JPS6030682A - β−アミラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はバチルス属に属するβ−アミラーゼ生産菌を培
地に培養してβ−アミラーゼを生成蓄積せしめ、これを
採取する方法において、培地に特定の添加剤を含有せし
めβ−アミラーゼの生産を増強する方法に関する。

β−アミラーゼ〔系統名：１，４−α−Ｄ−１’ルカン
マルトハイドロラーゼ（Ｌ４−ｅｘ　Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ
ｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）　＋ＵＣ３，２，１，
２）は澱粉、グリコーゲン、デキストリンなどからマル
トースを分離する酵素として有用である。従来β−アミ
ラーゼの供給源としては主として高等植物、例えば大麦
麦芽、小麦、大豆、甘藷などが利用されてきた。

近年バチルス属などの微生物にβ−アミラーゼの生産能
が見いだされたが、多くは生産性が低（実用に至ってい
るものは少ない。従来、バチルス属微生物によるβ−ア
ミラーゼ生産の改良法としては、例えば、バチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ＋
　）を澱粉を含む培地に培養する方法（特公昭５３−４
５３９３号公報）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）を培養するに際し・バリウムイ
オンあるいはクエン酸または酒石酸を存在せしめた培地
を用いる方法並びに種培養を特定のｐＨで行う方法（特
公昭５３−５７４８号公報、同５２−３０５９０号公報
、同５２−３０５８９号公＠）等が知られている。

本発明者らはバチルス属微生物のβ−アミラーゼ生産性
を更に増強すべ（鋭意研究したところ、培地に従来には
ない特定の添加剤を含有せしめることにより著しくβ−
アミラーゼの生産性が高まることを知り本発明を完成す
るに至った。

即ち、本発明は、バチルス属に属するβ−アミラーゼ生
産菌を培地に培養してβ−アミラーゼを生成蓄積せしめ
、これを採取する方法において、培地にサイクロデキス
トリン、サイクロデキストリンを生成する酵素、イソマ
ルトース、イソマルトースを生成する酵素または糖アル
コールからなる群より選ばれる一種以上を含有せしめる
ことを特徴とするβ−アミラーゼの製造法に関する。本
発明においてサイクロデキストリンとしてはα−サイク
ロデキストリン、β−サイクロデキストリンまたはＴ−
サイクロデキストリンが例示される。

サイクロデキストリンを生成する酵素としてはサイクロ
デキストリングルカノトランスフェラーゼ（Ｃｙｃｌｏ
ｄｅｘｔｒｉｎ　ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ、　ＥＣ２，４，１゜１９）、イソマルＩ・−スを生
成する酵素としてはα−Ｄ−グルコシダーゼ（α−Ｄ　
−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　＋ｆＩＣ３，２，１，２０
）が例示される。また糖アルコールとしてはソルビトー
ルまたはマルチトールがそれぞれ例示される。

上記添加剤のうちα−Ｄ−グルコシダーゼは通常マルト
ースなどを基質としてそのα−１，４−グルコシド結合
を加水分解する酵素として知られているが、特定の反応
条件下では基質からグルコース残基を種々の糖およびア
ルコールなどへ転移する活性、即ちトランスグルコシダ
ーゼ活性を持つものがある。本発明で使用するα−Ｄ−
グルコシダーゼはトランスグルコシダーゼ活性を有する
ものでなければならない。

本発明法で使用する微生物はバチルス属に属するβ−ア
ミラーゼ生産菌であればいずれでもよく、例えばバチル
ス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）、
バチルス・メガテリウム（Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
　）　％バチルス・号−キュランス（Ｂ、　ｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ）　、バチルス・ポリミキサ（Ｂ、　ｐｏｌｙ
ｍｙｘａ　）等が示される。

より具体的にはバチルス・セレウス　ＩＦｏ　３００１
、バチルス・セレウス・バリエータス・ミコイデス（Ｂ
、　ｃｅｒｅｕｓ　ｖａｒ、　ｍｙｃｏｉｄｅｓ　）　
ＪＡＭ　１１９０、バチルス・メガテリウム　ＩＡＭ　
１０３０　、ノマチルス・サーキュランス　ＩＦＯ３３
２９、バチルス・ポリミキサＩＦＯ３０２０、バチルス
・ポリミキサＡＴＣ：ＣＢ５２３などの保存菌株が例示
される。

