CN102061295A - 透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法，所述表达盒由透明颤菌血红蛋白基因、三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子组成。本发明针对黑曲霉菌株实施分子改造，从分子水平解决限氧条件下黑曲霉菌种溶氧不足的问题，为黑曲霉液体深层发酵产糖化酶降低能耗。

Description

透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法。

背景技术

葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，其氧化反应所释放出的热量是人类生命活动所需能量的重要来源。工业生产中一般使用糖化酶-淀粉酶双酶法生产葡萄糖，糖化酶是淀粉转化为葡萄糖过程的主要酶类之一，属于食品工业生产中常用的一种酶制剂，又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，EC.3.2.1.3.)或淀粉葡萄糖苷酶(Amyloglucosidase)、Y-淀粉酶(Y-amylase)。糖化酶是一种具有外切活性的酶，通过水解淀粉、淀粉糊精、糖原等碳链上的1，4连接的非还原端，而得到终产物-D-葡萄糖。

黑曲霉(Aspergillus niger)是国内外产糖化酶的常用菌种，属于好氧微生物，此类微生物的生长及产物的形成受多种参数的影响，例如培养基、发酵pH值、温度、溶解氧的浓度、真菌的形态等。在黑曲霉代谢过程中，对氧的需求主要是通过通风与搅拌来供给，因供氧过程是一个高能耗的过程，而且氧往往也是制约产物产率水平的一个限制因素，所以提高发酵过程中氧的利用率对发酵工业提高生产水平和节能降耗均有很大意义。只有溶解于培养液中的氧才有可能为其中的微生物细胞所利用，发酵液中的溶氧水平变化取决于发酵罐的供氧能力和微生物的耗氧速率。在好氧发酵中，将溶氧水平控制在临界氧浓度以上，即可避免因供氧不足发生代谢异常，也可避免过度的供氧操作引起的能量消耗和对细胞可能的伤害。因此，要提高氧传递和利用效率，除了必须配置合适的发酵通风设备外，还要充分利用现有设备的供氧能力，同时根据不同的发酵过程合理控制溶氧水平。

透明颤菌血红蛋白是至今唯一在原核生物中发现的血红蛋白，是目前研究的最清楚的一种原核生物蛋白之一。血红蛋白能使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧环境中生长。目前透明颤菌血红蛋白(VHB)基因已被克隆到多种异源好氧微生物体内，促进了微生物发酵过程中同等条件下氧的利用率，尤其在限氧条件下，大大提高了菌体的生长密度、促进有氧代谢、加快生物修复促进基因工程菌蛋白和相关代谢产物。由此可见，异源表达透明颤菌血红蛋白可以提高细胞对溶氧的利用能力，促进细胞生长，提高产物的产量和收率。

目前，尚未见关于利用透明颤菌血红蛋白提高黑曲霉菌种限氧条件下的溶氧能力，进而提高其产糖化酶能力的报道。

发明内容

为解决限氧条件下黑曲霉菌种溶氧不足的问题，本发明的第一个目的在于提供一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒，所述表达盒由透明颤菌血红蛋白基因、三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子组成。

所述三磷酸甘油醛脱氢酶基因为黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因。

所述启动子由1261个碱基组成，如SEQ ID NO.1所示。

所述终止子由329个碱基组成，如SEQ ID NO.2所示。

所述透明颤菌血红蛋白基因由441个碱基组成，如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的在于提供一种含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑曲霉菌。

本发明的第三个目的在于提供一种含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑曲霉菌的制备方法，包括以下步骤：

1)构建透明颤菌血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd；

2)利用Pgpd-vhb-Tgpd表达盒构建质粒pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd；

3)用质粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd和质粒pAN7-1共转化黑曲霉，获得含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的重组黑曲霉菌。

本发明的技术路线为：

1、利用分子生物学方法克隆黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的强启动子和终止子序列；

2、利用上述强启动子和终止子，通过重叠PCR方法，构建透明颤菌血红蛋白基因(vhb)表达盒Pgpd-vhb-Tgpd 和质粒pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd；

