulanase Glucose Maltose Maltotriose Andre

Ingen tilsat 0,0% 58,4% 1,2% 40,4% 5

Pullulanase ifølge opdelsen tilsat: 1 e/g 0,0 86,0 6,3 7,7 10 " 2 e/q 0,0_89,2 7,1_3,7

Eksempel 4

En flydende stivelse med DE = 7,7 blev blandet 15 med en kommercielt tilgængelig glucoamylase og en enhed af den termostabile pullulanase fremstillet i eksempel 2, faststofkoncentrationen blev indstillet på 30%, der blev spædet op til et totalvolumen på 10 ml, og man lod 0 blandingen henstå ved pH 5,0 og 60 C til forsukring af 20 stivelsen. Sukkersammensætningen af det opnåede forsuk-rede produkt blev bestemt ved "highspeed" væske-gas-chromatografi. Resultaterne var som vist i tabel 2.

Af tabellen ses det, at tilsætningen af pullulanase ifølge opfindelsen øger udbyttet af glucose.

25 I tabellerne betegner G2 og G3 henholdsvis dimer og trimer af glucose.

Tabel 2

Pullulanase Glucose G2 G3 eller mere 30

Ingen tilsat 94,6% 3,3% 2,1%

Pullulanase ifølge opfindelsen_96,9_3^1_0,0_

DK 164600 B

15

Eksempel 5

En flydende stivelse med DE = 4,2 (indeholdende 1 g som fast stof), 2 enheder af en maltotriosedannende amylase fra Bacillus (sp YT-1004, FERM P-5854) og 1,5 5 enheder af pullulanasen ifølge opfindelsen fremstillet i eksempel 2 blev blandet, der blev fyldt op til et totalvolumen på 10 ml med vand, og man lod blandingen 0 henstå ved pH 7,0 og 50 C til forsukring af stivelsen. Sukkersammensætningen af det opnåede produkt ved for-10 sukringen blev analyseret. Resultaterne var som vist i tabel 3.

Det fremgår af tabellen, at tilsætningen af pullulanasen øger udbyttet af maltotriosen væsentligt.

15

Tabel 3

Pullulanase Glucose Maltose Maltotriose Andre Igen tilsat 2,6% 14,6% 58,8% 24,0% 20

Pullulanase ifølge opfindelsen_4^_17,8_67,7_10,5 25 Eksempel 6 I en Erlenmeyerkolbe med et indre volumen på 200 ml blev 50 ml af et kulturmedium, indeholdende 0,35% urinstof, 0,05% K2HP04, 0,05% MgS04-7H20, 2% opløselig

stivelse, 5 x 10-5M MnCl2, 2 x 10_3M CaCl2 og 5 x 10~5M

30 CuS04 og tilsat en varierende mængde, i området fra 0,1 til 1%, lactose, steriliseret på sædvanlig måde og in-

okuleret med en stamme af Klebsiella pneumoniae FERM

0 BP-721 og underkastet inkubering under omrøring ved 30 C i to dage. Efter dyrkningsperioden blev kulturvæsken 35 centrifugeret til fjernelse af celler. Den opnåede supernatant blev testet for dannet pullulanaseaktivitet.

16

DK 164600 B

Resultaterne var som vist i tabel 4.

Tabel 4 Mængde af tilsat lactose Mængde af dannet 5 pullulanase (i enhe- _der pr. ml medium) 0 % 2,50 0,1 2,91 0,2 3,49 10 0,5 5,59 0,8 7,57 _]^_0_6,49_

Eksempel 7 15 I to Erlenmeyerflasker med indre volumener på 200 ml blev 50 ml af et kulturmedium af den samme sammensætning som kulturmediet ifølge eksempel 6, bortset fra at 2% gluctinøs stivelse var tilsat i stedet for opløselig stivelse, og 50 ml af et kulturmedium med den samme sam-20 mensætning som det førstnævnte kulturmedium nævnt ovenfor, hvori der desuden var inkorporeret 0,5% lactose, steriliseret hver for sig på sædvanlig måde, og de to medier blev inokuleret med en stamme af Klebsiella pneumoniae FERM BP-721, hvorefter man lod dem henstå ved 0 25 30 C i to dage til dyrkning af bakteriestammen. Efter dyrkningsperioden blev kulturvæskerne centrifugeret til fjernelse af cellerne og til dannelse af supernatanter. Supernatanterne blev testet for pullulanaseaktivitet. Aktiviteten var 6,46 enheder/ml for kulturmediet i prø-30 ven, der ikke indeholdt lactose, og 10,8 enheder/ml for kulturmediet i prøven, der indeholdt lactose.

Det bemærkes ud fra resultaterne fra eksempel 6 og eksempel 7, at tilsætning af lactose til kulturmediet indeholdende en stivelse øger udbyttet af pullulanase 35 væsentligt.

