CN103966180A - 一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶的第577位天冬氨酸(Asp)分别突变为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)，所得突变体相比于野生CGT酶，环化活力明显提高，更适合环糊精的工业化生产。

Description

一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法
技术领域
本发明涉及一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。
环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较低，使得环糊精的工业生产成本较高。
本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶总的环化活力约为302U/mg，因此，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的工业化生产。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CGT酶的第577位的天冬氨酸(Asp)分别突变为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)。所得5种突变体分别命名为：D577A、D577G、D577E、D577R和D577K。
编码所述CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01。所述CGT酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K的方法。根据B.circulans STB01CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Ala577、Gly577、Glu577、Arg577和Lys577密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码D577A、D577G、D577E、D577R和D577K突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
所述方法包括以下步骤：
(1)利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变，所用引物分别是：
引入Asp577Ala突变的引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Asp577Gly突变的引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Asp577Glu突变的引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Asp577Arg突变的引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Asp577Lys突变的引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基。
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。
将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将含编码CGT酶突变体的基因的表达载体转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。上述各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
(2)突变体的表达与纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水PhenylHP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K酶制品。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
本发明的有益效果：构建了5个有意义的突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K，均实现了重组CGT酶环化活力的提高，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。
附图说明
图1野生型CGT酶及其突变体在pH6.5、50℃下作用于10％(湿基，w/v)麦芽糊精生产环糊精情况；A，野生CGT酶；B，突变体D577A；C，突变体D577G；D，突变体D577E；E，突变体D577R；F，突变体D577K；■,α-环糊精；●,β-环糊精；▲,γ-环糊精。
具体实施方式
实施例1突变位点的确定
钙离子结合位点广泛存在于α-淀粉酶家族中，作为α-淀粉酶家族(家族13)的一员，CGT酶也具有相似的钙离子结合位点。通过序列比对和晶体结构分析发现，钙离子结合位点CaⅢ在不同来源的CGT酶中存在显著差异，这暗示了该位点氨基酸残基的改变可能会对酶的活性产生影响。来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的CGT酶的钙离子结合位点由Ala315和Asp577两个氨基酸残基组成。
实施例2突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K的制备
(1)定点突变
根据SEQ ID NO.1所示的野生CGT酶基因序列，分别设计并合成引入Ala577、Gly577、Glu577、Arg577和Lys577密码子突变的引物。
利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变。
引入Ala577密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Gly577密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Glu577密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Arg577密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基；
引入Lys577密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3’，下划线为突变碱基。
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。
将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将含编码突变体的基因的突变质粒cgt/pST转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
(2)突变体的表达和纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于50mL LB培养基的三角瓶中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。将发酵液于4℃、10000rpm下离心20min以除去菌体，收集上清液。
将发酵上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法进行亲和纯化，得到第577位Asp分别突变为Ala、Gly、Glu、Arg及Lys的CGT酶，这些突变体酶分别命名为D577A、D577G、D577E、D577R和D577K。
实施例3酶活测定分析
(1)酶活力的测定
α-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入1.0mL1.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用10mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙溶液20℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白，对应α-环糊精标准曲线的测定出α-环糊精的含量。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol的环糊精所需的酶量。
β-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。
γ-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入50μL1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL0.2M柠檬酸缓冲液(pH4.2)和100μL5mM溴甲酚绿溶液，在室温下保温15min，在615nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolγ-环糊精所需的酶量。
CGT酶的总环化活力即为上述三种环化活力之和。
(2)酶活力比较
实验结果列于表1，结果发现，与野生CGT酶相比，突变体D577A的总环化活力提高了5.9％；突变体D577G的总环化活力提高了8.7％；突变体D577E总环化活力提高了14.0％；突变体D577R总环化活力提高了32.5％；突变体D577K总环化活力提高了1.3％。突变体D577A、D577GD577E、D577R和D577K的产物特异性基本保持不变，β-环化活力占总环化活力的比例也没有发生明显改变。
表1
实施例4利用HPLC分析环糊精生成量
以配制10％(湿基，含水量8％，w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液作为底物，10g麦芽糊精(DE＝5)溶解在90mL磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分别加入一定量的野生CGT酶、突变体D577A、D577G、D577E、D577R、D577K使反应体系中β-环化活力为1U/mL，置于45℃下反应24h，隔时间取样600μL，煮沸灭酶10min，12000rpm离心10min，取上清500μL，加5μL糖化酶(70U/mL)，在30℃糖化1h，10min煮沸灭活，12000rpm离心30min，取上清经0.45μm超滤膜过滤后取20μL上HPLC分析。
HPLC测定条件为：Waters600高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，流动相采用68％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。
实验结果如图1和表2所示，当以10％麦芽糊精为底物时，相比于野生CGT酶，突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K具有更高环化活力。经过24h酶反应后，与野生型相比，突变体D577A和D577G转化淀粉为环糊精的比率分别提高了2％和7％，产物中β-环糊精所占的比例分别提高了2％和4％；突变体D577R和D577K的底物转化率分别提高了4％和2％，产物中β-环糊精所占的比例分别提高了5％和1％；而突变体D577E的底物转化率虽然下降了2％，但产物中β-环糊精所占比例提高了5％。综合以上数据可以看出，这5种突变体更适于环糊精的工业化生产应用。
表2
此外，我们以5％(湿基，含水量8％，w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液作为底物，按照上述方法重复了环糊精生产的实验。实验结果显示，相比于野生型CGT酶，突变体D577A、D577G和D577E的底物转化率均提高了7％左右，突变体D577K的底物转化率提高了5％，突变体D577R的底物转化率提高了11％。这说明在降低底物浓度以后，以上5种突变体转变淀粉为环糊精的能力仍然优于野生型CGT酶，因而这5种突变体更适于环糊精的工业化生产应用。
由上述结果可以推测，CGTase第577位氨基酸残基为天冬氨酸(Asp)，具有较长的极性侧链，而在酶的结构中，较长的氨基酸残基侧链会对其周围结构造成冲撞，并不利于酶结构的稳定。因此，将577位天冬氨酸(Asp)突变为侧链较短的丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)，借此稳定酶的结构，使得CGT酶的环化活力得以提高。此外，晶体结构分析显示，第577位天冬氨酸(Asp)不能与周围氨基酸残基形成氢键或其它分子间相互作用，这并不利于该处结构的稳定。因此，将577位天冬氨酸(Asp)突变为带电荷的谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)，这3种氨基酸残基具有长且富有弹性的极性侧链，能与577位点周围的氨基酸残基形成氢键，借此稳定酶的结构，使得CGT酶的环化活力得以提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第577位的天冬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述突变体的方法，根据SEQ ID NO.1所示的基因序列，分别设计并合成定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码D577A、D577G、D577E、D577R和D577K突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述定点突变引物分别是：
引入Asp577Ala突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3’；
引入Asp577Gly突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3’；
引入Asp577Glu突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3’；
引入Asp577Arg突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3’；
引入Asp577Lys突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3’。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilisWB600的单克隆于含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以体积比4％的接种量接种到含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K。
7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化能力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CGTase的第577位天冬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。
8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。
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