JPH08256766A - サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 糖転移活性の強いＣＧＴａｓｅおよびそのよ
うなＣＧＴａｓｅの生産能を有する微生物を提供する。 【構成】 下記の酵素化学的性質を有するサイクロデキ
ストリン・グルカノトランスフェラーゼ： 作用および基質特異性；デンプン、デキストリン、アミ
ロペクチン及びアミロースなどに作用して、主としてβ
−サイクロデキストリンを生成する 至適ｐＨ、至適温度及び安定ｐＨがそれぞれ６．０〜
６．５、６０〜６５℃及び６．５〜１０である 温度安定性；５０℃、１０分間処理で１００％の残存活
性を示す 分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
子量が約６９，０００

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なサイクロデキス
トリン・グルカノトランスフェラーゼ(Cyclodextrin Gl
ucanotransferase) （ＥＣ ２．４．１．１９、以下、
ＣＧＴａｓｅと称する）およびその製造方法に関するも
のである。さらに詳しく述べると、本発明は、ＣＧＴａ
ｓｅ生産能を有するバチルス・サーキュランス(Bacillu
s circulans)に属する菌を培養し、培養物中にＣＧＴａ
ｓｅを産生させ、これを採取することにより得られる新
規なＣＧＴａｓｅおよびその製造方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ＣＧＴａｓｅは、現在までにバチルス・
マセランス(Bacillus macerans) （イービー チルデン
(E.B. Tilden) ら、ジャーナル オブ アメリカン ケ
ミカルソサイエティー(J. Am. Chem. Soc.) 、６１巻、
ページ２９００〜２９０２（１９３９年））、バチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium) （岡田茂孝、津
山直人、北畑寿美雄；アミラーゼシンポジウム、７巻、
ページ６１（１９７２年）及び特開平６−１１３，８４
３号）、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus
stearothermophilus) （特開昭５０−６３，１８９号）
及びバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)
（アグリカルチャル バイオロジカル ケミストリー(A
gric. Biol. Chem.)、５２（５）、ページ１０９９〜１
１０３（１９８８年）、岡田茂孝、北畑寿美雄；アミラ
ーゼシンポジウム、８巻、ページ２１（１９７４年）及
び澱粉科学(J. Jpn. Soc. Starch Sci.)、３３巻、ペー
ジ１４４〜１５１（１９８６年））などから得られるこ
とが知られている。これらの細菌から産生されるＣＧＴ
ａｓｅは、デンプンに作用してグルコース分子６，７ま
たは８個からなるα−、β−及びγ−サイクロデキスト
リンを生成する。この作用により得られるサイクロデキ
ストリンは、６〜８個のグルコース分子がα−１，４−
グルコシド結合によって環状に結合した非還元性のマル
トオリゴ糖であり、中央に疎水性の空隙があるためその
分子空洞内に種々の物質を取り込んで包接化合物を形成
し、取り込まれた物質の物理的及び化学的性質を変化さ
せることができるという長所を有する。このため、サイ
クロデキストリンを用いることによって、酸化しやすい
または光分解しやすい等の不安定な物質の安定化、揮発
性物質の不揮発化および難溶性化合物の可溶化などが可
能となり、医薬品、化粧品および食品などの幅広い分野
で利用されている。特に、β−サイクロデキストリン
は、水への溶解性が低く、有毒な有機溶媒処理を必要と
しないため、食品や医薬用として好ましく使用すること
ができる。

【０００３】また、ＣＧＴａｓｅは、糖転移活性を有す
ることが知られており、ＣＧＴａｓｅを用いて種々の有
用な特徴を持つオリゴ糖や配糖体が合成されている。特
に、デンプンとショ糖にＣＧＴａｓｅを作用させること
により得られる水飴状物は、デキストラン形成能が低い
ので虫歯を起こしにくい糖として使用が注目を浴びてい
る。