3、用质粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd和质粒pAN7-1共转化黑曲霉，获得含有透明颤菌血红蛋白基因(vhb)表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的重组黑曲霉；

4、贫氧条件下，验证重组黑曲霉产糖化酶的能力有所提高。

本发明针对黑曲霉菌株实施分子改造，从分子水平解决限氧条件下黑曲霉菌种溶氧不足的问题，为黑曲霉液体深层发酵产糖化酶降低能耗。

附图说明

图1是黑曲霉GAPDH基因启动子序列电泳检测图，M：250bp marker，1为黑曲霉GAPDH启动子序列；

图2是黑曲霉GAPDH基因终止子序列电泳检测图，M：250bp marker，1为黑曲霉GAPDH终止子序列；

图3是透明颤菌血红蛋白基因电泳检测图，M：250bp marker；1，2为透明颤菌血红蛋白基因序列；

图4是overlap PCR连接GAPDH的启动子序列及vhb序列电泳检测图，M：250bp marker；1为GAPDH的启动子序列及vhb序列连接后片段；

图5是重叠延伸PCR构建vhb表达盒(Pgpd-vhb-Tgpd)，M：250bp marker；1为表达盒Pgpd-vhb-Tgpd；

图6是含vhb基因阳性转化子电泳检测图，M：250bp marker；1，2，3，4，5，9为阳性转化子

图7是重组菌与对照菌的SDS-PAGE电泳检测图，M：蛋白质marker；0为对照菌；1为阳性重组菌；2为阴性重组菌；

图8是质粒pPICZαA-vhb构建流程图；

图9是质粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd构建流程图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

实施例1透明颤菌血红蛋白基因(vhb)表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的构建

(一)菌种、质粒及培养基

黑曲霉(Aspergillus niger)购于中国工业微生物菌种保藏中心，CICC编号40125；含vhb基因的质粒pPICZαA-vhb，其构建流程参见图8。质粒pPICZαA购自Invitrogen公司。

黑曲霉的培养：

固体复苏采用PDA培养基，培养温度28℃；液体扩增培养采用YPD或玉米浆粉培养基(玉米浆粉1％，麦芽糊精12％，硫酸铵2％。)，培养温度为28℃，转速为200rpm。

黑曲霉发酵产糖化酶培养基配方：玉米淀粉8％，药媒4.3％，麦麸1％。其中玉米淀粉在配制的过程中需要经高温α-淀粉酶液化。

(二)vhb基因、启动子和终止子的克隆

根据NCBI公布的黑曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶基因序列，找到三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列(1261bp)和终止子序列(329bp)。分别设计三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列的上下游引物Pgpd1、Pgpd2和终止子序列上下游引物Tgpd1、Tgpd2，以黑曲霉HE01基因组DNA为模板，以Pgpd1、Pgpd2引物扩增的三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列；以Tgpd1、Tgpd2引物扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子序列。取上述5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图1和图2。用TaKaRa Agarose Gel DNA Pufification Kit回收PCR产物。连接TaKaRa公司的pMD19-T simple vector，转入大肠杆菌E.coliTop10F′，通过验证获得阳性克隆，并送至Invitrogen公司测序验证，对比分析测序结果，对含有启动子和终止子序列的质粒分别命名pMD19-T-Pgpd和pMD19-T-Tgpd，。

提取质粒pPICZα-vhb作为PCR扩增vhb的模板，根据GeneBank中vhb基因的核苷酸序列设计引物vhbB 1、vhbB2，扩增vhb基因序列，取上述5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图3。

(三)Pgpd-vhb-Tgpd表达盒的构建

1.以pMD19-T-Pgpd为模板，gpdA1和gpdA2为上、下游引物，采用TaKaRaPrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase进行扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收1261bp大小的片段，命名为Pgpd，取上述5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图4。

2.以pMD 19-T-Tgpd为模板，gpdC1和gpdC2为上、下游引物，采用TaKaRaPrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase进行扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子序列。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收329bp大小的片段，命名为Tgpd，取上述5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图4。