上記菌株を培養するための培地としては炭素源、窒素源
、無機塩、有機酸および発育素などと前記特定の添加剤
を含む培地であれば合成培地または天然培地のいずれで
も用いることができる。例えば、炭素源としてはシュー
クロース、アミロース、アミロペクチン、ポテトスター
チ、コーンスターチ、コーンミール、ワキシースターチ
など、窒素源としてはミルクカゼイン、ポリペプトン、
大豆カゼイン、酵母エキス、肉エキスなど、無機塩とし
ては塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸二カリ
ウム、塩化亜鉛、塩化バリウム、硫酸カリウム、硫酸銅
、塩化第二鉄、酸化カルシウム、リン酸−ナトリウム、
リン酸二ナトリウムなど、有機酸としてはクエン酸ナト
リウムなど、発育素としてはビタミンＢ１、ビオチン、
ビタミンＢ５、Ｄ−パントテン酸ナトリウム、イノシト
ールなどが用いられる。

本発明で添加剤として用いるサイクロデキストリン、イ
ソマルトースまたは糖アルコールは殺菌前の培地に添加
することもできるが、サイクロデキストリングルカノト
ランスフェラーゼ並びにα−Ｄ−グルコシダーゼは熱に
弱いため、殺菌後の培地の温度が約３０℃に冷却された
ときに添加するようにしなければならない。添加剤の培
地中での使用量は、例えばサイクロデキストリンおよび
イソマルトースの場合は約０．００１〜１％（Ｗ／Ｖ％
、以下同じ）、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼは約０．０１〜１０ｕ／ｍ、α−Ｄ−グルコ
シダーゼはトランスグルコシダーゼ活性として約０．１
〜１００ｕ／ｄまた糖アルコールは約０．０１〜５％で
ある。

本発明で使用する菌株の培養条件としては、培養温度は
菌が生育しβ−アミラーゼが生産される範囲内であれば
よく、通富約２５〜３５℃であり、培地のｐｉは約７．
５〜９．０である。また培養時間はβ−アミラーゼの活
性が最大に達する時間を選べばよく、通常約５０〜７０
時間である。

以上のようにして得られた培養物からβ−アミラーゼを
採取するには、公知の方法に従って行えばよい。例えば
、まず遠心分離、ろ過などにより菌体を除去したのち、
上清またはろ液を濃縮、有機溶媒沈澱することにより粗
酵素粉末が得られ、さらに限外ろ過、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過など
の公知の方法を適宜組み合せることにより精製β−アミ
ラーゼ標品が得られる。

本発明におけるβ−アミラーゼ活性の単位は、０．５％
可溶性澱粉液（ｐＨ７、ｏ、リン酸緩衝液）を基質とし
て４０℃、３０分間反応し、生じた還元糖量をフェーリ
ング・レーマン・ジュール（Ｆｅｈｌｉｎｇ−Ｌｅｈｍ
ａｎｎ−５ｃｈｏｏｌ）法により測定したとき、１０ｍ
ｇのグルコースに相当する還元力のマルトースを生成す
る酵素量を１単位とした。また、添加剤として使用する
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼおよ
びα−Ｄ−グルコシダーゼの活性単位はそれぞれチルデ
ン・ハドソン（ＴＩＬＤＥＮ　−■υＤＳＯＮ）単位〔
ジャーナル・オブ・アプライド・ケミカル・バイオテク
ノロジー（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、）第２１巻、３３０頁、　１９
７１年〕、トランスグルコシダーゼ単位（日本醸造協会
雑誌、第７２巻、４５９頁、１９７７年）によった。

以下、実施例を以て本発明の詳細な説明する。

実施例　１ 可溶性デンプン１．０％、ミルクカゼイン３．５％、酵
母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．０１％、硫酸マ
グネシウム・７水塩０．１％、リン酸二カリウム０．４
％、グリシン０．０７５％、ビタミンＢ１塩酸塩２ｐｐ
ｍおよびクエン酸ナトリウム０．０３％からなる組成の
培地（ｐＨ８，２）　５０−を５００ｄ容の坂ロフラス
コに入れて殺菌後、第１表に示すごとく各添加剤を各濃
度となるように加え、同表に示すバチルス属菌株を接種
した。２８℃において６０時間振盪培養したのち、培養
液のβ−アミラーゼ活性を測定した。