【０００４】上記したように、近年、ＣＧＴａｓｅの糖
転移活性が着目され、種々の有用な配糖体が合成されて
いるが、そのほとんどは転移活性の強いバチルス・ステ
アロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) の
ＣＧＴａｓｅ（特開昭５０−６３，１８９号）を利用し
たものであり、他の起源のＣＧＴａｓｅを用いた有用配
糖体の合成に関する報告は少ない。これは他の起源のＣ
ＧＴａｓｅの糖転移活性が弱いことに起因しており、新
たな強力な糖転移活性を有するＣＧＴａｓｅおよびその
ようなＣＧＴａｓｅ生産能を有する微生物の発見が強く
望まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、糖転移活性の強いＣＧＴａｓｅ生産能を有する新規
な微生物を提供することを目的とするものである。

【０００６】また、本発明の他の目的は、上記したよう
な微生物を培養し、培養物中にＣＧＴａｓｅを産生せし
め、これを採取することによって得られる新規なＣＧＴ
ａｓｅを提供することである。また、本発明のさらなる
他の目的は、上記したような新規なＣＧＴａｓｅの製造
方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖転移活
性の強いＣＧＴａｓｅ生産能を有する微生物を広く自然
界に求め、鋭意検討を試みた結果、バチルス・サーキュ
ランス(Bacillus circulans)に属する菌株が糖転移活性
の強いＣＧＴａｓｅを生産し、これにより本発明の目的
が達成されることを発見した。これにより、本発明は完
成した。

【０００８】すなわち、上記目的は、下記の酵素化学的
性質を有するサイクロデキストリン・グルカノトランス
フェラーゼによって達成される： 作用および基質特異性；デンプン、デキストリン、
アミロペクチン及びアミロースなどに作用して、主とし
てβ−サイクロデキストリンを生成する 至適ｐＨ；６．０〜６．５ 至適温度；６０℃ 安定ｐＨ；６．５〜１０．０ 温度安定性；５０℃、１０分間処理で１００％の残
存活性を示す。なお、１０ｍＭカルシウム塩の添加によ
り、６０℃、１０分間の処理においても８５％の残存活
性を示す 分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で、分子量が約６９，０００。

【０００９】本発明は、バチルス・サーキュランス(Bac
illus circulans)に属し、サイクロデキストリン・グル
カノトランスフェラーゼ生産能を有する微生物を培養
し、培養物中にサイクロデキストリン・グルカノトラン
スフェラーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴
とするサイクロデキストリン・グルカノトランスフェラ
ーゼの製造方法によっても達成される。

【００１０】本発明はさらに、サイクロデキストリン・
グルカノトランスフェラーゼ生産能を有するバチルス・
サーキュランス(Bacillus circulans)菌によっても達成
される。本発明は、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１４８２
９号であるバチルス・サーキュランス菌を示すものであ
る。

【００１１】

【作用】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】本発明のＣＧＴａｓｅは、以下の表に記載
されるような理化学的性質を有するものである。

【００１３】

【表１】

【００１４】本発明による微生物は、バチルス・サーキ
ュランス(Bacillus circulans)に属し、かつ高いＣＧＴ
ａｓｅ生産能を有する微生物であり、新たに土壌から分
離されたものである。この菌株の菌学的性質を以下に示
す。

【００１５】（ａ）形態的性質 細胞の形および大きさ： 桿菌で（０．５〜０．
８）μｍ×（３．０〜４．０）μｍ 細胞の多形性の有無： あり（膨脹する） 運動性の有無： あり 胞子の有無： あり （ｂ）培養的性質 肉汁寒天平板培養： 発育は弱く、表面が平滑な、
やや黄色がかった白色のコロニーを形成する。コロニー
の大きさは、直径約１ｍｍ以下である。 肉汁寒天斜面培養： 発育は弱く、半透明のコロニ
ーを形成する。 肉汁液体培養： 培地は全体に薄く白濁し、液体の
底部に菌泥沈殿がみられる。 （ｃ）生理的性質 グラム染色性： 不定形 硝酸塩の還元： 陽性 ＶＰテスト： 陰性 インドールの生成： 陰性 デンプンの加水分解： 陽性 クエン酸の利用： 陰性 色素の生成： 陰性 ウレアーゼ： 陰性 オキシダーゼ： 陽性 カタラーゼ： 陽性 生育の範囲： ３７℃、４５℃及び５０℃で陽性であ
り、６５℃で陰性 酸素に対する態度： 好気性 Ｏ−Ｆテスト： 決定できず （ｄ）下記の糖類からの酸及びガスの生成の有無

