JP2672959B2 - マルトテトラオースの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物によるマルトテトラオースの製造法に
関する。

〔従来の技術〕

従来のアミラーゼによって生成されるマルトオリゴ糖
はマルトトリオース以下の分子量の小さいものが大半を
占めている。最近診断用アミラーゼの活性測定用基質と
してマルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖が注目さ
れている。

そして従来、微生物によるマルトテトラオースの製造
法としては、シュードモナス属の微生物の生産するアミ
ラーゼを用いる方法［シュードモナス・スツッチェリ
（Pseudomonas stutzeri）のアミラーゼ〔アーカイブ
ズ オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジ
ックス（Archives of Biochemi−stry and Biophysic
s〕145巻105頁（1971）］、バシルス属の微生物、例え
ばバシルス・サーキュランス（Bacillus circulans）
のG4,5のアミラーゼ及びプルラナーゼを用いる方法（特
開昭58−170491号公報）、バシルス・サーキュランスの
アミラーゼG4を用いる方法（特開昭62−25992号公報）
などが知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、従来用いられたことのない微生物の生産す
るアミラーゼ及びプルラナーゼを用いて、アミロース、
アミロペクチン、澱粉等から短時間に収率よくマルトテ
トラオースを得るという問題を解決したものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、微生物を利用するマルトテトラオースの
製造について種々研究した結果、ミクロコッカス属に属
し、菌体外にアミラーゼ及びプルラナーゼを生産する能
力を有する菌株、例えば本発明者が土壌より採取したN
o.207菌の培養液またはその処理物（培養上澄液、濃縮
液、硫安塩析物、イオン交換樹脂やゲル濾過などによる
部分精製標品など）をアミロース、アミロペクチン、澱
粉などに作用させると、短時間に収率よくマルトテトラ
オースを得ることができることを見い出した。

上記No.207菌の菌学的性質は次のとおりである。

（ａ）形態 １）細胞の形及び大きさ 球菌（0.8〜1.2μｍ） ２）多形性の有無 無 ３）運動性 有（２〜３本の鞭毛） ４）胞子 無 ５）グラム染色性 陽性 ６）抗酸性 無 （ｂ）生育状態（主にpH9で試験） １）肉汁寒天平板培養 円形、頭状、全円のコロニーを形成。

オレンジ色で不透明。

２）肉汁寒天斜面培養 不透明でオレンジ色。

３）肉汁液体培養 若干濁る。黄色の菌体が沈殿する。

４）肉汁ゼラチン穿刺 液化しない。

５）リトマスミルク（pH7） 変化しない。

（ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元 − ２）脱窒反応 − ３）MRテスト − ４）VPテスト − ５）インドールの生成 − ６）硫化水素の生成 − ７）澱粉の加水分解 ＋ ８）カゼインの加水分解 − ９）くえん酸の利用 培地：シモン − クリステンセン − 10）無機窒素源の利用 硝酸塩及びアンモニウム塩を利用（但し培地中に酵母エ
キスを添加した場合） 11）色素の生成 − 12）ウレアーゼ − 13）オキシダーゼ − 14）カタラーゼ ＋ 15）生育の範囲 温度 ０℃以下〜39℃（最適:25〜30℃） pH 6.5〜10.3（最適:8.5〜9.5） 16）酵素に対する態度 好気性 17）OFテスト 僅かにＯ 18）糖類の利用 培地に酵母エキス及びマンガン塩を添加した場合に限
り、以下の糖類から酸を生成するが、ガスは生成しな
い。Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、麦芽糖、しょ
糖、トレハロース、Ｄ−マンニット、グリセリン、澱
粉。

19）塩化ナトリウムの影響 10％濃度でも僅かに生育する。

20）栄養要求性 プロリン、メチオニン、チアミン、ビオチン、ニコチ
ン酸。

以上の結果をバージェーズ・マニュアル・オブ・ディ
タミネィティブ・バクテリオロジー（第８版）に照らし
合わせると、グラム陽性無胞子性の球菌で、カタラーゼ
陽性、オキシダーゼ陰性であり、好気性で、増殖時に葡
萄状を形成することからミクロコッカス属に属し、培養
の温度やpHから新種と考えられた。従って、ミクロコッ
カス・エス・ピー（Micrococcus sp.）No.207と同定し
た。本菌は、また低温高アルカリでも生育する特徴を有
する。

なお、No.207菌すなわちミクロコッカス・エス・ピー
No.207は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第9878号（FERM P−9878）として寄託されている。

