CN103224949B - 一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法。具体是将普鲁兰酶表达元件以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产普鲁兰酶。本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统表达生产普鲁兰酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法。
背景技术
普鲁兰酶（Pullulanase,EC3.2.1.41）可专一性地水解多糖的α-1,6-糖苷键，使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，在淀粉加工工业中有着重要的用途。与α-淀粉酶、糖化酶配合使用生产医用葡萄糖时，可将淀粉彻底降解为葡萄糖，并可使葡萄糖的结晶明显加快，提高设备利用率。与β-淀粉酶配合使用，几乎可以将淀粉100%地转化成麦芽糖，从而得到0.8g/ml以上的超高麦芽糖浆；在啤酒生产中添加普鲁兰酶可提高糖的利用率，缩短糖化时间。
目前，我国工业上所用的普鲁兰酶主要是从丹麦诺维信公司进口，商品名为promozyme，是应用最广、产量最大的普鲁兰酶，占领了中国乃至世界上的大部分市场份额。promozyme由基因重组的地衣芽孢杆菌生产，基因来源为嗜酸普鲁兰芽孢杆菌，发酵产酶水平约100-400U/ml。该菌株所产的普鲁兰酶受温度影响较大，在60℃酶活最大，45℃和65℃时活力为60℃的二分之一，30℃时相对酶活仅为20%，而70℃相对酶活已经小于10%。此酶对pH的适应范围也较耐热产硫梭菌所产的普鲁兰酶窄，最适pH为5.0，pH为4.0和6.0时相对酶活降至50%以下。而长野芽孢杆菌中的普鲁兰酶在60℃时测得最适pH为5.0，在pH4.5条件测得最适温度为62.5℃；此酶热稳定性较好，在pH4.5、60℃与淀粉水解物共同保存232h仍有50％的残余酶活，而来源于嗜酸普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶同样条件下保存121个小时就损失50%的活力。1999年Teague W．Martin等人克隆长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因，并在原核生物表达系统枯草芽孢杆菌中利用质粒重组表达，发酵113h后最高酶活可达813U/ml，产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性。
来源于嗜热菌的普鲁兰酶也是一个研究热点。这类普鲁兰酶有较好的耐热性能，可以拓宽此酶在淀粉水解领域的应用范围。例如来源于粘液硫还原球菌（Desulfurococcus mucosus）的普鲁兰酶的最适温度为85℃，在80℃酶活可以在四个小时内基本保持不变，在85℃的酶活半衰期为50分钟。2000年Fiona Duffner等人克隆了粘液硫还原球菌普鲁兰酶基因，并在枯草芽孢杆菌表达系统中利用质粒重组表达。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）不产内毒素，无致病能力，是一种食品级的安全微生物。同时，由于它具有高效的蛋白表达和分泌能力，已被广泛应用于酶制剂等生物制品的生产。外源蛋白的表达通常通过质粒或整合两种方式实现，其中整合表达具有稳定性好，生产过程无需使用抗生素等优点，是酶制剂产业化的重点研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法。利用整合质粒将普鲁兰酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到普鲁兰酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，菌株染色体中包含外源普鲁兰酶表达元件；
所述的外源普鲁兰酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和普鲁兰酶基因；
所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重叠启动子P43，或来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）甘油三磷酸脱氢酶基因glpD的启动子；
所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；
所述的海藻糖合成酶基因为来源于长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因，或来源于粘液硫还原球菌（Desulfurococcus mucosus）的普鲁兰酶基因。
上述的重组枯草芽孢杆菌菌株的方法，该方法的步骤为：
将普鲁兰酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌。
上述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒，或pAX01及其衍生质粒；
上述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751,WB600,和WB800。
用此以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株来生产普鲁兰酶的操作步骤如下：
1）一级种的制备：将枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；
2）二级种的制备：将一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右（培养4～5小时）；
3）三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，培养至OD600为0.6左右（培养5～6小时）；