【００１６】

【表２】

【００１７】（ｅ）その他の特徴的な生理的性質 グルコースからのガスの産生： 陰性 グルコースからの酸の産生： 陽性 アセトイン： 陰性 エッグヨーク反応： 陰性 カゼインの加水分解： 陰性 ゼラチンの加水分解： 陽性 チロシンの加水分解： 陰性 アルギニンデヒドロラーゼ： 陰性 食塩に対する生育性： ５％及び７％で陽性であり、１
０％で陰性 本菌株について、バージーズ マニュアル オブ シス
テマティック バクテリオロジー、第２版(Bergey ´s
Manual of Systematic Bacteriology 2nd)（１９８６
年）および「ザ ジーナス バチルス(The Genus Bacil
lus)」、ユーエスデパートメント オブ アグリカルチ
ャー ハンドブック(U.S. Department of Agriculture
Handbook) No.４２７（１９７３年）を参考にして検討
を行った結果、本菌をバチルス・サーキュランス(Bacil
lus circulans)に属するものと同定した。

【００１８】また、本菌株を培養し、培養物中にＣＧＴ
ａｓｅを産生せしめ、これを採取して得られるＣＧＴａ
ｓｅの理化学的性質を、実施例２において記載したよう
にして、バチルス・サーキュランスを同様にして起源と
する既知のＣＧＴａｓｅ（アグリカルチャル バイオロ
ジカル ケミストリー(Agric. Biol. Chem.)、５２
（５）、ページ１０９９〜１１０３（１９８８年）；岡
田茂孝、北畑寿美雄；アミラーゼシンポジウム、８巻、
ページ２１（１９７４年）；及び澱粉科学(J. Jpn.Soc.
Starch Sci.)、３３巻、ページ１４４〜１５１（１９
８６年））の性質と比較したところ、本発明によるＣＧ
Ｔａｓｅは、上記文献で既知のバチルス・サーキュラン
スのＣＧＴａｓｅとは異なる性質を有することが分かっ
た。これにより、本発明によるＣＧＴａｓｅは新規なＣ
ＧＴａｓｅであり、さらに、本菌株は明らかに公知の菌
種と区別される新規な微生物であると判断した。このた
め、本菌をバチルス・サーキュランス ４ｄ１(Bacillu
s circulans 4d1)（以下、単に「４ｄ１株」と称する）
と命名した。

【００１９】この４ｄ１株は、平成７年３月１５日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、その受
託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４８２９号である。

【００２０】本発明において、菌株の培養に使用する培
地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、本
菌が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその
他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天
然培地のいずれでもよい。

【００２１】本発明の菌株の培養において使用できる炭
素源としては、本菌株が良好に生育し、目的とする酵素
を順調に生産できうるものであれば特に制限されず、デ
ンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デ
ンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン及びα−デ
ンプン等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可
溶性デンプン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプ
ン、甘藷デンプン、デキストリン、アミロペクチン及び
アミロース等が挙げられる。これらの炭素源は、単独あ
るいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

【００２２】本発明の菌株の培養において使用できる窒
素源としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵
母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイ
ン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコーンスティープリ
カー等の有機窒素化合物、およびアンモニア、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムなど
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素
等の無機窒素化合物等が挙げられる。これらの窒素源
も、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用でき
る。

【００２３】本発明において使用できる無機塩として
は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウ
ム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸
塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以
上を使用することができる。

【００２４】本発明において、培養は、好気的条件下で
行われ、その際の培養条件は、培地の組成や培養法によ
って適宜選択され、本菌株が増殖し目的とする酵素を産
生できる条件であれば特に制限されない。通常は、培養
温度が、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃であ
り、また、培養に適当な培地のｐＨは、５〜９、好まし
くは６〜８である。培養時間は、培養温度及びｐＨや菌
体の初期濃度等の培養条件および培養方法によって異な
るが、例えば、５００ｍｌ容量の坂口フラスコを用いて
１００ｍｌの培養液中に４ｄ１株を一白金耳接種して３
７℃で振盪培養（１３０ｒｐｍ）を行った場合、３０〜
９０時間、好ましくは４０〜６０時間である。

