CN103122341B - 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明通过对于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)来源的CGTase第47位的赖氨酸，第89位的酪氨酸，第94位的天冬酰胺和第196位的天冬氨酸分别突变成亮氨酸K47L，苯丙氨酸Y89F，脯氨酸N94P和酪氨酸D196Y，使AA-2G产量分别提高了30.7%，10.9%，10.0%和31.7%。对以上突变株进行复合突变，获得双突变体K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，三点突变体K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y及四点突变体K47L/Y89F/N94P/D196Y。它们利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G的产量分别提高了42.6%，11.0%，37.6%，43.6%，43.6%，41.6%，44.5%，50.5%，20.8%，35.6%及64.4%。这些突变株比野生型CGTase更利于利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G。
Description
技术领域
本发明涉及一种环糊精糖基转移酶及制备方法，特别是一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法。
背景技术
L-抗坏血酸（L-AA，维生素C）是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。
2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α-1,4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。
目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）是最常用的催化酶。通常以α-环糊精或β-环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体（如麦芽糊精）将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）对麦芽糊精的底物特异性（转化率）较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对麦芽糊精的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因为出发序列，将第47位的赖氨酸，第89位的酪氨酸，第94位的天冬酰胺和第196位的天冬氨酸分别突变成亮氨酸K47L，苯丙氨酸Y89F，脯氨酸N94P和酪氨酸D196Y或将其组合。
所述环糊精糖基转移酶优选为第89位酪氨酸突变为苯丙氨酸及第196位天冬氨酸突变为酪氨酸的突变体；第47位赖氨酸突变为亮氨酸，第89位酪氨酸突变为苯丙氨酸及第94位天冬酰胺突变为脯氨酸的突变体；最优选第47位赖氨酸突变为亮氨酸、第89位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第94位的天冬酰胺突变为脯氨酸及第196位的天冬氨酸突变为酪氨酸的突变体。
所述环糊精葡萄糖基转移酶基因来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。
所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以Genbank AF047363.1公布的基因为出发基因,将第47位的赖氨酸，第89位的酪氨酸，第94位的天冬酰胺和第196位的天冬氨酸分别突变成亮氨酸K47L，苯丙氨酸Y89F，脯氨酸N94P和酪氨酸D196Y或将其组合进行多点复合突变。
产所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2）将步骤1）获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）得到基因工程菌。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
本发明的有益效果：本发明构建了15个有意义的突变体，均实现了环糊精糖基转移酶对麦芽糊精的底物特异性的提高，最高提高了64.4%，以此为糖基供体所产AA-2G产量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工业化生产。
附图说明：
图1不同反应时间下野生型CGTase和单突变体酶生成AA-2G的产量；
■：野生型CGTase；●：K47L；▲：Y89F；▼：N94P；◆：D196Y；
图2不同反应时间下野生型CGTase和双突变体酶生成AA-2G的产量；
■：野生型CGTase；●：K47L/Y89F；▲：K47L/N94P；▼：K47L/D196Y；：Y89F/N94P；Y89F/D196Y；◆：N94P/D196Y；
图3不同反应时间下野生型CGTase，三点突变体酶及四点突变体酶生成AA-2G的产量；
■：野生型CGTase；●：K47L/Y89F/N94P；▲：K47L/Y89F/D196Y；▼：K47L/N94P/D196Y；
◆：Y89F/N94P/D196Y；★：K47L/Y89F/N94P/D196Y。
具体实施方式
实施例1：底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶
本发明的环糊精糖基转移酶是在GenBank AF047363.1公布的基因序列基础上，对其4个位点的氨基酸进行单突变或复合突变获得，具体获得了15种突变体,分别为K47L，Y89F，N94P，D196Y,K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P/D196Y。
可以通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的4个位点进行氨基酸的取代。
实施例2：底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法
本例以PCR方法为例进行说明，但被发明的保护并不限于仅通过PCR方法获得突变的方法。突变体酶K47L，Y89F，N94P，D196Y,K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P/D196Y的制备方法如下：
1）定点突变
单突变体酶K47L，Y89F，N94P及D196Y的定点突变，利用快速突变试剂盒MutanBESTkit，以表达载体cgt/pET-20b(+)1为模板，
引入K47L密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-CCAATTTGCTGCTCTATTTCGGGGG-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3′；
引入Y89F密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-ATCACCTCCGTCATCAAGTTTTCCG-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATTTTCCACAGGCTGGGATATCCAGAG-3′；
引入N94P密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTAACCCAACGTCTTATCACGGTTAC-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-CGCCGGAATACTTGATGACGGAGGT-3′。
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
双突变体酶K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y及N94P/D196Y的定点突变：利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，分别以单突变体酶K47L基因为模板，
引入Y89F密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-ATCACCTCCGTCATCAAGTTTTCCG-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATTTTCCACAGGCTGGGATATCCAGAG-3′；
引入N94P密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTAACCCAACGTCTTATCACGGTTAC-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-CGCCGGAATACTTGATGACGGAGGT-3′。
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
分别以单突变体酶Y89F基因为模板，
引入N94P密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTAACCCAACGTCTTATCACGGTTAC-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-CGCCGGAATACTTGATGACGGAGGT-3′。
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
以单突变体酶N94P基因为模板，
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
三突变体酶K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y及Y89F/N94P/D196Y的定点突变：利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，分别以双突变体酶K47L/Y89F基因为模板，
引入N94P密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTAACCCAACGTCTTATCACGGTTAC-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-CGCCGGAATACTTGATGACGGAGGT-3′。
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′-TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