本発明は上記の知見に基づいてなされたもので、本発
明はミクロコッカス（Micrococcus）属に属し、菌体外
にアミラーゼ及びプルラナーゼを生産する能力を有する
微生物の培養液もしくはその処理物をアミロース、アミ
ロペクチン、澱粉等に作用させることを特徴とするマル
トテトラオースの製造法である。

本発明において、使用微生物としては、ミクロコッカ
ス属に属し、菌体外にアミラーゼ及びプルラーゼを生産
する能力を有する微生物であればすべて用いることがで
きる。その好適な具体例として上記No,207菌が挙げられ
る。

このNo.207菌は、澱粉などの基質を加水分解して50％
以上のマルトテトラオースを生成するアミラーゼと、基
質に存在するα−1,6−グルコピラノシド結合を分解す
るプルラナーゼを同時に菌体外に分泌する。そしてα−
1,6−グルコシダーゼを別に添加することなく、少量の
培養液またはその処理物（培養上澄液、濃縮液、硫安塩
析物、イオン交換樹脂やゲル濾過などによる部分精製標
品）を添加するだけで、短時間に高分解率で反応を進行
させることができる。更に培養液中にはこれら以外のグ
ルコシダーゼ活性がなく、生成物がそれ以上分解される
ことがない。

使用微生物の培養は、ミクロコッカス属の微生物の培
養に用いられる液体培地で行なうことができる。培地の
成分としては、公知の各種材料を使用することができ、
例えば、窒素源として、ポリペプトン、大豆粕、肉エキ
ス、酵母エキス、アミノ酸液など、炭素源として、水
飴、マルトース、各種澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、
デキストリン、プルランなど、これらの外に各種の塩、
例えばマグネシウム、カリウム、燐酸、鉄やマンガン等
の無機塩や各種ビタミン類を必要に応じて添加した液体
培地を用いることができる。

具体的には例えば、１％可溶性澱粉、１％ポリペプト
ン、0.5％酵母エキス、0.1％K₂HPO₄、0.02％MgSO₄・7H₂
O、1ppm MgCl₂・4H₂Oを含有する液体培地を挙げること
ができる。微生物の生育pHは中性からアルカリ性の範囲
にあるため、水酸化ナトリウムや炭酸ナトリウムでpHを
７〜10、好ましくは7.5〜9.5に調整する。

このような培地に使用微生物、例えばNo.207菌を接種
し、その生育温度の観点から０〜39℃、好ましくは10〜
25℃で、２〜５日、好気的に培養することにより培養液
中に菌体外分泌型酵素として該アミラーゼ及びプルラナ
ーゼを含む粗酵素が生成蓄積される。この粗酵素をその
まま反応に用いることができるが、更に分離精製するこ
ともできる。このための手段としては、上澄液分離、濃
縮、硫安等による塩析、イオン交換樹脂、限外濾過法、
アフィニティクロマトグラム等による。

本発明で使用する微生物、例えば上記No.207菌の生産
するアミラーゼ及びプルラナーゼの性質は次のとおりで
ある。

アミラーゼ １）作用：アミロペクチン、アミロース、澱粉等、及び
それらの部分加水分解物のα−1,4−グルコピラノシド
結合からなる直鎖状構造をエンド型に加水分解し、主成
分としてマルトテトラオースを生成する。そしてその生
成物のアノマー型はαタイプである。

２）基質特異性：マルトペンタオース以上の重合度を有
するα−1,4−グルコピラノシド結合からなる直鎖状マ
ルトオリゴ糖を加水分解する。（G₃〜G₇を基質としたと
き、遊離するグルコース量が、G₅の時を100とすると、G
₃:3.1、G₄:14.2、G₆:84.3、G₇:32.6であった。） ３）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは7.5〜8.0である
（第１図）。また30℃、５時間の条件下において、pH5.
5〜11の範囲で安定である（第２図）。

４）作用適温：約60℃（第３図）。

５）失活条件:50℃、1hの加熱で75％失活。60℃、1hで
は98％以上失活（第４図）。

６）阻害、活性化及び安定化：エチレンジアミン４酢酸
（EDTA）で阻害されるがカルシウム塩で回復する。カル
シウム塩によって活性化及び安定化される。

７）分子量：約14万（ゲル濾過法） プルラナーゼ １）作用：アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉等、及
びそれらの部分加水分解物のα−1,6−グルコピラノシ
ド結合からなる枝分かれ構造を特異的に加水分解し、α
−1,4−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖
を生成する。またプルラン中のα−1,6−グルコピラノ
シド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する。

２）基質特異性：α−1,6−グルコピラノシド結合で分
枝した枝分かれ糖の内、マルトース以上の重合度を有す
る構造を加水分解する。

３）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは7.5〜8.0である。
また30℃、５時間の条件下において、pH6〜10の範囲で
安定である。