【００２５】ここで、４ｄ１株の培養方法の一実施態様
を以下に示す。可溶性デンプン１．０％、ポリペプトン
１．０％、酵母エキス０．３％、ＮａＣｌ０．３％及び
硫酸アンモニウム０．３％からなる培地（ｐＨ７．０）
１００ｍｌを５００ｍｌ容量の坂口フラスコに入れ、オ
ートクレーブ（１２１℃、１５分間）による滅菌処理を
行う。次に、４ｄ１株の一白金耳を接種し、３７℃、１
３０ｒｐｍの振盪条件下において５０時間培養する。

【００２６】以上のようにして、培養物中に産生蓄積さ
れたＣＧＴａｓｅは、以下の方法によって菌体から採取
することができる。

【００２７】上記したようにして培養した４ｄ１株を遠
心分離等によって菌体を培養液から除去し、培養瀘液を
得る。この培養瀘液から、硫安塩析または有機溶媒沈降
などにより、粗ＣＧＴａｓｅを回収する。このようにし
て得られた粗ＣＧＴａｓｅをさらにデアエ(DEAE)−トヨ
パール６５０Ｍ等を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ー、セファクリル エス−２００エッチアール(Sephacr
yl S-200HR) 等を用いたゲル瀘過クロマトグラフィー、
ブチル(Butyl) −トヨパール６５０Ｍ等を用いた疎水ク
ロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフ
ィーなどのクロマトグラフィーや電気泳動等の手法を単
独若しくは組み合わせて用いることによって、ＣＧＴａ
ｓｅを電気泳動的に単一になるまで精製する。

【００２８】また、培養液からのＣＧＴａｓｅの精製方
法の一実施態様を以下に記載する。上記したようにして
培養した４ｄ１株の培養液を遠心分離（６，５００×
ｇ、３０分間）することにより、培養液から菌体を除去
し、粗ＣＧＴａｓｅを得る。このようして得られた粗Ｃ
ＧＴａｓｅに関して、硫安塩析、ブチル(Butyl) −トヨ
パール６５０Ｍを用いた疎水クロマトグラフィー、デア
エ(DEAE)−トヨパール６５０Ｍを用いたイオン交換クロ
マトグラフィーおよびセファクリル エス−２００エッ
チアール(Sephacryl S-200HR) 等を用いたゲル瀘過クロ
マトグラフィーを順次行うことによって、電気泳動的に
単一な精製ＣＧＴａｓｅが得られる。

【００２９】このようにして得られた本発明のＣＧＴａ
ｓｅの糖転移活性を、実施例３において記載するように
して、特開昭５０−６３，１８９号において糖転移活性
が強いと報告されているバチルス・ステアロサーモフィ
ラス(Bacillus stearothermophilus) のＣＧＴａｓｅの
糖転移活性と比較したところ、本発明の酵素はバチルス
・ステアロサーモフィラスのものと同等の活性を有する
ことが分かった。これから、本発明のＣＧＴａｓｅは、
バチルス・ステアロサーモフィラスと同等の強い糖転移
活性を有するものである。

【００３０】なお、本発明において、ＣＧＴａｓｅの糖
転移活性は、以下の方法（以下、活性測定法と称する）
によって測定した。０．５５％デンプン溶液（５０ｍＭ
酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）２５０μｌを４０℃で５分間
予めインキュベートした後、ＣＧＴａｓｅ溶液５０μｌ
を添加した。１０分後、０．５Ｍ酢酸１ｍｌを加え、７
００ｎｍにおける吸光度を測定した。この際、１Ｕは、
１分間に７００ｎｍの吸光度を１０％減少させる酵素量
とした。