以双突变体酶K47L/N94P基因为模板，
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
以双突变体酶Y89F/N94P基因为模板，
引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
四突变体酶K47L/Y89F/N94P/D196Y的定点突变：利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，以三突变体酶K47L/Y89F/N94P基因为模板，引入D196Y密码子的定点突变引物为：
正向引物：5′TTACAAGAACCTCTACTATCTGGCGGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5′-ATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATCG-3′。
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，2.5mM dNTPs 4μL,10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μL PrimeSTAR Taq HS 0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃ 10s,62℃ 15s，72℃ 6min30个循环；最后72℃保温10min；
PCR产物经MutanBEST kit处理，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL 21(DE3)感受态细胞，所有质粒均测序正确；
2）突变体表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL 21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养生长8～10h，按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液。
上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化突变体酶K47L，Y89F，N94P，D196Y,K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P/D196Y。
实施例3：本实施例说明酶活分析及AA-2G的合成及检测。
1）酶活测定方法：
甲基橙法测定α-环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液（pH6.5）配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmol α-环糊精所需酶量。
淀粉水解活力测定方法：将适量的酶液加入到含2%可溶性淀粉的50mM磷酸缓冲液中（pH 6.5），50℃反应10min，然后用DNS法测定还原糖浓度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmol还原糖所需酶量。
AA-2G的合成及检测方法：将适量酶液加入含有麦芽糊精和L-AA（终浓度为5%）的醋酸-醋酸钠缓冲液中（pH5.5），于避光避氧条件下37℃反应24h，然后加入10U/mL糖化酶在65℃，pH5.5条件下反应24h，通过HPLC方法检测AA-2G产量。
HPLC检测AA-2G产量方法：酶反应样品通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测。检测波长：238nm；流动相：0.05M KH2PO4/H3PO4(pH 2.0)；流速：0.6mL/min。在此条件下，在大约10min时会出现AA-2G的流出峰。AA-2G浓度通过峰面积计算而得。
2）测定结果
环糊精葡萄糖基转移酶的四种突变体酶：K47L，Y89F，N94P及D196Y，它们相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G时，产量分别提高30.7%，10.9%，10.0%及31.7%。
环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase)的六种双突变体酶K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y及N94P/D196Y，相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量分别提高了42.6%，11.0%，37.6%，43.6%，43.6%及41.6%。
环糊精葡萄糖基转移酶的四种三点突变体酶K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y，相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量分别提高了44.5%，50.5%，20.8%及35.6%。
环糊精葡萄糖基转移酶的四点突变体酶K47L/Y89F/N94P/D196Y，相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量提高了64.4%。
3）酶活比较：实验结果见下表，将上述突变体表达获得的突变体纯酶制品与野生菌纯酶制品相比，可以发现：
突变体酶K47L，Y89F，N94P，D196Y,K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y和K47L/Y89F/N94P/D196Y的α-环化活力均降低了一半左右甚至更低，其中突变体酶Y89F的α-环化活力仅为野生菌纯酶的4.2%；
突变体酶K47L/Y89F和Y89F/N94P的淀粉水解活力分别略微降低了16.3%和4.1%；K47L，Y89F，N94P，D196Y,K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y和K47L/Y89F/N94P/D196Y的淀粉水解活力分别提高了：2.22，1.12，1.04，1.41，1.86，1.20，1.33，1.74，1.65，1.45，1.49，1.16和1.45倍；
突变体酶K47L，Y89F，N94P，D196Y，K47L/Y89F，K47L/N94P，K47L/D196Y，Y89F/N94P，Y89F/D196Y，N94P/D196Y，K47L/Y89F/N94P，K47L/Y89F/D196Y，K47L/N94P/D196Y，Y89F/N94P/D196Y和K47L/Y89F/N94P/D196Y以麦芽糊精为糖基供体生成AA-2G产量分别提高了：30.7%，10.9%，10.0%，31.7%，42.6%，11.0%，37.6%，43.6%，43.6%，41.6%，44.5%，50.5%，20.8%，35.6%和64.4%。
3）不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶以麦芽糊精为糖基供体生成AA-2G产量的比较：结果列于图1、图2和图3，可以发现，野生型CGTase和15种突变型酶均在反应24h时AA-2G达到最高产量。
Claims (8)
1.一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于在GenbankAF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因基础上，第89位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第94位的天冬酰胺突变为脯氨酸、第196位的天冬氨酸突变为酪氨酸或将其组合；以及将获得的突变的第47位赖氨酸进一步突变为亮氨酸。
2.权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于所述环糊精糖基转移酶为第47位赖氨酸突变为亮氨酸，第89位酪氨酸突变为苯丙氨酸及第94位天冬酰胺突变为脯氨酸的突变体。
3.权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于所述环糊精糖基转移酶为第47位赖氨酸突变为亮氨酸、第89位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第94位的天冬酰胺突变为脯氨酸及第196位的天冬氨酸突变为酪氨酸的突变体。
4.产权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌。
5.产权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶的转基因细胞系。
6.权利要求4所述产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2)将步骤1)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达载体为pET-20b(+)。
8.应用权利要求4所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
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| Improving maltodextrin specificity for enzymatic synthesis of 2-O-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid by site-saturation engineering of subsite-3 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans;Long Liu et al.;《Journal of Biotechnology》;20130515;pp 198-205 * |
| Site-saturation engineering of lysine 47 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans to enhance substrate specificity towards maltodextrin for enzymatic synthesis of 2-O-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid (AA-2G);Ruizhi Han et al.;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20121106;pp 5851-5860，尤其是摘要，及第5852页右栏最后一段，第5853页左栏第1-3段，第5854页右栏第3段 * |
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