DK 164600 B

17

Eksempel 8

En flydende stivelse med DE 1,4 (indeholdende l g som fast stof), henholdsvis 300 og 30 enheder (bestemt ved fremgangsmåden foreslået i Arie. Biol. Chem., 48, 5 1515 (1976)) af β-amylase og pullulanase dannet af

Bacillus cereus var. mycoides (FERM P-2391 & ATCC

31102), og 0,5 eller 1 enhed af pullulanasen ifølge opfindelsen fremstillet ifølge eksempel 3 blev blandet, hvorefter man lod det henstå ved pH 6 til 6,5 og en tem-0 10 peratur på 50 C i 44 timer til forsukring af stivelsen. Sukkersammensætningen af det opnåede produkt af forsukringen blev analyseret. Resultaterne var som vist i tabel 5 nedenfor.

Det kan ses i tabellen, at tilsætningen af en en-15 hed af pullulanasen ifølge opfindelsen sammen med pullulanasen fra slægten Bacillus øger udbyttet af maltose med 2,9% og sænker udbyttet af andre saccharider.

DK 164600 B

18

Tabel 5

Pullulanase Glucose Maltose Maltotriose Andre ifølge opfindelsen__ 5

Ingen tilsat (enheder) 0,0(%) 88,9(%) 6,2(%) 4,9(%) 0,5 0,0 90,7 7,2 2,1 10 1_0j0_91,8_6_J3_1,4

Eksempel 9

En flydende stivelse med DE = 1,4 (indeholdende 1 15 g som faststof), henholdsvis 300 og 30 enheder (bestemt ved fremgangsmåden foreslået i den ovennævnte litteratur) af β-amylase og a-1,6-glucosidase (dannet af Bacillus cereus var. mycoides, FERM P-2391 i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Agric. Biol. Chem., 4£, 1515 20 (1976); enzymerne kan fås fra Hokkaido Sugar Co. Ltd., Japan), og 0,5 eller en enhed af pullulanasen ifølge opfindelsen fremstillet i eksempel 1 blev blandet, hvor- 0 efter man lod blandingen henstå ved pH 6 til 6,5 og 50 C i 44 timer til forsukring af stivelsen. Sukkersammen-25 sætningen af det opnåede produkt af forsukringen blev analyseret. Resultaterne var som vist i tabel 6.

Det fremgår af tabellen, at tilsætningen af pullulanasen ifølge opfindelsen sammen med β-amylasen og a-1,6-glucosidasen fra slægten Bacillus sænker udbyttet 30 af andre saccharider og øger udbyttet af maltose til over 90%, og at tilsætningen af en enhed af pullulanasen ifølge opfindelsen øger udbyttet af maltose med ca. 3% over niveauet opnået uden tilstedeværelse af pullulanasen.

19

DK 164600 B

QJ (SO

iH (Ti r—i ”3* O Γ~~

Ti - » ·* *> *· c ^ CN rH rH ^ «; Ή 0) df> tfl 0 Ή

^ Is CM 03 00 O

1 ! ^ ^ ^ < o CO P·- CO LD Γ'»

-P

rH

os I—,

(1) dP

tn cn > co cm n O *· · * *· * +0 00 O rH ro co rH co σ> σι oo oo

(O

S

03 dP

to O O O O O

o ---** O o o o o o 3

rH

o I -------- 03 (1) CO H "0 LO o o o rH 03 o » * *>

rH G03.COO.H.HCN

Q) 0) 03 -H G

to +J to 03 o) 03 CnX!

Eh Ti (¾ (1)

Η Η H

tn co &ci 0 1—-——-

U M

G 03 ,-h t n Ti

o G3 03OOOOO

1 03 rH Si ro m oo

CD +j rH C

- tn-H 03 i—i iH u I H 03 a co co 'g 0)

Ti o o o o o

Q3 O O

I (D X3 oo n ti g g •η (3 03 o ·& — W Λ τ----- ' n 03 03 t n t n Ti 03 G ti 03 rH 03,—1X30 0 0 0 0

iH +J rH G o O O

g tJi-H (i) η n o 5 «3 u — I rH 03 ca co co

Claims (4)

1. Termostabil pullulanase, kendetegnet ved, at den er aktiv indenfor et temperaturinterval fra 0 ca. 0 til ca. 75 C, den har en optimal temperatur for 0 0 aktiviteten i intervallet fra ca. 60 C til ca. 63 C, den 5 er aktiv indenfor et bredt pH-område i pH-intervallet fra ca. 4 til ca. 10 og har en optimal pH-værdi for aktiviteten i intervallet fra ca. 4,5 til ca. 7,5 og er identisk med den pullulanase, der dannes ved dyrkning af bakteriestammen Klebsiella pneumoniae FERM BP-721.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af termostabil pullulanase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker bakteriestammen Klebsiella pneumoniae FERM BP-721 i et kulturmedium og opsamler den dannede pullulanase fra det fermenterede kulturmedium.

3. Fremgangsmåde til forsukring af stivelse, kendetegnet ved, at man lader den termosta-bile pullulanase ifølge krav 1 virke på stivelse eller et derivat deraf sammen med amylase med exo-type- eller endo-typevirkning.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af maltose med høj renhed, kendetegnet ved, at man lader pullulanasen ifølge krav 1 virke på stivelse sammen med a-1,6-glucosidasen og β-amylasen dannet af en bakterie af slægten Bacillus.