【００３１】また、タンパク質の定量は、標準タンパク
質としてウシ血清アルブミンを用いてローリー(Lowry)
らの方法により測定した。

【００３２】

【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限
されるものでないことはいうまでもない。

【００３３】なお、以下の実施例において、酵素の転移
活性およびタンパク質の定量は、作用に記載した方法と
同様にして測定した。

【００３４】実施例１ 可溶性デンプン１．０％、ポリペプトン１．０％、酵母
エキス０．３％、ＮａＣｌ０．３％及び硫酸アンモニウ
ム０．３％からなる培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５
００ｍｌ容量の坂口フラスコに入れ、オートクレーブ
（１２１℃、１５分間）による滅菌処理を行った。次
に、４ｄ１株の一白金耳を接種し、３７℃、１３０ｒｐ
ｍの振盪条件下において５０時間培養した。同様にして
培養した計８５０ｍｌの培養液を遠心分離（６，５００
×ｇ、３０分間）した後、培養液から菌体を除去し、上
澄み液を粗酵素液とした。この粗酵素液を活性測定法に
より転移活性を測定した結果、ＣＧＴａｓｅの総活性は
１００，０００Ｕであり、比活性は３．０Ｕ／ｍｇであ
った。

【００３５】次に、このようにして得られた粗ＣＧＴａ
ｓｅ液を硫安３０％飽和にし、遠心分離（２０，０００
×ｇ、３０分間）により上澄み液を得た。さらに、この
上清を硫安６５％飽和にし、遠心分離（２０，０００×
ｇ、３０分間）により沈殿物を得た。この沈殿物を２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）約２００ｍｌに
溶解し、同緩衝液に対して４０時間透析した。

【００３６】このようにして得られたＣＧＴａｓｅ溶液
に硫安を硫安３０％飽和になるように添加した。次に、
硫安３０％飽和のＣＧＴａｓｅ溶液を硫安３０％飽和の
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し
たブチル(Butyl) −トヨパール６５０Ｍの疎水クロマト
グラフィーカラムに供し、非吸着物を同緩衝液で洗浄除
去した後、硫安３０％〜０％飽和の直線的濃度勾配溶出
法によりＣＧＴａｓｅを溶出させた。次に、ＣＧＴａｓ
ｅ活性画分を集め、硫安２０％飽和の２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチル(Butyl)
−トヨパール６５０Ｍの疎水クロマトグラフィーカラム
に供し、非吸着物を同緩衝液で洗浄除去した後、硫安２
０％〜０％飽和の直線的濃度勾配溶出法によりＣＧＴａ
ｓｅを溶出させた。ＣＧＴａｓｅ活性画分を集め、２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して４０時
間透析した。得られたＣＧＴａｓｅ溶液を２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したデアエ(DEA
E)−トヨパール６５０Ｍのイオン交換クロマトグラフィ
ーカラムに供し、非吸着物を同緩衝液で溶出させた。さ
らに、この溶出液を限外瀘過膜を用いて濃縮し、０．１
Ｍ ＮａＣｌを含んだ２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したセファクリル エス２００−エ
ッチアール(Sephacryl S-200HR) のゲル瀘過クロマトグ
ラフィーカラムに供し、ゲル瀘過クロマトグラフィーを
行った。ＣＧＴａｓｅ活性画分を集め同様にして活性測
定法により活性を測定したところ、総活性が２８，７０
０Ｕであり、比活性が８，８００Ｕ／ｍｇであった。

【００３７】また、この画分に関して電気泳動を行った
ところ、ＣＧＴａｓｅは単一のバンドを示したことか
ら、上記処理によって得られたＣＧＴａｓｅは十分精製
されていることが分かった。精製の結果を表３に示す。

【００３８】

【表３】

【００３９】実施例２ 以下のようにして、４ｄ１株の産生するＣＧＴａｓｅに
関する作用及び基質特異性、至適ｐＨ、至適温度、安定
ｐＨ、温度安定性および分子量を測定した。

【００４０】１）作用及び基質特異性：２％可溶性デン
プン（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）１０ｍｌに
実施例１で得られたＣＧＴａｓｅを２００Ｕ加え、４０
℃でインキュベートした。次に、このようにして調製さ
れたサンプルから経時的に５００μｌずつサンプリング
し、採取したサンプルを５分間煮沸することによってＣ
ＧＴａｓｅを失活させた。さらに、グルコアミラーゼを
７．６Ｕ加え、４０℃で一晩反応させ、サイクロデキス
トリン以外のオリゴ糖を分解し、反応液中のサイクロデ
キストリンをＨＰＬＣを用いて測定し、デンプンに対す
るサイクロデキストリンの生成率を求めた。