4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，以柠檬酸、NaOH控pH6～8,培养约26小时,10000g离心力离心除菌,用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。
本发明首次将普鲁兰酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，常规的生产工艺，发酵生产普鲁兰酶。
本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统生产普鲁兰酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和高效表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
具体实施方式
避免表达系统中质粒不稳定的最有效途径是使用枯草芽孢杆菌整合质粒，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中，外源基因随染色体的复制而复制和表达，这样外源基因在宿主中可保持较好的稳定性。本发明用到的整合质粒pMLK83和pAX01购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC,http://www.bgsc.org)。pMLK83质粒有两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源的DNA序列（同源臂），在这两段同源臂中有新霉素抗性基因；pAX01质粒有两段与枯草芽孢杆菌β-半乳糖苷酶基因同源的DNA序列（同源臂），在这两段同源臂中有红霉素抗性基因。另外这两种质粒有大肠杆菌复制子而无枯草芽孢杆菌复制子，因此能在大肠杆菌中复制而不能在枯草芽孢杆菌中复制。质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过新霉素或红霉素抗性选择，只有整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌才能生长，这样就筛选出重组子。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。
实施例1
本实例将包含来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重叠启动子P43启动子，来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来源于长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因单顺反子的普鲁兰酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83。
1.构建重组质粒pMLK83-P43
根据Genbank中注释的启动子P43序列，设计上游引物为5’attgctggacgcttatggac3’和下游引物为5’cgggatccattcctctcttacctataat3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(枯草芽孢杆菌1A751总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTAR Buffer20ul，10pmol/ul dNTP2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HSDNA聚合酶1ul，添加ddH2O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43。
2.构建重组质粒pMLK83-P43-bnPul
人工合成如下DNA片断：
1 GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT
51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGAT GGGAACACCA
101 CAAACATCGT AGTCCATTAT TTTCGTCCTA GTGGGGATTA TACGGATTGG
151 AATCTTTGGA TGTGGCCGGA GAACGGTGAT GGGGCTGAGT ATGATTTTAA
201 TCAACCGACT GATTCTTATG GGGAGGTTGC AAGTGTGGAC ATTCCTGGAA
251 ACCCAAGTCA AGTAGGGATT ATTGTCCGTA AAGGAAATTG GGATGCGAAA
301 GACATTGATA GTGACCGCTA CATCGATTTA AGCAAAGGGC ATGAGATTTG
351 GCTCGTCCAA GGAAACAGCC AGATTTTCTA TAGTGAAAAG GATGCTGAGG
401 CAGCCGCACA ACCTGCTGTA AGTAACGCTT ATTTAGATGC TTCCAACCAA
451 GTGTTGGTCA AGCTTAGCCA GCCGTTTACT CTTGGTGAAG GTTCAAGCGG
501 TTTTACGGTT CATGATGACA CAGCAAATAA GGATATTCCA GTTACATCTG
551 TTAGTGATGC CAATCAGGTA ACGGCTGTTT TAGCAGGTAC TTTCCAGCAT
601 ATTTTTGGGG GGAGTGATTG GGCACCGGAT AATCACAATA CTTTACTAAA
651 AAAGGTGAAT AGCAATCTCT ATCAATTTTC AGGAAATCTT CCTGAAGGAA
701 ACTACCAATA TAAAGTGGCT TTAAATGATA GCTGGAATAA TCCGAGCTAC