なお、添加剤として使用したサイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼはバチルス・マセランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ　）起源の酵素（大野
製薬社製）であり、トランスグルコシダーゼはアスペル
ギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ
）起源の酵素（同社製）である。また、サイクロデキス
トリン混合物とは澱粉に上記サイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼを作用させて調整したβ−サイ
クロデキストリン約２０％、グルコース約４％、マルト
ース約１１％、その他約６５％の混合物であり、イソマ
ルトース混合物とは澱粉加水分解物に上記トランスグル
コシダーゼを作用させて調整したイソマルトース約３５
％、パノース約２６％、イソマルトトリオース約１１％
、その他のオリゴ糖約２８％の混合物である。

添加剤を加えない場合の活性を１００％としたときの相
対活性を第１表に示す。同表から本発明法による効果が
よくわかる。

（以下余白） 実施例　２ 実施例１に示したと同じ組成の培地５０ｍ１を５００−
容の坂ロフラスコに入れて殺菌後、β−サイクロデキス
トリン９０：α−サイクロデキストリン５：Ｔ−サイク
ロデキストリン５の混合物を０．１％、β−サイクロデ
キストリン５０：イソマルトース５０の混合物を０．１
％およびβ−サイクロデキストリン２０：マルチトール
８０の混合物を０．５％となるように加え、バチルス・
ポリミキサＡＴＣＣ８５２３株を接種し、２８℃におい
て６０時間振盪培養したところ、相対活性は各々１６０
．１５８．１６８％であった。

実施例　３ ポテトスターチ０．５％、ポリペブト′ン２．０％、リ
ン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム７水塩０．
１％からなる組成の培地（ｐＨ７，５）　５０−を５０
〇−容坂ロフラスコに入れて殺菌後、バチルス・セレウ
スＩＦ０３００１株−白金耳を接種し、２８℃で７時間
振盪培養し種培養液とした。次いで、可、溶性デンプン
１．０％、ミルクカゼイン３．５％、酵母エキス０．１
％、塩化ナトリウム０．０１％、硫酸マグネジカム・７
水塩０．１％、リン酸二カリウム０．４％、グリシン０
．０７５％、ビタミンＢ１塩酸塩２ｐｐｍ　、クエン酸
ナトリウム０．０３％およびα−サイクロデキストリン
０．０１％からなる組成の培地（ｐＨ８，２）　１５β
の入った３０β容ジャーファーメンタ−に上記種培養液
を接種し、２８℃、６０時間培養した。

培養液を遠心分離して菌体を除いたのち、上清を限外ろ
過濃縮、次いでアルコール沈降をすることにより粗β−
アミラーゼ粉末９３ｇを得た。

特許出願人　天野製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　バチルス属に属するβ−アミラーゼ生産菌をサイク
   ロデキストリン、サイクロデキストリンを生成する酵素
   、イソマルトース、イソマルトースを生成する酵素また
   は糖アルコールからなる群より選ばれる一種以上を含有
   せしめた培地に培養しβ−アミラーゼを生成蓄積せしめ
   、これを採取することを特徴とするβ−アミラーゼの製
   造法。 ２　サイクロデキストリンがα−サイクロデキストリン
   、β−サイクロデキストリンまたはγ−サイクロデキス
   トリンである特許請求の範囲第１項記載のβ−アミラー
   ゼの製造法。 ３　サイクロデキストリンを生成する酵素がサイクロデ
   キストリングルカノトランスフェラーゼである特許請求
   の範囲第１項記載のβ−アミラーゼの製造法。 ４　イソマルトースを生成する酵素がα−Ｄ−グルコシ
   ダーゼである特許請求の範囲第１項記載のβ−アミラー
   ゼの製造法。 ５　糖アルコールがソルビトールまたはマルチトールで
   ある特許請求の範囲第１項記載のβ−アミラーゼの製造
   法。