【００４１】結果を図１に示す。図１において、黒丸は
α−サイクロデキストリンの生成量を示し、白丸はγ−
サイクロデキストリンの生成量を示し、白四角はβ−サ
イクロデキストリンの生成量を示し、黒四角はサイクロ
デキストリンの合計の生成量を示すものである。図１か
ら、本発明のＣＧＴａｓｅによって、デンプンから主と
してβ−サイクロデキストリンが生成することが示され
る。

【００４２】２）至適ｐＨ：活性測定法に従い、各ｐＨ
における酵素活性を測定した。なお、ｐＨ４．０〜６．
５は５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５は５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜１０．０は５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液をそれぞれ緩衝液として用いた。結果を
図２に示す。図２において、黒丸は５０ｍＭ酢酸緩衝液
を示し、白丸は５０ｍＭリン酸緩衝液を示し、黒三角は
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を示す。図２から明らかな
ように、本発明のＣＧＴａｓｅの至適ｐＨは６．０〜
６．５であることが示される。

【００４３】３）至適温度：活性測定法に従い、各温度
条件下における酵素活性を測定した。また、１０ｍＭ塩
化カルシウムを加えた系においても同様の方法で酵素活
性を測定した。結果を図３に示す。図３において、黒丸
は塩化カルシウム無添加時の結果を示し、白丸は塩化カ
ルシウム添加時の結果を示す。図３から明らかなよう
に、本発明のＣＧＴａｓｅの至適温度は６０℃であり、
塩化カルシウムを添加した際の酵素の至適温度は６５℃
であることが示される。

【００４４】４）安定ｐＨ：本発明のＣＧＴａｓｅを
３．５〜１０．０のｐＨ条件下において、３７℃で３時
間インキュベートした後、残存活性を活性測定法に従い
測定した。なお、ｐＨ４．０〜６．５は５０ｍＭ酢酸緩
衝液、ｐＨ６．０〜７．５は５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．０〜１０．０は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液をそ
れぞれ緩衝液として用いた。結果を図４に示す。図４に
おいて、黒丸は５０ｍＭ酢酸緩衝液を示し、白丸は５０
ｍＭリン酸緩衝液を示し、黒三角は５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液を示す。図４から明らかなように、本発明のＣ
ＧＴａｓｅの安定ｐＨ領域は６〜１０およびそれ以上で
ある。

【００４５】５）温度安定性：本発明のＣＧＴａｓｅを
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて、各温度で１
０分間インキュベートし、それぞれの残存活性を活性測
定法に従い測定した。また、１０ｍＭ塩化カルシウムを
加えた系においても同様の方法で酵素活性を測定した。
結果を図５に示す。図５において、黒丸は塩化カルシウ
ム無添加時の結果を示し、白丸は塩化カルシウム添加時
の結果を示す。図５から、本発明のＣＧＴａｓｅは、５
０℃、１０分間処理しても１００％の残存活性を示し、
さらに、１０ｍＭ塩化カルシウムの添加により６０℃、
１０分間の処理においても８５％の残存活性を示すこと
が分かった。

【００４６】６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により、分子量を測定した。その結果、本
発明のＣＧＴａｓｅの分子量は約６９，０００であっ
た。

【００４７】さらに、上記した本発明のＣＧＴａｓｅの
酵素化学的性質を、既知のバチルス・サーキュランス(B
acillus circulans)のＣＧＴａｓｅの性質と比較し、そ
の結果を表４に示す。

【００４８】

【表４】

【００４９】表４から、本発明のＣＧＴａｓｅは、すべ
ての既知のバチルス・サーキュランス(Bacillus circul
ans)とは異なる酵素化学的性質を有していることが示さ
れ、これから本発明のＣＧＴａｓｅは新規な酵素である
と考えられる。

【００５０】実施例３ 本発明のＣＧＴａｓｅの糖転移活性を、以下の測定方法
Ａ及びＢを用いて測定した。なお、本発明のＣＧＴａｓ
ｅの糖転移活性は、測定方法Ａ及びＢによって本酵素の
糊精化力及びショ糖への転移力をそれぞれ測定し、糊精
化力を標準としてこれに対するショ糖への転移力の相対
比を求め、この値によって評価した。