４）作用適温：約60℃ ５）失活条件:50℃、1hの加熱で20％失活。60℃、1hで
は98％以上失活。

６）阻害、活性化及び安定化:EDTA（カルシウム塩で回
復）及びシクロデキストリン（CD）類。カルシウム塩に
よって活性化及び安定化される。

７）分子量：約14万（ゲル濾過法） 力価の測定法は次のようにして行なった。

１）アミラーゼ 最終濃度が20mMのトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）、5mM塩化カルシウム、0.5％マルトペンタオ
ース及び適量の酵素液を含む反応混液0.5ml中で、30
℃、10分間反応させた後、0.1M EDTA 2Naを0.1ml加えて
反応を停止し、遊離したグルコースを市販の酵素法グル
コース測定用試薬、例えばヤトロン製イアトロクロムGL
U−L_Qより測定する。

２）プルラナーゼ １）の反応混液のマルトペンタオー
スをプルランに変える。30℃、10分間反応を行い、その
一部をソモギーネルソン銅液に加えて反応を停止し、ソ
モギーネルソン法により還元糖の量を測定した。

活性の単位は１分間に１μmolのグルコース（アミラ
ーゼ）もしくはマルトースに相当する還元量（プルラナ
ーゼ）を遊離もしくは生成する酵素量を１単位とした。

本発明において上記微生物の培養液もしくはその処理
物をアミロース、アミロペクチン、澱粉等に作用させる
には、次のようにして行なう。

基質濃度は、澱粉、アミロース、アミロペクチン等を
そのまま用いる場合は0.5〜10％程度であるが、酸やα
−アミラーゼによって液化された澱粉部分分解物を用い
る場合は５〜40％で行われる。温度は60℃以下、好まし
くは30〜50℃、pHは７〜９がよい。酵素使用量はアミラ
ーゼで通常0.1〜２単位/g澱粉、両酵素の熱安定性増加
のため少量のカルシウム塩を添加することが望ましい。
作用時間は５〜80時間位が適当である。

本発明により生成するマルトオリゴ糖の比率は通常次
のとおりである（単位：％）。

グルコース（G₁）:1〜14、マルトース（G₂）:3〜18、
マルトトリオース（G₃）:4〜19、マルトテトラオース
（G₄）:47〜65、マルトペンタオース（G₅）:0〜12、マ
ルトヘキサオース（G₆）:0〜２、その他:4未満。例えば
馬鈴薯澱粉に作用させた場合、次表のとおりである。

〔実施例〕 バクトトリプトン:2％、酵母エキス:1％、可溶性澱
粉:2％、K₂HPO₄:0.1％、MgSO₄・7H₂O:0.02％、MnCl₂・4
H₂O:1ppmよりなる培地10mlを100ml容の三角フラスコに
入れ、120℃、10分間殺菌し、NaOHによってpHを９に調
整した後、No.207菌（微工研菌寄第9878号（FERM P−98
78））を接種した。20℃で44時間回転培養した後、遠心
分離によって菌体を除去した。この上澄液、即ち粗酵素
液の該アミラーゼ活性は0.35単位/ml、プルラナーゼ活
性は0.44単位/mlであった。

上記のようにして得られた粗酵素標品の70％飽和の硫
安塩析物を、100mgの短鎖アミロースもしくはアミロペ
クチン（ワキシーコーン）に該アミラーゼ活性で0.1単
位添加し、全量を2mlとして40℃で１日反応させた。分
解産物をHPLCで定量した結果を次表に示す。

なお、参考例として、上記のようにして得られた粗酵
素標品を100mgのプルランに該プルラナーゼ活性で0.1単
位添加し、全量を2mlとして30℃で１日反応させ、分解
産物をHPLCで定量した結果を次表に示す。

〔発明の効果〕 本発明によれば、従来用いられたことのないミクロコ
ッカス属微生物の生産するアミラーゼ及びプルラナーゼ
を用いて、アミロース、アミロペクチン、澱粉等から短
時間に収率よくマルトテトラオースを得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

図面はNo.207菌の生産するアミラーゼに関するもので、
第１図は至適作用pHを示す図、第２図はpH安定性を示す
図、第３図は最適作用温度を示す図、第４図は熱安定性
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:265） (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:265）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ミクロコッカス（Micrococcus）属に属
   し、菌体外にアミラーゼ及びプルラナーゼを生産する能
   力を有する微生物の培養液もしくはその処理物をアミロ
   ース、アミロペクチン、澱粉等に作用させることを特徴
   とするマルトテトラオースの製造法。