751 CCATCTGATA ACATTAATTT GACAGTGCCA GCTGGTGGTG CCCATGTTAC
801 ATTTTCTTAT ATACCATCCA CCCATGCTGT TTATGACACG ATTAACAATC
851 CTAATGCGGA TTTACAAGTA GATAGCAGCG GTGTTAAGAC GGATCTCGTG
901 GCGGTTACTC TTGGAGAAAA TCCTGATGTA AGCCATACCC TGTCCATTCA
951 AACAGAGGAC TATCAGGCAG GACAGGTCAT ACCTCGTAAG GTGCTTGATT
1001 CATCCCAGTA CTACTATTCC GGAGATGATC TCGGGAATAC CTATACAAAG
1051 AATGCAACTA CCTTTAAGGT CTGGGCGCCT ACATCCACTC AAGTAAATGT
1101 CCTTCTTTAT AATAGTGCAA CCGGCGCGGT AACTAAAACG GTTCCAATGA
1151 CCGCATCAGG CCATGGTGTA TGGGAAGCAA CAGTCAACCA AGACCTTGAA
1201 AATTGGTATT ACATGTATGA GGTAACAGGA CAAGGCTCAA CCCGAACGGC
1251 TGTTGATCCG TATGCAACAG CTATTGCACC AAACGGAACG AGAGGCATGA
1301 TTGTGGACCT AGCCAAAACA GACCCGGCCG GATGGGAGAG TGACAAACAT
1351 ATTACGCCAA AGAATATAGA AGATGAAGTC ATCTATGAAA TGGATGTTCG
1401 TGACTTTTCC ATCGACTCTA ATTCGGGTAT GAAAAATAAA GGAAAGTATT
1451 TGGCACTTAC AGAAAAAGGA ACTAAAGGCC CTGACAATGT AAAGACAGGG
1501 GTAGATTCCT TAAAACAACT TGGGATTACT CATGTTCAGC TTCAGCCTGT
1551 TTTCGCATTT AATAGTGTCA ATGAAAACGA TCCAACTCAA TATAATTGGG
1601 GTTATGACCC TCGCAACTAC AATGTTCCTG AGGGACAATA TGCTACTAAT
1651 GCAAACGGAA CAACTCGGAT TAAAGAGTTT AAGGAAATGG TTCTTTCACT
1701 CCATCAGGAC CACATTGGGG TTAATATGGA TGTTGTTTAT AATCATACCT
1751 TTGCCACGCA AATCTCTGAC TTCGATAAGA TTGTGCCAGA ATATTACTAC
1801 CGCACGGATG ATGCTGGTAA CTACACTAAC GGCTCAGGTA CTGGAAACGA
1851 AATCGCAGCC GAAAGACCAA TGGTTCAAAA ATTTATTATC GATTCACTTA
1901 AGTTTTGGGT CAATGAGTAC CACGTTGACG GTTTCCGTTT TGACTTAATG
1951 GCGTTGCTTG GAAAAGATAC AATGTCTAAA GCTGCCACGC AGCTTCATGC
2001 CATTGATCCA GGAATTGCTC TCTACGGTGA GCCATGGACA GGAGGAACAT
2051 CCGCGCTGCC AGCCGATCAG CTTTTAACAA AAGGAGCTCA AAAAGGCATG
2101GGAGTGGCTG TATTTAATGA CAATCTGCGA AACGGTTTGG ACGGCAGTGT
2151CTTTGATTCA TCTGCTCAAG GTTTTGCGAC AGGTGCTACT GGTTTAACGG
2201ATGCTATTAA AAATGGAGTT GAAGGAAGTA TTAATGACTT CACCGCTTCA
2251CCAGGCGAGA CGATCAACTA TGTCACAAGT CATGATAACT ATACCCTTTG
2301GGACAAGATT GCCCAAAGCA ATCCAAACGA TTCTGAAGCG GATCGAATTA
2351AAATGGATGA GCTCGCTCAA GCGATCGTCA TGACCTCACA AGGCATTCCT
2401TTCATGCAGG GCGGGGAAGA AATGCTTCGT ACGAAAGGCG GCAACGACAA
2451TAGCTATAAT GCTGGTGATG TAGTGAACGA GTTTGATTGG AGCAGAAAAG
2501CTCAATATCC AGATGTTTTC AATTATTATA GCGGGCTGAT TCATCTTCGT
2551CTTGATCACC CAGCCTTCCG CATGACGACA GCTAATGAAA TCAATAGCCA
2601CCTCCAATTC CTAAATAGCC CAGAGAACAC AGTGGCCTAT GAATTATCTG
2651ATCATGCAAA TAAAGATACA TGGGGTAATA TTGTGGTTAT TTATAATCCA
2701AATAAAACGG CAGAAACCAT TAATTTGCCA AGCGGGAAAT GGGAAATCAA
2751TGCGACGAGC GGTAAGGTGG GAGAATCCAC ACTTGGTCAA GCAGAGGGCA
2801GTGTTCAAGT TCCAGGCATA TCTATGATGA TTCTTCATCA AGAAGTAAGC
2851CCATCTGATG GTAAATGACC GCGG
将合成的DNA片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Sac II进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-p43-bnPul.