【００５１】測定法Ａ（糊精化力）：１ｍＭ塩化カルシ
ウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に可溶
性デンプンを０．３％（ｗ／ｖ）濃度になるように溶解
し、基質溶液を調製した。この基質溶液５ｍｌに実施例
１で得られたＣＧＴａｓｅ液を０．２ｍｌ加え、４０℃
で１０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを０．０２
Ｎ硫酸１５ｍｌの中にとり反応を停止させた。この混合
液に０．１Ｎヨード液０．２ｍｌを添加混合した後、６
６０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００５２】活性１単位は、４０℃、１０分間に可溶性
デンプン１５ｍｇのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素
量とする。

【００５３】測定法Ｂ（ショ糖への転移力）：可溶性デ
ンプン及びショ糖を２ｍＭ塩化カルシウムを含んだ３０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）にそれぞれ６．７％（ｗ
／ｖ）濃度になるように溶解し、基質溶液を調製した。
この基質溶液３ｍｌに実施例１で得られたＣＧＴａｓｅ
液を１ｍｌ加え、４０℃で１０分間反応させた後、反応
液０．５ｍｌを１Ｎ塩酸９ｍｌの中にとり反応を停止さ
せた。この混合液から０．５ｍｌをサンプリングし、
０．０２Ｎ硫酸１５ｍｌに注入し、さらに０．１Ｎヨー
ド液０．２ｍｌを添加混合した後、６６０ｎｍにおける
吸光度を測定した。

【００５４】活性１単位は、４０℃、１０分間に可溶性
デンプン２００ｍｇのヨウ素呈色を１０％減少させる酵
素量とする。その結果、本発明のＣＧＴａｓｅの糊精化
力に対する転移力の比は１．９５であった。

【００５５】これから、上記した本発明のＣＧＴａｓｅ
の酵素活性の相対比は、１．９５であり、また、特開昭
５０−６３，１８９号において糖転移活性が強いと報告
されているバチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillu
s stearothermophilus) ＦＥＲＭ−Ｐ No.２２２２につ
いて同様にして測定した際の酵素活性の相対比が１．８
４であったことから、本発明のＣＧＴａｓｅはバチルス
・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophil
us) ＦＥＲＭ−Ｐ No.２２２２のＣＧＴａｓｅと同等若
しくはそれ以上の糖転移活性を有することが分かった。

【００５６】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によると、糖
転移活性の強いＣＧＴａｓｅおよびそのような糖転移活
性の強いＣＧＴａｓｅを生産することが可能な微生物が
得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＣＧＴａｓｅのインキュベーション時間と各
種サイクロデキストリンの生成率との関係を示すグラフ
である。

【図２】 ｐＨとＣＧＴａｓｅの相対活性との関係を示
すグラフである。

【図３】 温度とＣＧＴａｓｅの相対活性との関係を示
すグラフである。

【図４】 ｐＨとＣＧＴａｓｅの残存活性との関係を示
すグラフである。

【図５】 温度とＣＧＴａｓｅの残存活性との関係を示
すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:09）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の酵素化学的性質を有するサイクロ
   デキストリン・グルカノトランスフェラーゼ： 作用および基質特異性；デンプン、デキストリン、
   アミロペクチン及びアミロースなどに作用して、主とし
   てβ−サイクロデキストリンを生成する 至適ｐＨ；６．０〜６．５ 至適温度；６０℃ 安定ｐＨ；６．５〜１０．０ 温度安定性；５０℃、１０分間処理で１００％の残
   存活性を示す。なお、１０ｍＭカルシウム塩の添加によ
   り、６０℃、１０分間の処理においても８５％の残存活
   性を示す 分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   で、分子量が約６９，０００。
2. 【請求項２】 バチルス・サーキュランス(Bacillus ci
   rculans)に属し、サイクロデキストリン・グルカノトラ
   ンスフェラーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物
   中にサイクロデキストリン・グルカノトランスフェラー
   ゼを産生せしめ、これを採取することを特徴とするサイ
   クロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造
   方法。
3. 【請求項３】 サイクロデキストリン・グルカノトラン
   スフェラーゼ生産能を有するバチルス・サーキュランス
   (Bacillus circulans)菌。
4. 【請求項４】 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１４８２９号
   である、請求項３に記載のバチルス・サーキュランス
   菌。