3.以Pgpd、vhb为模板，gpdA1和vhbB2为上、下游引物，采用TaKaRaPrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase进行overlap PCR扩增便可将三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列和vhb拼接起来。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收约1702bp大小的片段，命名为Pgpd-vhb。

4.以Pgpd-vhb、Tgpd为模板，gpdA1和gpdC2为上、下游引物，采用TaKaRaEx TaqTM进行overlap PCR扩增便可将三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列、vhb及三磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子序列拼接起来。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收约2031bp大小的片段，命名为Pgpd-vhb-Tgpd，取上述5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图5。

5.上述回收产物连接TaKaRa公司的pMD19T质粒simple vector，转入大肠杆菌E.coli Top10F′，通过验证获得阳性克隆，命名为pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd，构建流程参见图9，并送去Invitrogen公司测序，比对分析测序结果。

本实施例所用引物序列见表1.

表1序列扩增及表达盒构建中所需的引物

实施例2制备含有Pgpd-vhb-Tgpd表达盒的重组黑曲霉菌

(一)黑曲霉菌原生质体制备

1)吸取1.5mL无菌水从PDA培养平板上新鲜且成熟的黑曲霉孢子，制备成浓度为0.8～1.0×10⁸个/mL的孢子悬浮液，接种于40～50mL的YPD/Mandels液体基础培养基中，28℃，250rpm培养11h左右。

2)取培养11h左右的菌液在光学显微镜下观察，大部分孢子已萌发时，将培养液转入25mL大离心管，8000rpm，离心7min，去上清，用1M MgSO₄10mL洗涤两次，8000rpm，离心10min，去上清。

3)酶解液的制备和酶解反应：准确称取100mg溶壁酶(Sigma)锡纸包裹，酒精灭菌送入超净工作台，加入10mL1M MgSO₄溶解后，用一次性过滤器过滤除菌。将上述菌体沉淀中加入到装有10mL酶解液的三角瓶中，置于28℃，70rpm摇床酶解2～2.5h。

4)将酶解溶液转移至25mL大离心管中，用STC溶液补满，8000rpm，离心20min，去上清，用10mL STC溶液洗涤两次，8000rpm，离心10min，去上清。

5)将沉淀用500～600μLSTC溶液重悬，取少许悬浊液在光学显微镜下计数，并用STC溶液将其稀释到1.0×10⁸个/mL。

(二)质粒pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd和pAN7-1的转化

1)取上述方法(一)制备的原生质体悬浊液200μL，加入10～15μL质粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd(约10μg)和pAN7-1(约10μg)，轻轻混匀。

2)48℃温控板上热激2min，立即加入60％PEG400050 μL，室温静置20min。

3)加入4mL STC溶液吹打混匀，8000rpm离心20min，去上清，加入1mLSTC溶液重悬沉淀。

4)将1mL原生质体悬浊液加到10mL原生质体再生培养基中，28℃，70rpm培养24h。

5)8000rpm，离心15min，去上清，加入再生培养基重悬，取100～200μL涂布到含有潮霉素100μg/mL的PDA培养平板上，28℃培养观察3～5天。待平板上长出菌丝，用灭菌牙签挖取单菌落菌丝，接种到新鲜PDA(hph⁺)培养小平板上，28℃培养7天左右。

质粒pAN7-1购自Biovector Science Lab公司，地址为北京市西直门外大街19号。

(三)阳性转化子的筛选与验证

将筛选平板上长出的潮霉素抗性转化子分别转接到含100μg/mL潮霉素B的小PDA平板上进行进一步筛选培养；一周后用无菌水刮洗各转化子的菌丝并分别接种于含100μg/mL潮霉素B的液体培养基中，28℃，250rpm培养3-4天，用65％甘油保种；提取各转化子的基因组DNA作为模板，用vhb引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，取上述5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图6，有符合预期大小的转化子即为阳性转化子。

由于VHB为胞内蛋白，将上述阳性转化子离心收集菌体，经液氮破壁后，用缓冲液PBS抽提获得VHB粗蛋白，SDS-PAGE分析按照分子生物学实验指南进行(Sam-brook et al.，1989)。所使用的凝胶浓度15％，上样量为25μL(20μL培养液加5μL载样液)，电泳检测结果见图7。在16kd左右有蛋白条带的为vhb基因正确表达的重组菌株。