实施例2
本实例将包含来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）甘油三磷酸脱氢酶基因glpD的启动子，来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断和来源于粘液硫还原球菌（Desulfurococcus mucosus）的普鲁兰酶基因单顺反子的普鲁兰酶表达元件克隆到整合质粒pAX01。
人工合成如下DNA片断：
1CTCGAGCTTT TAAATAAAGT AATACTATGG TATAATGGTT ACAAGTTAAT
51TTTCTATTTA CCGTGACAAC AAGGAGGAAA CGTAATGATT GGAGCTTTTA
101AAAGGTTGGG TCAAAAATTG TTTTTGACAT TGTTAACGGC ATCATTAATT
151TTTGCATCTT CTATAGTAAC TGCTAATGCA GCGAGCATCA TGGAGATATA
201TGTCGCCGAT GACCAGGTCA CCGTGGTACA CAACCCCCTA GATCCAGCAT
251ACCTTTCAGC AGCCGACGGC TATTTGATCC CGAGGATAAG GGTGGCCAGC
301AGCCTGGATG TTGCCTCTGG GACGCTGGTA GCTGATAAAG GAGAGTACCA
351GTTGAAACCC CAGTTGGCGA CGAACACGTG GAGAGTATAC TATGCCACAA
401TACCCATTGG TGAGGCATCC AGGGGTTTAA ACTACTATTT CAAGCTCACC
451CTGCGGAACA ACACTGTGGT GTACGTGTAT AATGCGACGG CGAGCAGGCT
501ATTCAACTTC AATGGGTCAA TAGTTTTCAG GCAGGTGGAG TGGGTTAAGA
551GCCGGGTTGG CTACCAGATA TTCCCCGATA GATTCTACAA TGGTGATCCA
601AGCAACGATT TAAAGGCCAA CCTAACGGAT GAGCTATGGA TAAACGAGGT
651TTCAAGGGGC GTACCCGTAT TCACTAGGTG GGATGGCCCT GTAACATCGC
701TACATTGCTG CCACCAGTAT TTCGGCGGCG ACCTGAAGGG GGTCACAGAG
751AAGCTCGACT ACCTCAAGGA GCTCGGTGTT GGGCTAATAT ATCTGAACCC
801TATATTCCTC TCCGGCAGCG TACACGGCTA CGACACTTAC GACTACTATA
851CTGTGGACCC GAAGTTCGGG ACCCTGGAAG ACCTTAAAAC CCTCATCAAC
901GAGGCGCATA AACGGGGCAT TAAAGTGATA TTCGACTTCG TCCCAGACCA
951CGTGGGGCTT GGATTCTGGG CTTTCCAAGA CGTTTACAGG AACGGAAGGA
1001ACAGCACGTA CTGGAGCTGG TTCATAGTGT ATAAGTGGAG GTTCAAGCTC
1051GGGGACCCCA CCGCGTATAA GTGCTGGTGG GGGATAGGGA GCCTCCCGCA
1101GCTGAATGTT CTGAACACTG AGGTTAGACA GTACCTGATC AATGTAGCCC
1151TATACTGGTT AAGCATCGGC TTCGATGGGT TGAGGATTGA TACTCCGCTA
1201GACGTCATCG ACTCGGAGAG CTTCTTCAGG GAGCTACGTG AAGCAGTCAA
1251GTCGAGGTAT CCCGACGCAT ACATTGTTGG AGAGATATGG GATTACCGTC
1301CCGAATGGCT AAGGGGCAAT GCATTCGACT CCCTTATGAA CTACTATTTA
1351GGCAGGAACA TACTCCTCAG CTATGCACGT GGAGCCCTGA ACGGTTACAC
1401CGCCTCAATG AAGCTTGCTG AATACTATGC CGGTATAGGT GTGAACGTGG
1451CTGGAATGGG TTTCAACATT ATTGGGTCCC ATGACACCTC CAGGGTTCTC
1501ACGGATCTCG GCGGGGGAGG ATTGAACAGC ACCCCGAGCA ATGAGTCCAT
1551AGCCCGCTTA AAACTGCTTT CAACGCTACA GTATACTCAG CCCGGTATGC
1601CAGTAGTGTT CCAGGGCGAT GAAAGAGGGA TCACTGGTAG ACAGGGAAAC
1651CATGATGAGC AGAGATACCC TATTCAATGG GATAGGTTAA ATGTAGAGGT
1701CTACGAGCAC TATAAGAGGC TGGGAGAACT CAAGAACACT ATTCCAGCAT
1751TGTCAACCAG TATAATACAT GTGCTGGGTG GATCAGGCGG CTTGCTTGCC
1801TATACTAGGG GGTATATGGA TGAAGTACTC GTCATCGCCA ATAATGATGC
1851ATCCACACCG CAATCATACG AGCTGCCCCC GGGCAACTGG ACCCTGATAT
1901ATGCTAGCAA TAACTGGAGC GAGGTCTCCG TCGAGCACAA TACGGTTACA
1951GTGCCGCCTT TGACAGCCCT GATACTTGTC AGGAACACTG TGTCCGAGAC
2001CACTACTACA TCGACAGCTG TGACCAGCTT CCCCGGCACC ATGTACACGG
2051AAACCACCGC TATTCCAGGC CGACTGGAGC AGGACACCAG AGTGCTGATT
2101ATCGTAGTAG CCGTGCCGCT GCTCCTTGCG ACACTAGTAT TGCTCCGCAG
2151GCATAGGGCT TAAGGATCC
将合成的DNA片段和质粒pAX01用限制性内切酶Xho I和BamH I进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pAX01-glp-dmPul.
实施例3
整合型质粒pMLK83-p43-bnPul在枯草芽孢杆菌中的转化
取一满环枯草芽孢杆菌1A751甘油菌划LB平板（LB培养基：蛋白胨1%,酵母膏0.5%,NaCl1%,平板加1.5%Agar），37℃培养箱培养过夜。转化前一天晚间挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，第二天上午取160μl培养液转接至8ml SPI培养基中（SPI培养基：SP盐加1%体积浓度为50%（W/V）葡萄糖溶液，1%体积100×CAYE溶液；SP盐溶液：含1.96g/L(NH2)2SO4，13.72g/L K2HPO4，5.88g/L KH2PO4，0.196g/L MgSO4.7H2O（单独灭菌）和0.98g/L柠檬酸钠；100×CAYE溶液:含20g/L酪蛋白氨基酸和100g/L酵母抽提物），37℃，250rpm培养至对数生长末期(约4～5小时)；取0.2ml生长至对数末期的培养液至2ml SPII培养基中（SPII培养基：SPI培养基加入1%体积50mmol/L CaCl2溶液，1%体积250mmol/L MgCl2溶液），37℃，100rpm培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入20ul10mmol/L EGTA，再于37℃，100rpm培养10分钟；将上述处理后的菌液分装成0.5ml每管，加入5ulpMLK83-p43-bnPul质粒（50ng/ul），再于37℃，250rpm培养90分钟，取菌液涂布新霉素（20ug/ml）LB平板，筛选淀粉酶缺失转化子即是枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751[p43-bnPul]。
用同样方法将pMLK83-p43-bnPul质粒转化枯草芽孢杆菌WB600和WB800，可得WB600[p43-bnPul]，WB800[p43-bnPul]。
用类似方法将pAX01-glp-dmPul质粒转化枯草芽孢杆菌1A751可得1A751[glp-dmPul]（加入质粒转化后，红霉素（1ug/ml)LB平板取代新霉素LB平板用于菌液涂布）。
实施例4
普鲁兰酶的生产，操作步骤如下：
1）一级种的制备：将上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种。
2）二级种的制备：一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右（约4～5小时）。
3）三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，培养至OD600为0.6左右（约5～6小时）。
4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，以柠檬酸、NaOH控pH6～8,培养约26小时,10000g离心力离心除菌,用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。
普鲁兰酶酶活的测定按如下方法进行。
取10mL具塞试管8支，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL葡萄糖标准溶液(称取0.100g试剂级葡萄糖，溶于蒸馏水，定容至100mL)，然后向各管加蒸馏水使溶液达1.0mL，再各加1.0mL DNS试剂(甲液：称取6.9g结晶酚溶于15.2mL10%的NaOH溶液，用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g亚硫酸氢钠;乙液：称取255g酒石酸钾钠溶于300mL10%的NaOH溶液，再加入880mL1%的3,5-二硝基水杨酸溶液;甲液和乙液混合得黄色试剂贮于棕色瓶内，室温下避光放置7天后作标准曲线（每次配制后要重新作标准曲线）)，摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，流动水冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，混匀，用分光光度计在540nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量(μmol)为横坐标，绘制标准曲线，计算出标准曲线的斜率h。