实施例3重组黑曲霉产糖化酶能力的验证

(一)发酵

分别对实施例2得到的重组黑曲霉菌与原始对照菌株黑曲霉HE01进行发酵，通过测定在正常条件下及贫氧条件下重组菌和原始对照菌的糖化酶酶活力，以检测VHB在贫氧条件下对重组菌产糖化酶酶活力的影响。

通过调节摇床的转速来控制贫氧条件，具体实验方法如下：

菌种种子培养阶段：将甘油保种的重组菌及对照原始菌种分别接入黑曲霉种子培养基中活化3-4天左右，28-30℃，200r/min。待菌种生长旺盛，再重新接入种子培养基，进行二次活化，生长约3天左右，各个菌种生长一致，有大量菌丝体，便可以6％的接种量(25mL/250mL：发酵培养基/三角瓶容量)接入发酵培养基中进行发酵培养。

菌种发酵培养阶段：将上述接入到发酵培养基中的重组菌种和原始菌种(每个样分别转接三瓶)分别放入100rpm、150rpm及200rpm 3个不同转速的摇床中，28℃发酵培养，5天左右达到产酶高峰，开始测定糖化酶酶活。

(二)糖化酶活性测定

标准曲线绘制：准确称取1克葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至500毫升容量瓶中，分别按顺序在试管中加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8毫升葡萄糖溶液，和1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2毫升蒸馏水。塞上塞子，沸水浴10分钟，冷却后，加入蒸馏水，摇匀，于550nm比色测定。

酶活力测定：定义：在40℃，pH4.6条件下，每小时水解淀粉产生1毫克葡萄糖作为一个酶活力单位(1个酶活力单位用1U表示)。方法：称取酶液2.00ml定容至100ml摇匀，供测定用。于甲、乙两支25ml比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液5.0ml及缓冲液1.00ml摇匀后，于40±0.2℃恒温水浴中预热5min。在甲管(样品)中加入待测酶液0.4ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各加200g/L氢氧化钠溶液0.04ml，将两管取出迅速冷却，并于乙管(空白)中补加待测酶液0.4ml。准确反应30分钟，取0.2毫升反应液于有3毫升DNS(3，5-二硝基水杨酸)的试管中，沸水浴10分钟，冷却后加入蒸馏水，摇匀，550nm测定吸光值。糖化酶活力计算公式如下：

糖化酶活力＝A×K×N×2×6.44÷(M×0.4)

A：为样品OD平均值；K：为比色常数；

N：为稀释倍数；M：酶液质量

6.44：反应液体积；

2：为将30min的反应时间换算成一个小时；

0.4：稀释酶液体积。

不同转速下发酵不同时间黑曲霉糖化酶活力测定结果见表2。

表2出发菌与重组菌正常及限氧条件下糖化酶酶活测定

从表2可以看出，正常转速和低转速(限氧条件下)相比，重组菌中的vhb基因在限氧条件下被诱导表达，增加了菌株氧利用率，得到较高酶活的糖化酶。

Claims (7)

1.一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于：所述表达盒由透明颤菌血红蛋白基因、三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子组成。

2.根据权利要求1所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于：所述三磷酸甘油醛脱氢酶基因为黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因。

3.根据权利要求1或2所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于：所述启动子由1261个碱基组成，如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于：所述终止子由329个碱基组成，如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于：所述透明颤菌血红蛋白基因由441个碱基组成，如SEQ ID NO.3所示。

6.一种含有权利要求1-5任意一项所述透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑曲霉菌。

7.含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑曲霉菌的制备方法，包括以下步骤：

1)构建透明颤菌血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd；

2)利用Pgpd-vhb-Tgpd表达盒构建质粒pMD19-T-Pgpd-vhb-Tgpd；

3)用质粒pMD19-T-Pgpd-vhb-Tgpd和质粒pAN7-1共转化黑曲霉，获得含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的重组黑曲霉菌。

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