用移液管吸取9mL1％普鲁兰糖溶液(称取1.0g试剂级普鲁兰糖，加入0.02M醋酸盐缓冲液（pH5.0），搅拌至溶解，定容至100mL（现配现用）)到25mL具塞试管，置于60℃±0.5℃(或80℃±0.5℃）恒温水浴锅预热5min后，加入1.0mL样品溶液（用0.02M醋酸盐缓冲液(pH5.0)适当倍数稀释），混匀，置于60℃±0.5℃(或80℃±0.5℃）恒温水浴锅准确反应10min，置于冰水浴2min终止反应，混匀，吸取1.0mL溶液至10mL具塞试管，加入1.0mL DNS试剂，摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，流动水冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，混匀，以空白对照调零，用分光光度计在540nm波长下进行比色，记录吸光度。空白对照由灭活后的样品溶液代替样品溶液。
来源于长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶活力单位（U）定义为1ml酶液在60℃，pH5.0条件下，1分钟水解1％普鲁兰生成1μmol还原糖，即为1个酶活力单位，以U/ml表示。
来源于粘液硫还原球菌（Desulfurococcus mucosus）的普鲁兰酶活力单位（U）定义为1ml酶液在80℃，pH5.0条件下，1分钟水解1％普鲁兰生成1μmol还原糖，即为1个酶活力单位，以U/ml表示。
普鲁兰酶酶活力（U/mL）=E×n×10/(10×h)=E×n/h
式中：E为样品溶液的吸光度；分母的10为10min换算为1分钟的倍数；n为样品溶液反应前的稀释倍数；分子10为1mL反应液换算成10mL反应液的倍数；h为标准曲线的斜率。
经测定，发酵原液离心后，各枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵表达的最高酶活见表1。
表1
| 菌株 | 总酶活(U) | 胞外酶活(U) |
| 1A751[p43-bnPul] | 645 | 532 |
| WB600[p43-bnPul] | 1085 | 923 |
| WB800[p43-bnPul] | 1126 | 980 |
| 1A751[glp-dmPul] | 531 | 487 |
Claims (2)
1.一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：
将普鲁兰酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；
所述普鲁兰酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和普鲁兰酶基因；
所述重组质粒为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43启动子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因单顺反子构成的普鲁兰酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83；或者为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)甘油三磷酸脱氢酶基因glpD的启动子，来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断和来源于粘液硫还原球菌(Desulfurococcusmucosus)的普鲁兰酶基因单顺反子构成的普鲁兰酶表达元件克隆到整合质粒pAX01；
所述宿主枯草芽孢杆菌是WB600或WB800。
2.根据权利要求1所述的一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，用其来生产普鲁兰酶的操作步骤如下：
1)一级种的制备：将权利要求1所述的菌株单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；
2)二级种的制备：将一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6，培养4～5小时；
3)三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至OD600为0.6，培养5～6小时；
4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、NaOH控pH6～8,培养26小时,10000g离心力离心除菌,用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。
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